蛋白质精氨酸甲基化，由一类酶催化 即， 蛋白质精氨酸甲基转移酶（PRMTs）是指在蛋白质中精氨酸残基上通过酶促反应添加一个或多个甲基基团的过程。 体外 甲基化检测是评估已知或新型PRMT底物甲基化状态的最可靠工具。
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摘要
摘要
蛋白质精氨酸甲基化是细胞核中最丰富的翻译后修饰之一。蛋白质精氨酸甲基化可通过蛋白质组学方法和/或使用甲基化精氨酸特异性抗体进行免疫印迹来鉴定和/或确定。然而，这些技术有时可能具有误导性，并常产生假阳性结果。最重要的是，这些技术无法为PRMT底物特异性提供直接证据。相比之下，体外甲基化实验是一种有用的生化检测方法，具有高灵敏度，能够一致地揭示所鉴定的蛋白质是否确实是PRMT的底物。典型的体外甲基化实验包括纯化的有活性的PRMT、纯化的底物蛋白以及放射性同位素标记的甲基供体（S-腺苷-L-[甲基-3H]甲硫氨酸）。本文中，我们描述了一步一步的实验方案，用于分离具有催化活性的PRMT1，这是一种广泛表达的PRMT家族成员。随后，在含有S-腺苷-L-[甲基-3H]甲硫氨酸作为甲基供体的条件下，检测了纯化PRMT1对已知PRMT底物Ras-GTP酶激活蛋白结合蛋白1（G3BP1）的甲基转移酶活性。该实验方案不仅可用于确定新发现的生理状态下PRMT1底物的甲基化状态，还可用于理解蛋白质精氨酸甲基化的基本机制。
引言
蛋白质甲基化最早于1968年被描述1直到1996年PRMT1首次被克隆，研究人员才开始认识到这种翻译后修饰的重要性2有趣的是，核提取物蛋白质中约有2%的精氨酸残基被甲基化3，表明该修饰的广泛存在。精氨酸是一种带正电荷的碱性氨基酸，其侧链中的氮原子可在翻译后通过添加甲基进行修饰，这一过程称为精氨酸甲基化。4-6. 精氨酸甲基化由一类酶催化 即， 蛋白质精氨酸甲基转移酶（PRMTs）。精氨酸可发生单甲基化或双甲基化，其中双甲基化根据催化该过程的PRMTs类型不同，可分为对称性或非对称性甲基化。4-6.
含有精氨酸-甘氨酸富集基序的蛋白质可能是蛋白精氨酸甲基转移酶（PRMT）介导的催化作用的潜在底物。研究表明，PRMT介导的底物甲基化可调节蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质-核酸相互作用、蛋白质功能、基因表达和/或细胞信号传导，这些过程对于维持正常的细胞稳态至关重要7-9。为了深入理解蛋白质精氨酸甲基化的生物学功能，需要建立精确、高效且可重复的检测方法，以确定已鉴定的PRMT底物的甲基化状态。
体外 甲基化检测，用于评估纯化的PRMTs催化其底物甲基化的能力，是研究精氨酸甲基化的公认检测方法10-12该检测方法的整体成功率在很大程度上取决于纯化后的PRMTs的活性。PRMTs可从细菌或哺乳动物细胞中表达并纯化。10,11。这一点 体外 甲基化检测，如方案部分所述，基于Tini及其同事最初描述的方法10在本方案中，我们详细展示了在哺乳动物细胞中表达和纯化PRMT1所涉及的步骤。所纯化的PRMT1能够催化Ras-GTP酶激活蛋白结合蛋白1（G3BP1）的甲基化反应，G3BP1是一种已知的PRMT底物8，随后在 S-adenosyl-L-[methyl-3H]甲硫氨酸作为甲基供体。利用该检测方法，我们可以可靠地确定PRMTs对已知或 novel 底物的甲基化能力，这是研究蛋白质精氨酸甲基化的首要步骤。
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方案
1. 表达载体的构建
- 在开始实验方案之前，使用标准的分子生物学技术，将PRMTs克隆到带有N端表位标签（Myc或HA）的哺乳动物表达载体中，并将底物与谷胱甘肽-S-转移酶（GST）同框连接，以实现从细菌裂解液中高效表达和纯化蛋白。
2. PRMTs 的纯化
- 使用 100 mm 培养皿培养人支气管上皮细胞（Beas2B）。每 3 天传代一次，切勿让细胞长至融合。
- 转染前一天，在 100 mm 培养皿中加入 10 ml 培养基接种 7.5 × 105 个细胞。轻轻摇晃使细胞均匀分布，并在 37 °C、5% 湿度化的 CO2 培养箱中孵育。
- 次日，吸除培养基，加入 5 ml 不含血清和抗生素的培养基。轻轻摇晃后吸除。重复此步骤一次，最后加入 5 ml 无血清/抗生素培养基，进行转染。
- 在无菌的 1.5 ml 塑料离心管中，将 6 μg 质粒 DNA 溶于 750 μl 无血清培养基中。
- 在另一支 1.5 ml 塑料离心管中，将 30 μl 转染试剂溶于 750 μl 无血清培养基中。
- 将稀释后的转染试剂溶液（步骤 2.5）转移至含有稀释 DNA 的离心管（步骤 2.4）中。用移液器轻轻吹打数次以混匀。
- 在室温下孵育转染混合物 15 分钟。
- 15 分钟后，将转染混合物轻轻滴加到细胞上，轻轻摇晃使混合均匀，并在 37 °C、5% 湿度化的 CO2 培养箱中孵育。
