方法文章

对于耐药性突变对激酶抑制剂的筛选和验证方法

DOI：

10.3791/51984

⸱

2014年12月7日

 ,  ,  , 
1Divisions of Experimental Hematology and Cancer Pathology, Cancer Blood Disease Institute, Cincinnati Children's Hospital Medical Center

本文内容

摘要

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针对激酶抑制剂治疗遗传性的出现带来了有效的癌症治疗显著的挑战。对新开发的药物鉴定和耐药突变特性有助于更好的临床管理和下一代药物设计。在这里，我们描述了体外筛选及耐药突变的验证协议。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

BCR / ABL的发现作为驱动基因在慢性骨髓性白血病（CML）导致了伊马替尼，其中，实际上，证明有效地治疗慢性粒细胞白血病患者靶向激酶在癌症的潜力的发展。这一观察革命性的药物开发目标牵连其他各种恶性肿瘤，如，表皮生长因子受体，B-RAF，KIT和PDGFRs致癌激酶。然而，抗激酶疗法的一个主要的缺点是耐药突变渲染目标的出现，已经减弱或消失亲和性的药物。了解了耐药变异不仅有助于开发下一代抑制剂也采用个性化医疗带动了临床管理使用的机制。我们报道了逆转录病毒载体基于筛选策略来识别抗性赋予在BCR / ABL，突变这在开发下一代BCR / ABL抑制剂帮助的频谱。使用Ruxoli替尼和JAK2作为药物靶标对，在这里我们将介绍在利用表达JAK2激酶的随机突变库鼠标BAF3细胞的体外筛选方法。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

蛋白激酶是细胞内的信号转导通路的调节似乎每个细胞功能调控的关键酶。激酶介导的信号的适当控制是至关重要的稳态和发展，这主要是依赖于激酶，磷酸酶及其降解适当调控UPS（泛素蛋白酶体系统）。放松管制的激酶是许多癌症的中心舞台，并牵连到主机人类疾病1。人类基因组编码超过500蛋白激酶已被链接，直接或间接地，以400〜人类疾病2。这些观察结果支持这一概念用于激酶的小分子抑制剂3-5治疗靶向。

ABL的激酶抑制剂，如伊马替尼的论证，慢性粒细胞白血病（CML）的治疗提供了概念证明这种方法6,7。这一观察，不仅彻底改变了蚂蚁的i-激酶疗法而且执行的想法，以确定遗传病变的其他肿瘤疾病的治疗为目标，这导致发现的致癌基因突变的从真性红细胞增多症（PV）和患者的骨髓增生性肿瘤（MPN）的JAK2。这一发现产生的靶向JAK2小分子激酶抑制剂治疗MPNS极大的兴趣。现在，JAK2抑制剂几乎一打的临床试验，其中一人已被批准用于骨髓纤维化的治疗。而致癌激酶在癌症的小分子抑制剂特异性靶向携带有为结果如何，还患有显影抵抗的治疗。实际上，到目前为止，患者大多通过获得突变的激酶域的药物靶向8-10治疗激酶抑制剂，如伊马替尼，吉非替尼，埃罗替尼和达沙替尼抗药性的突变。阻力基因突变的结果凸显了限制Ø˚F靶向单一疗法对抗致癌激酶，并且表示在以往更成功的癌症化学疗法的发展下一个挑战。耐药机理和功能的后果应提供选择和药物开发的免费化合物的设计理念。通过在体外筛选鉴定的突变，都表现出与在患者中发现的相关程度高。因此， 在体外筛选赋予识别的电阻图案，有可能导致临床复发耐药在临床或临床前开发协助一个给定的药物靶标对突变。这些突变体形式的识别是不仅在监测患者对药物的反应和复发，还必需为更健壮的下一代抑制剂的设计有帮助的。例如，下一代BCR / ABL抑制剂，尼罗替尼和Ponatinib的发展，分别因为更大MEC成为可能hanistic理解的突变，结构和功能的研究中获得。

