从鸡胚中分离和培养离解的感觉神经元

摘要

细胞培养模型能够对环境条件进行精确控制，因此为阐明神经元细胞生物学的诸多方面提供了一个强大的平台。我们描述了一种快速、经济且可靠的方法，用于从鸡胚中分离、解离和培养感觉神经元。本文还提供了基质制备和免疫细胞化学的详细步骤。

摘要

神经元是具有多种功能的细胞，负责传递对感觉、运动、学习和记忆等多种生理功能至关重要的信息。由于神经元结构复杂、所处环境多样且动态变化，以及技术上的限制，在活体（in vivo）条件下研究神经元具有较大挑战性。因此，体外（in vitro）研究神经元有助于揭示其复杂的生物学特性。细胞培养模型具有明确可控的特性，可对环境条件和实验变量进行精确调控。本文描述了如何从鸡胚中分离、解离并培养原代神经元。该方法快速、经济，并能获得生长状态良好的感觉神经元。该流程可稳定获得神经元高度富集的培养物，非神经元细胞极少（少于5%）。原代神经元在未经处理的玻璃或组织培养塑料表面贴附性差，因此本文详细介绍了两种含层粘连蛋白（laminin）的明确培养基底的制备方法，用于神经元接种。培养的神经元适用于多种细胞与分子生物学技术，包括共免疫沉淀、活细胞成像、RNA干扰（RNAi）和免疫细胞化学。本文还优化并描述了在这些培养神经元上进行双重免疫细胞化学染色的实验步骤。

引言

神经元是复杂的细胞，负责传递对多种功能至关重要的信息，包括感觉、视觉、运动、学习和记忆。与其他类型的细胞不同，神经元会延伸出类似手臂的突起，称为轴突，形成用于信息传递的关键神经通路。在发育过程中，生长中轴突顶端存在一种特殊结构，称为生长锥，它通过响应一系列细胞外信号引导轴突到达正确的靶位。目前，人们对生长锥导向行为背后的复杂分子机制尚未完全理解。为了更深入地研究这些机制，研究人员已采用细胞培养模型，在明确且简化的体外（in vitro）环境中研究神经元。对培养神经元的研究¹极大地推动了我们对神经元细胞生物学的理解，包括：神经元分化²、细胞骨架动力学、内吞作用与运输 、树突调控^3,4 、轴突再生⁵，以及神经病变等临床状况⁶。此外，培养的神经元非常适合多种研究技术，包括免疫细胞化学、细胞表面共免疫沉淀、蛋白质印迹（Western blot）、转染、RNA干扰（RNAi）以及活细胞成像，例如对生长锥运动进行延时分析。因此，原代神经元培养是一种强有力的手段，可用于阐明神经元细胞生物学的诸多方面。

细胞培养模型使研究者能够精确控制环境条件和变量。例如，可轻松调控神经元接种（并生长）所用的基质。本文提供了两种不同基质的详细制备方法：一种含有低浓度层粘连蛋白-1，另一种则含有饱和浓度的层粘连蛋白-1。令人意外的是，同一种分子的不同浓度可对神经元....

方案

1. 盖玻片准备：酸洗和烘烤

1. 至少 2 解剖前数天（步骤2），开始以下步骤以准备盖玻片。进行酸洗步骤以去除油脂并彻底清洁盖玻片。
2. 将盖玻片装入瓷质支架中，该支架可垂直固定盖玻片并防止其相互接触。将支架及盖玻片浸入装有2 M盐酸（HCl）的玻璃组织学容器中。若无瓷质支架，可将约20片盖玻片平铺于100 mm玻璃培养皿底部，并用2 M HCl浸没盖玻片。
3. 将玻璃容器（内含浸没在酸中的盖玻片）置于通风橱内的摇床上，室温下轻轻摇动至少5小时。或者，在相同条件下用酸浸泡盖玻片过夜。
4. 用蒸馏水清洗盖玻片₂O(dH₂O）将载有盖玻片的瓷架从2 M HCl转移至盛有dH₂O的洁净玻璃组织学容器中₂O. 或者，将玻璃培养皿中的2 M HCl倾倒出来，重新加入去离子水₂O.
5. 通过倾析法用 dH₂O 清洗₂O 再次并用新鲜的 dH₂O 重新填充玻璃容器₂O. 重复以上步骤，共进行 3 次 快速洗涤。
6. 通过将玻璃容器（内含盖玻片和dH₂O）放回原位，开始更长时间的洗涤程序₂O）置于摇床上，室温下轻柔振荡10–30分钟。随后，倾去dH₂O 并加入新鲜的 dH₂O₂O. 重复上述洗涤步骤，总共至少洗涤十次；或者，可选择继续....