- 3 小时后，吸除含转染混合物的培养基，加入含血清和抗生素的新鲜细胞培养基。
- 在 37 °C、5% 湿度化的 CO2 培养箱中孵育 48 小时。
- 48 小时后，用 1 ml 裂解缓冲液（1× 磷酸盐缓冲液，1% Nonidet P-40，0.5% 脱氧胆酸钠，0.1% 十二烷基硫酸钠，以及 1 µg/ml 苯甲基磺酰氟）裂解细胞。使用细胞刮将裂解物收集至塑料离心管中，冰上孵育 30 分钟。
- 在台式离心机上以 15,000 × g 离心 10 分钟，去除细胞碎片，澄清裂解物。[* 强烈建议在进行酶纯化用于甲基化检测前，先取部分裂解物用抗-HA 抗体进行免疫印迹，以确认 HA-PRMT1 的表达情况。]
- 为纯化 PRMTs，将 3 mg 细胞裂解物与 30 μl 磷酸盐缓冲液（PBS）中 50:50 的抗-HA 亲和基质悬浮液混合，在 4 °C 下于旋转仪中旋转孵育过夜。
- 次日，在台式离心机上以 14,000 × g 离心 2 分钟，收集珠粒。弃去上清液，每次用 1 ml RIPA 缓冲液 [20 mM Tris（pH 8.0），150 mM NaCl，5 mM EDTA 和 1% Triton-X-100] 洗涤珠粒 3 次 ，每次洗涤后均以 14,000 × g 离心 2 分钟。第三次洗涤后，用 100 μl 甲基化缓冲液（50 mM Tris pH 8.5，20 mM KCl，10 mM MgCl2，1 mM β-巯基乙醇，100 mM 蔗糖）再洗涤一次珠粒。离心后弃去上清液。含有固定化 PRMTs 的珠粒即可用于甲基化检测。[* 强烈建议立即在甲基化检测中使用固定化的 PRMTs。]
3. 底物的纯化
- 将一个GST-G3BP1转化的BL21单菌落接种于5 ml含有100 μg/ml氨苄青霉素的Luria-Bertani（LB）培养基中，于37 °C、250 rpm振荡条件下过夜培养。
- 次日，将过夜培养物转移至50 ml新鲜LB培养基中，继续培养至OD600达到0.5–0.7（约需2小时）。
- 当OD600达到0.5–0.7时，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），使其终浓度为1 mM，并在37 °C、250 rpm振荡条件下继续培养4小时。
- 在1,500 × g离心10分钟收集菌体，将菌体沉淀用于GST蛋白纯化，或保存于-80 °C。
- 用5 ml裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂、100 μg/ml溶菌酶和0.1% Triton-X-100的1× PBS）重悬菌体沉淀，在37 °C孵育30分钟。此时由于细菌基因组DNA释放，裂解液将呈现浑浊且黏稠的状态。
- 通过超声处理剪切基因组DNA（振幅30%，每次1秒，共10次脉冲）。
- 在15,000 × g离心10分钟以澄清裂解液，将澄清的上清液转移至15 ml离心管中。若上清液不澄清，需再重复离心一次。
- 同时，用预冷的PBS洗涤GST-Sepharose珠两次，并用PBS配制成50:50的悬浮液。向澄清的细菌裂解液中加入200 μl GST-Sepharose悬浮液，在4 °C旋转孵育1小时。
- 孵育1小时后，在500 × g离心3分钟以收集珠子，用预冷的PBS洗涤珠子3次 。
- 最后一次洗涤后，用100 μl洗脱缓冲液（50 mM Tris pH 8.0，150 mM NaCl，30 mM谷胱甘肽）重悬珠子，在4 °C旋转孵育10分钟。
- 在15,000 × g离心2分钟，将含有纯化蛋白的上清液转移至另一塑料离心管中。取5 μl纯化蛋白样品与已知浓度的牛血清白蛋白（BSA）一同进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析，以估算纯化蛋白的浓度。
4. 甲基化检测
注意：应在指定用于放射性同位素操作的独立区域进行以下步骤，并遵守所在机构关于使用放射性同位素开展实验的相关规程。
- 向固定的PRMTs（步骤2.13）中加入2 μg纯化的GST-底物和主混合液，主混合液包含1×甲基化缓冲液（50 mM Tris pH 8.5，20 mM KCl，10 mM MgCl2，1 mM β-巯基乙醇，100 mM蔗糖）、1 μCi的S-腺苷-L-[甲基-3H]甲硫氨酸以及水，总体积为10 μl，于30 °C孵育1小时。
- 孵育1小时后，加入10 μl 2× SDS上样缓冲液终止反应。将样品在95 °C变性10分钟，随后在SDS-PAGE凝胶上进行电泳分离。
- 随后，采用半干式电转移法将SDS凝胶上分离的蛋白质转移至硝酸纤维素膜上。
- 转移完成后，用自显影增强液（autofluor，一种放射自显影图像增强剂）覆盖膜，室温下轻轻摇动2小时。2小时后倒出自显影增强液并保留以备后续使用。[*将试管标记为放射性物质]