此前，我们曾报道我们的屏幕采用随机突变BCR / ABL的揭示突变赋予抗抑制剂如伊马替尼11,12，PD166326 12和AP24163 13的频 ​​谱的结果。结果不但确定授予临床耐药和疾病复发的基因突变，但也提供了耐药性和管理的激酶功能11,14原理的机械理解。在这里，我们提供额外的方法的细节，使用Ruxolitinib和JAK2作为药物靶标对，使这一筛选策略的更广泛的应用。

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方案

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注意：在这个协议中的所有程序都根据对动物伦理治疗和护理健康准则国家研究所进行的，并且根据批准的IA​​CUC动物使用的协议。

1.细胞的维护

  1. 培养BaF3细胞在RPMI-1640培养基补充有10％胎牛血清和青霉素/链霉素（100单位/ ml和100μg/ ml）和WEHI细胞的废培养基。生长HEK293T细胞在DMEM补充有10％胎牛血清和青霉素/链霉素（100单位/毫升和100微克/毫升）。保持在含有5％CO 2的潮湿气氛中的细胞在37℃。

2.质粒构建

  1. 克隆小鼠JAK2及其致癌亚型JAK2-V617F中的pMSCV-PURO-GW通过LR使用标准重组克隆过程克隆酶。
  2. 对于荧光素酶表达载体（的pMSCV -吕克-樱桃-GW）用于建造在-VI沃成像，使用引物（LUC-SD / RP TTACAATTTGGACTTTCCG和LUC-SD / FP-CACCATGGAAGACGCCAAAAAC），随后用克隆在载体pENTR-SD-TOPO生成载体pENTR-吕克，其用于通过PCR扩增来自pLVX-TET-ON载体的萤光素酶通过使用LR克隆酶介导的重组克隆转移荧光素酶基因的逆转录病毒载体，的pMSCV樱桃-GW。

3.准备随机突变库，筛选和鉴定的突变

3.1）随机突变

  1. 克隆全长的JAK2野生型和V617F突变成的pMSCV-PURO-GW逆转录病毒载体使用市售的重组克隆技术。
  2. 使用1 JAK2-V617F质粒DNA微克改造，XL-1红，E.大肠杆菌细胞，这是有缺陷的DNA修复机制从而使他们能够在复制期间掺入随机突变。更具体地说，混合50 - 100纳克的DNA（超过100毫微克的DNA降低转化效率）和100微升感受态细胞中预冷的聚丙烯管中，并在冰上孵育30分钟，轻轻摇动，每5分钟。一个良好的库覆盖，使用感受态细胞的四到六管中。
    注：超过100毫微克DNA的降低转化效率
  3. 浸入管在水浴中于42℃45秒的热冲击，并在冰上孵育2分钟。接着，加入1 ml的SOC培养基（2.0％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，0.05％的NaCl，10mM的氯化镁，10mM的硫酸镁和0.4％D-葡萄糖）。孵育所述管在37℃下以225-250转摇动90分钟。
  4. 板细胞上410厘米的LB琼脂平板上含有100微克/毫升氨苄青霉素的每个管中。孵育板16 - 24小时，在37℃下。
  5. 下面可见菌落，通过刮板用无菌板刮板收集它们。池单元从用市售的质粒提取试剂盒各板及分离质粒DNA。
    注：通常菌落较小，并采取18-24小时是可见的，因为这些都是生长缓慢的细菌菌株。在此阶段，评估在库突变通过限制性消化的异质用频繁切割器如Sau3A1或Taq1或测序。

逆转录病毒上清转导和3.2）生产

  1. 前一天的转染，板4×10 6的HEK 293T细胞在含有10％FCS，青霉素/链霉素和2mM L-谷氨酰胺100厘米菜肴的DMEM。
  2. 第二天，更换培养基和转染细胞诱变的pMSCV-JAK2-V617F库。对于每个10cm平板，混合10微克的DNA（5微克质粒文库和5微克逆转录病毒包装质粒，pCLEco）与40微升的FuGENE对使用无血清DMEM培养基加入400μl的总体积。孵育DNA和脂质混合20分钟，在室温下进行。 20分钟后，添加明智的DNA-脂质复合物滴在HEK293T细胞的顶部。
  3. 6小时后，改转染媒体瓦特第i个新鲜培养基并孵育板48小时，在37℃下进行病毒生产。 48小时后培养，收集通过0.45μm的acrodisc的过滤器过滤的病毒上清。