结果

本方案可使研究人员培养出富含解离胚胎感觉神经元的细胞群体，其中非神经元细胞极少（例如，<5%）^7,8,10,16。可从腰骶部、胸部和颈部区域获取大量背根神经节（DRG）。根据研究人员的需求，可轻松分离这些不同解剖区域的DRG。例如，图1展示了鸡胚在不同解剖阶段的图像，其中腰段DRG在图1C和图1D中被标出，胸段DRG则在图1E和图1F中显示。

通过免疫细胞化学方法可轻松标记培养的细胞。此处，培养的细胞经针对 β1 整合素和 NCAM 的抗体进行免疫染色（图2）。令人惊讶的是，如果将载玻片水平放置于 4 °C 并避光保存，我们能够在完成这些免疫细胞化学实验后长达一年内仍观察到荧光染色信号。然而，免疫细胞化学染色的持久性需由使用者根据具体抗体进行确定。

根据神经元的密度，也可以观察到延伸的神.......

讨论

本文介绍了从鸡胚中分离和培养离体感觉神经元的详细方案。该方法可在体外获得大量生长旺盛的神经元群体in vitro^7,8,10,16。多种细胞和分子技术均可应用于这些培养的神经元，包括本文所述的免疫细胞化学技术。该方案最近被用于定量评估感觉神经元生长锥中免疫标记的活化整合素的强度^8,16。在先前的研究中，使用一款软件程序精确绘制出生长锥远端20微米部分的轮廓，该轮廓基于NCAM染色结果生成。由于NCAM在神经元中广泛表达，该软件能够识别整个生长锥，而非仅识别其局部区域。随后，该生长锥轮廓被定义为感兴趣区域，软件进一步评估该区域内整合素染色的强度。通过这种方法，可轻松测量培养的感觉神经元中特定区域内目标蛋白的表达强度。

为了获得可靠的结果，提供以下建议。首先，在步骤 1.4–1.6 中经 HCl 孵育后，务必用清水充分清洗盖玻片，否则如层粘连蛋白-1（laminin-1）等分子在盖玻片上无法均匀分散。其次，在胰蛋白酶消化后（步骤 3.5），需确认背根神经节（DRG）细胞已充分解离，否则将形成细胞团块，从而降低神经元纯度。第三.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
无菌小培养皿（35 mm）	Corning	430165
无菌大培养皿（100 mm）	Falcon	353003
无菌大平皿（100 mm）	VWR	89000-302
玻璃平皿（100 mm）	VWR	D108962
精细镊子	Fine Science Tools	11251-10
标准镊子	Fine Science Tools	1100-12
盖玻片（22 × 22 mm）	Fisher	12 518 105K	厚度0.13–0.17 mm最适用于显微镜观察
瓷制盖玻片架	Thomas Scientific	8542E40
胎牛血清	Gibco	17502-048	每500 ml Ham's F12培养基中加入50 ml分装
HCl	VWR	VW3204-1	使用浓度为2 M，弃置前可使用两次
NaCl	Sigma	S9888	用于制备层粘连蛋白-1储备液的5 M NaCl溶液
层粘连蛋白-1	Invitrogen	23017-015	加入72 µl无菌5 M NaCl溶液，分装为50 µl每份
15 ml锥形管	cell treat	229411
PBS CMF 10x	Gibco	14200	使用时稀释至1x，用无菌Millipore过滤水稀释
PBS 10x	Gibco	14080	使用时稀释至1x，用无菌Millipore过滤水稀释
Ham's F12	Lonza	12-615F
胎牛血清白蛋白（BSA）	Gibco	10438	在F12HS20中使用浓度为10%
HEPES	Sigma	H3375	用蒸馏水配制无菌1 M溶液，在F12培养基中稀释至终浓度为10 mM
青霉素/链霉素	Sigma	P0781	在500 ml F12培养基中加入5 ml
NT3	Millipore	GF031	加入1 ml无菌Millipore水，无菌条件下分装，-20 °C保存，在F12H培养基中使用终浓度为10 ng/ml，存放于-20 °C非除霜冰箱中
NGF	RnD Systems	256-GF	加入1 ml含0.1% BSA的无菌1x PBS，无菌条件下分装，-20 °C保存，在F12H培养基中使用终浓度为10 ng/ml
L-谷氨酰胺	Sigma	G7513	无菌条件下分装，-20 °C保存，在F12H培养基中使用终浓度为200 mM
胰蛋白酶	Sigma	T4049	无菌条件下分装，-20 °C保存
牛血清白蛋白（BSA）	Gibco	15260
其他所需物品：常规解剖器械，包括玻璃巴斯德移液管、受精白来航鸡卵、检卵孵育箱（加湿，37 °C）、细胞培养箱（加湿，37 °C）、层流罩、双目光学解剖显微镜
免疫细胞化学试剂表
蔗糖	Sigma	S9378	用于固定液（4%多聚甲醛，30%蔗糖，2x PBS）
曲拉通X-100	Sigma	T-8787
多聚甲醛	Sigma	P6148	用于固定液（4%多聚甲醛，30%蔗糖，2x PBS）
Fluoromount G	Southern Biotech	0100-01
正常山羊血清	Life Technologies	PCN500
显微镜载玻片	VWR	16004-430
一抗表
抗NCAM抗体	Millipore	AB5032	多克隆
抗活化β1整合素抗体	Millipore	MAB19294	单克隆
二抗表
山羊抗小鼠IgG Alexa 488	Life Technologies	A11001
山羊抗兔IgG Alexa 548	Life Technologies	A11036