- 将膜在滤纸上快速风干，密封于塑料袋中，并于-20 °C下对X射线胶片曝光。合适的曝光时间为5至30天。
5. PRMT 表达及底物上样量均一性的确认
- 获得足够的曝光后，将膜转移至含有封闭缓冲液 [含 Tween-20 的 Tris 缓冲盐水（TBST + 3% 脱脂牛奶）] 的塑料盒中，轻轻摇动封闭 1 小时。
- 将封闭缓冲液作为放射性废物丢弃。在 4 °C 条件下，用 TBST 稀释的抗 HA 抗体（1:1,000 稀释度）孵育膜过夜，同时轻轻摇动。
- 用 TBST 洗涤膜 3 次 ，然后在室温下用 TBST 稀释的 HRP 标记的抗小鼠二抗（1:5,000 稀释度）孵育膜 1 小时，同时轻轻摇动。
- 孵育 1 小时后，用 TBST 洗涤膜 3 次，使用 HRP 底物进行化学发光蛋白检测。
- 检测完 HA 标签的 PRMTs 后，在室温下用 Ponseau-S 染色液孵育膜 5 分钟。用去离子水快速洗涤膜 3 次，以检测 GST 标签的底物。扫描图像。
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结果
HA-PRMT1 甲基化 GST-G3BP1 的能力通过以下方法确定 体外 甲基化实验。使用从Beas2B细胞裂解液中纯化的HA标签PRMT1进行甲基化反应，反应体系包含GST-G3BP1，以及 1 μCi S-腺苷-L-[甲基-3H]甲硫氨酸作为甲基供体。PRMT1能够高效催化GST-G3BP1的甲基化反应（图1，上图面板）。以转染空载体的Beas2B细胞裂解液进行pull-down实验后进行甲基化反应，作为阴性对照（图1，上图，第1泳道）。使用抗HA抗体进行免疫印迹证实了PRMT1的表达（图 1，中图)。使用Ponseau-S染色以证明在两个反应中GST-G3BP1的上样量相等（图1，下图）
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讨论
本文所述方案常规用于确定已鉴定的PRMT底物的甲基化状态。这一可靠且一致的检测方法还可为PRMT对其底物的特异性提供确凿证据。该检测成功的关键要素包括：1. 在哺乳动物细胞中表达PRMT；2. 纯化PRMT的活性；3. 底物的表达与纯化；4. 将蛋白质完全转印至硝酸纤维素膜。
从细菌中表达并纯化的重组PRMTs也可用于 体外 甲基化反应10,11,13然而，由于每种PRMT所需的纯化策略、保存条件和保存温度各不相同，重组PRMT在应用中的使用受到限制。 体外 甲基化反应可能并不理想。此外，重组的PRMTs也具有较短的半衰期11考虑到这些挑战，我们认为从哺乳动物细胞中纯化PRMTs具有操作简便和结果稳定的优势 体外 甲基化反应。如果在哺乳动物细胞中进行PRMTs的瞬时表达显得不便，可考虑构建PRMTs的稳定细胞系。最重要的是，在哺乳动物细胞中表达PRMTs是目前唯一可用于检测PRMT催化活性对刺激因素响应的方法。 例如, 生长因子，细胞因子 等等。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由美国退伍军人事务部的杰出奖以及美国国立卫生研究院资助项目 R01CA138528（资助对象：RW）支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| S-腺苷-L-[甲基-3H] 蛋氨酸 | Perkin Elmer | ||
| Ecoscint ultra | 国家诊断公司（National Diagnostics） | LS-270 | |
| 瓶口分液器 | 国家诊断公司（National Diagnostics） | LS-900 | |
| AutoFluor | 国家诊断公司（National Diagnostics） | LS-315 | |
| 6 ml 闪烁瓶 | 国家诊断公司（National Diagnostics） | 货号：SVC-06 | |
| GST-Sepharose | GE 生命科学（GE Life Sciences） | ||
| 还原型 L-谷胱甘肽 | 西格玛（Sigma） | G4251 | |
| Lipofectamine | 英潍捷基（Invitrogen） | 转染试剂 | |
| Beas2B | 美国典型培养物保藏中心（ATCC） | ||
| OptiMEM | 英潍捷基（Invitrogen） | ||
| NP-40 | 美国生物（US-Biologicals） | ||
| SDS | 西格玛（Sigma） | ||
| 脱氧胆酸钠 | 西格玛（Sigma） | ||
| PMSF | 西格玛（Sigma） | ||
| 抗 HA 亲和基质 | 罗氏（Roche） | ||
| Tris | 西格玛（Sigma） | ||
| NaCl | 西格玛（Sigma） | ||