3.3）选择抗性克隆的体外

  1. 对于耐药JAK2-V617F突变体，转导亿BAF3用100ml具有0.5-1×10 6病毒滴度的病毒上清的细胞。更具体地说，混合10 8个细胞用100ml的病毒上清以使用RPMI培养基300毫升的总体积，含有10％血清和polyberene的24微克/毫升（ployberene的终浓度为8微克/毫升）。发布这些细胞搅拌器在多个6孔板（4-5毫升，每孔）。
  2. 离心板在1250×g离心90分钟，在25℃。离心后，孵育所述板在37℃下24小时。
  3. 第二天，凝聚细胞一起，并与Ruxolitinib和介质含有软琼脂混合并铺在SIX孔板中。对于每一个药物浓度，混合10毫升转导的BaF3细胞（10-20个细胞）与Ruxolitinib在50ml管适量的。补足体积至用含有20％血清的RPMI 40毫升在6孔板中加入10 mL 1.2％琼脂的细胞，mixcarefully和板。
  4. 孵育所述板在37℃下两周。挑用0.2毫升吸管尖端和亚培养它们分别在24孔板3-4天的抗性菌落。
  5. 通过离心收获抗性的BaF3细胞在450×g离心，在室温下5分钟。隔离使用市售的基因组DNA分离试剂盒的基因组DNA。 PCR扩增全长的JAK2基因从100ng的基因组DNA使用引物（mJAK2FP-ATGGCCTGCCTTACAATGACAG和mJAK2RP-GGTTCTGGAAGTCTGCTTGG）和长模板扩大高保真PCR系统。
  6. 分离的PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳。切除的DNA条带的3.4 kb的代表JAK2编码框架和隔离DNA使用市售的凝胶提取试剂盒。序列的cDNA的使用8个内部引物（P1 - P8）全长跨越的编码序列，并分析序列使用商业软件。

耐药突变的4 体外验证

许多细胞克隆携带一个​​以上的突变，为了测试在抗性表型的每个突变的贡献，产生所选的变体通过使用的pMSCV-JAK2V-617F质粒为模板位点定向诱变。

  1. 执行使用商业突变试剂盒和设计创造的点突变寡核苷酸的pMSCV-JAK2-V617F质粒定点突变。通过测序证实突变克隆的身份。
  2. 转导的BaF3细胞与逆转录病毒用突变质粒，随后用选择使用嘌呤霉素在1微克/毫升制成。
  3. 板10 4 BAF3-JAK2-V617F细胞（50微升的RPMI 10％FCS）中加入96孔板的每个孔中。另LY添加50微升含ruxolitinib媒体的横跨板的孔中（最终浓度：0，1，3，5，10，和20微米），并孵育板60小时，在37℃。
  4. 通过加入10微升的WST-1试剂向每个井与在37℃下进行2-4小时，评估细胞生存力。在A450用酶标仪记录吸光度。完成所有实验一式三份和情节均对吸收INCB018424浓度。执行使用非线性曲线拟合算法的最佳拟合S形曲线。得分导致50％细胞生存力的细胞的IC 50中的药物浓度。
  5. 接着，板6000000 BaF3细胞表达JAK2变种在6孔板中含有10％血清的增加ruxolitinib的浓度和在37℃下温育4-6小时的RPMI培养基。
  6. 收集细胞，离心，在450×g离心在4℃下5分钟。在20mM Tris-CL一次用PBS，并裂解洗涤细胞（pH7.5）中，50mM氯化钠，1％NP-40，0.1％SDS，5mM的EDTA，1mM的EGTA，1mM的氟化钠，2mM的钒酸钠，和5％的甘油补充有蛋白酶抑制剂混合物和磷酸酶抑制剂。超声处理的细胞悬浮液1分钟，随后加入5倍的凝胶上样缓冲液（350毫摩尔Tris盐酸[pH为6.8]，500mM的DTT，15％SDS的10mM苯甲脒，5mM的EDTA，5mM的EGTA，5mM的钒酸钠，蛋白酶鸡尾酒，50％甘油，和0.001％溴酚蓝）和变性在70℃下5-10分钟。
  7. 解决在8％SDS聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质变性条件下。执行与鼠单克隆抗phopsho STAT5免疫印迹。剥离印迹，并再次探测与兔多克隆抗SATA5抗体。使用可视化ECL试剂根据供应商的建议波段。