| Bio-rad 凝胶成像系统 | Bio Rad | ||
| 抗 HA 抗体 | 罗氏（roche） | ||
| Ponceau S | 费希尔科技（Fisher Scientific） |
参考文献
- Paik, W. K., Kim, S. Protein methylase I. Purification and properties of the enzyme. J Biol Chem. 243, 2108-2114 (1968).
- Lin, W. J., Gary, J. D., Yang, M. C., Clarke, S., Herschman, H. R. The mammalian immediate-early TIS21 protein and the leukemia-associated BTG1 protein interact with a protein-arginine N-methyltransferase. J Biol Chem. 271, 15034-15044 (1996).
- Boffa, L. C., Karn, J., Vidali, G., Allfrey, V. G. Distribution of NG, NG,-dimethylarginine in nuclear protein fractions. Biochem Biophys Res Commun. 74, 969-976 (1977).
- Bedford, M. T. Arginine methylation at a glance. J Cell Sci. 120, 4243-4246 (2007).
- Lee, Y. H., Stallcup, M. R. Minireview: protein arginine methylation of nonhistone proteins in transcriptional regulation. Mol Endocrinol. 23, 425-433 (2009).
- Bedford, M. T., Clarke, S. G. Protein arginine methylation in mammals: who, what, and why. Mol Cell. 33, 1-13 (2009).
- Bikkavilli, R. K., et al. Dishevelled3 is a novel arginine methyl transferase substrate. Scientific reports. 2, 805(2012).
- Bikkavilli, R. K., Malbon, C. C. Arginine methylation of G3BP1 in response to Wnt3a regulates {beta}-catenin mRNA. J Cell Sci. 124, 2310-2320 (2011).
- Bikkavilli, R. K., Malbon, C. C. Wnt3a-stimulated LRP6 phosphorylation is dependent upon arginine methylation of G3BP2. J Cell Sci. , (2012).
- Tini, M., Naeem, H., Torchia, J. Biochemical analysis of arginine methylation in transcription. Methods Mol Biol. 523, 235-247 (2009).
- Lee, J., Cheng, D., Bedford, M. T. Techniques in protein methylation. Methods Mol Biol. 284, 195-208 (2004).
- Cheng, D., Vemulapalli, V., Bedford, M. T. Methods applied to the study of protein arginine methylation. Methods Enzymol. 512, 71-92 (2012).
- Zurita-Lopez, C. I., Sandberg, T., Kelly, R., Clarke, S. G. Human protein arginine methyltransferase 7 (PRMT7) is a type III enzyme forming omega-NG-monomethylated arginine residues. J Biol Chem. 287, 7859-7870 (2012).
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