5. 在体内验证

  1. 转导BAF3细胞表达荧光素酶和樱桃（转导自体pMSCV - 吕克 - 雪儿做逆转录病毒RY GW）病毒表达JAK2-V617F和抗药性的变种。选择细胞存活嘌呤选择用于JAK2和其电阻变体的表达。
  2. 注入经尾静脉注射携带JAK2-V617F及其耐药变异体在200μl的PBS中，以6只Balb / C小鼠2000000活跃生长BAF3吕克/樱桃细胞。
  3. 后细胞移植的三天，每天两次两周注射小鼠Ruxolitinib（100毫克/千克）。
  4. 与成像系统执行的荧光素酶为基础的生物发光成像。 。
    1. 简言之，通过将300毫克至25ml无菌去离子水，分装在较小体积和存储制备荧光素溶液。
      注：储存荧光素在-80℃下并避光保护直到使用。
    2. 注入250μl到每只小鼠通过IP来实现在每只小鼠125毫克/公斤。麻醉从一起使用，在密封箱吸入异氟烷（1.5％-2.0％），同一组中的小鼠。适用于日兽医药膏Ë眼睛，防止干涩。
      注：采取小鼠的睡眠时间（10-15分钟）使荧光素活性峰值。保持时间的组之间是一致的，以避免变形。
  5. 马上转移的小鼠成像室阶段，在成像过程维持麻醉在1.5-2％异氟醚。图像小鼠顺序0.1，0.5，1，5，30，60和300秒的曝光。捕捉图像，并使用图像采集和分析软件定量生物发光强度。继成像返回老鼠回到笼子里。
  6. 为， 在体内嵌合收获总骨髓细胞。安乐死的小鼠用CO 2进行5分钟，随后用颈椎脱位。收获的骨头和4毫升粉碎冷PBS以收集骨髓。分析荧光显微镜下的百分樱桃阳性细胞和量化使用FACS。收集从每个样品两万事件。

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结果

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基因突变的出现带来了针对性的抗激酶治疗的巨大挑战。突变的研究，除了提供那些有助于选择和下一代药物开发的机械设计和功能的见解，也可以更好地临床管理，可能在未来成为个性化的治疗更有帮助。在这个实验中，我们显示筛选ruxolitinib抗性突变JAK2-V617F激酶（ 图1）。我们构建了通过引入全长小鼠JAK2-V617FcDNA成的pMSCV樱桃-GW的pMSCV-JAK2-V617F-cherry.gateway载体。它建议使用的细菌宿主（ 大肠杆菌 XL-1红色株）在最流行 ​​的选择方法，这是PCR中，由于其与序列偏置，以及较大的基因片段相关联的限制是难以扩增开发随机突变。随机诱变的DNA文库转染到HEK293T细胞进行逆转录病毒的生产。这些突变VIR用途分别用，转导中的选定菌落生长在软琼脂在不存在IL-3与1或5 Ruxolitinib的μM的BaF3细胞。在这些条件下，菌落从细胞携带JAK2V-617F的cDNA表达的激酶的功能和耐变仅出现。后10 - 14天，以及分离各个菌落，其变化的大小，并在液体培养扩展它们。基因组DNA，从这些细胞中分离。前病毒被收...

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讨论

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伊马替尼的治疗慢性粒细胞白血病的临床成功证明了小分子抑制剂靶向的胭脂激酶不仅潜力，但靶向治疗还发现限制：临床复发和耐药性的突变的靶基因中的出现。耐药突变鉴定有助于更好的临床管理和下一代抑制剂的发展。这个协议描述了一种方法，以确定在目标基因的耐药突变。此方法使用内置在大肠杆菌中随机诱变的质粒文库大肠杆菌 ，表达的突变体蛋白。库，然后在BaF3细胞（由癌基因易被转化）介绍，接着用在化学治疗剂的存在下选择的细胞克隆。从抗性克隆测序靶基因的识别突变抗性。最后，确定了突变位点被重新定向诱变来验证他们耐药性。

使用这种策略，我们定义突变JAK2和BCR / ABL赋予抗Ruxolitinib和伊马替尼，分别的频谱。我们确定了BCR / ABL百余突变。此外，确定患者检测到的所有主要的突变，我们的筛选方法，使我们能够识别内外激酶结构域残新型替代。有趣的是，从我们屏幕上的所有突变已患者样品中确定，但这一过程用了近10年以上15，从而证明了这种屏幕的预期突变，会造成困扰临床耐药性的能力。同时采用随机诱变性筛选提供了相较于其他方法很多优点，也有...

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致谢

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这项研究得到了 NCI （1RO1CA155091）、NHLBI （1R21HL114074） 和白血病研究基金会对 MA 的资助。MA 是 V- 基金会的 V-Scholar 奖的获得者。作者感谢 Sara Rohrabaugh 博士的编辑。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
细胞和组织培养 
BaF3 细胞ATCC
HEK293T 细胞ATCC
pMSCV-JAK2-V617F-puro.GWRoss Levine
pMSCV-JAK2-V617F/Y931C 的礼物。GW自制
pMSCV-JAK2-V617F/L983F。GW自制
pMSCV-JAK2-V617F/P58A。
pMSCV-V617F-Cherry.GW自制
pMSCV-JAK2-V617F/Y931C-cherry.GW自制
pMSCV-JAK2-V617F/L983F-cherry.GW自制
pMSCV-Luciferase-puro.GW自制
RPMICellgro （康宁）15-040-CV
DMEMCellgro （康宁）15-013-CV
Penn/StrepCellgro （康宁）30-002-CI
FBS亚特兰大生物S11150
胰蛋白酶 EDTA 1XCellgro （康宁）25-052-CI
1x PBSCellgro （康宁）21-040-CV
L-谷氨酰胺Cellgro （康宁）25-005-CL
嘌呤霉素Gibco （life technologies）A11138-03
硫酸鱼精蛋白 SigmaP33695 mg/ml 水溶液
台盼蓝溶液 （0.4%）SigmaT8154
DMSOCellgro （康宁）25-950-CQC
INCB018424 （Ruxolitinib）ChemieTeK941678-49-5
WST-1罗氏11644807001
0.45 微米盘式过滤器PALL2016-10
70 微米尼龙细胞过滤器Becton Dickinson352350
细菌培养
物 XL-1 红色 大肠杆菌 细胞安捷伦科技200129
SOC新英格兰生物实验室B90920s
氨苄青霉素SigmaA0166100 mg/ml 储备液 
Bacto 琼脂Difco214050
极好的肉汤Becton Dickinson243820
琼脂糖基因E-3119-500
试剂盒
Dneasy 血液和组织试剂盒Qiagen69506
扩展长模板 PCR 系统Roche1168134001
WizardSv 凝胶和 PCR 纯化系统PromegaA9282
纯质粒小量制备系统PromegaA1222
PCR 克隆系统，采用 Gateway 技术，含 pDONR 221 和OmniMAX 2 感受态细胞Invitrogen12535029
网关 LR Clonase 酶混合物 Invitrogen11791019
小鼠试剂
Vivo-Glo Luciferin 体内级PromegaP1043
1/2 cc Lo-Dose u-100 胰岛素注射器 28 G1/2Becton Dickinson329461
Mortor 杵Coor tek 60316 和 60317
异菌烯 （Isothesia TM）Butler Schien29405
仪器
NAPCO 系列 8000 WJ CO2 培养箱Thermo scientific
摇斗转子离心机 5810REppendorf
TC-10 自动细胞计数仪Bio-RAD这不是必需的，可以使用标准血细胞瘤进行细胞计数
GW 自制

参考文献

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Drug Resistance MutationsKinase Inhibitor ScreeningRandom Mutation LibraryIn Vitro ScreeningSite Directed MutagenesisJAK2 V617FRuxolitinib ResistanceBAF3 CellsRetroviral VectorIC50 Validation

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