蛋白质精氨酸甲基化，由一类酶催化 即， 蛋白质精氨酸甲基转移酶（PRMTs）是指在蛋白质中精氨酸残基上通过酶促反应添加一个或多个甲基基团的过程。 体外 甲基化检测是评估已知或新型PRMT底物甲基化状态的最可靠工具。
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摘要
摘要
蛋白质精氨酸甲基化是细胞核中最丰富的翻译后修饰之一。蛋白质精氨酸甲基化可通过蛋白质组学方法和/或使用甲基化精氨酸特异性抗体进行免疫印迹来鉴定和/或确定。然而，这些技术有时可能具有误导性，并常产生假阳性结果。最重要的是，这些技术无法为PRMT底物特异性提供直接证据。相比之下，体外甲基化实验是一种有用的生化检测方法，具有高灵敏度，能够一致地揭示所鉴定的蛋白质是否确实是PRMT的底物。典型的体外甲基化实验包括纯化的有活性的PRMT、纯化的底物蛋白以及放射性同位素标记的甲基供体（S-腺苷-L-[甲基-3H]甲硫氨酸）。本文中，我们描述了一步一步的实验方案，用于分离具有催化活性的PRMT1，这是一种广泛表达的PRMT家族成员。随后，在含有S-腺苷-L-[甲基-3H]甲硫氨酸作为甲基供体的条件下，检测了纯化PRMT1对已知PRMT底物Ras-GTP酶激活蛋白结合蛋白1（G3BP1）的甲基转移酶活性。该实验方案不仅可用于确定新发现的生理状态下PRMT1底物的甲基化状态，还可用于理解蛋白质精氨酸甲基化的基本机制。
引言
蛋白质甲基化最早于1968年被描述1直到1996年PRMT1首次被克隆，研究人员才开始认识到这种翻译后修饰的重要性2有趣的是，核提取物蛋白质中约有2%的精氨酸残基被甲基化3，表明该修饰的广泛存在。精氨酸是一种带正电荷的碱性氨基酸，其侧链中的氮原子可在翻译后通过添加甲基进行修饰，这一过程称为精氨酸甲基化。4-6. 精氨酸甲基化由一类酶催化 即， 蛋白质精氨酸甲基转移酶（PRMTs）。精氨酸可发生单甲基化或双甲基化，其中双甲基化根据催化该过程的PRMTs类型不同，可分为对称性或非对称性甲基化。4-6.
含有精氨酸-甘氨酸富集基序的蛋白质可能是蛋白精氨酸甲基转移酶（PRMT）介导的催化作用的潜在底物。研究表明，PRMT介导的底物甲基化可调节蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质-核酸相互作用、蛋白质功能、基因表达和/或细胞信号传导，这些过程对于维持正常的细胞稳态至关重要7-9。为了深入理解蛋白质精氨酸甲基化的生物学功能，需要建立精确、高效且可重复的检测方法，以确定已鉴定的PRMT底物的甲基化状态。
体外 甲基化检测，用于评估纯化的PRMTs催化其底物甲基化的能力，是研究精氨酸甲基化的公认检测方法10-12该检测方法的整体成功率在很大程度上取决于纯化....
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方案
1. 表达载体的构建
- 在开始实验方案之前，使用标准的分子生物学技术，将PRMTs克隆到带有N端表位标签（Myc或HA）的哺乳动物表达载体中，并将底物与谷胱甘肽-S-转移酶（GST）同框连接，以实现从细菌裂解液中高效表达和纯化蛋白。
2. PRMTs 的纯化
- 使用 100 mm 培养皿培养人支气管上皮细胞（Beas2B）。每 3 天传代一次，切勿让细胞长至融合。
- 转染前一天，在 100 mm 培养皿中加入 10 ml 培养基接种 7.5 × 105 个细胞。轻轻摇晃使细胞均匀分布，并在 37 °C、5% 湿度化的 CO2 培养箱中孵育。
- 次日，吸除培养基，加入 5 ml 不含血清和抗生素的培养基。轻轻摇晃后吸除。重复此步骤一次，最后加入 5 ml 无血清/抗生素培养基，进行转染。
- 在无菌的 1.5 ml 塑料离心管中，将 6 μg 质粒 DNA 溶于 750 μl 无血清培养基中。
- 在另一支 1.5 ml 塑料离心管中，将 30 μl 转染试剂溶于 750 μl 无血清培养基中。
- 将稀释后的转染试剂溶液（步骤 2.5）转移至含有稀释 DNA 的离心管（步骤 2.4）中。用移液器轻轻吹打数次以混匀。
- 在室温下孵育转染混合物 15 分钟。
- ....
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结果
HA-PRMT1 甲基化 GST-G3BP1 的能力通过以下方法确定 体外 甲基化实验。使用从Beas2B细胞裂解液中纯化的HA标签PRMT1进行甲基化反应，反应体系包含GST-G3BP1，以及 1 μCi S-腺苷-L-[甲基-3H]甲硫氨酸作为甲基供体。PRMT1能够高效催化GST-G3BP1的甲基化反应（图1，上图面板）。以转染空载体的Beas2B细胞裂解液进行pull-down实验后进行甲基化反应，作为阴性对照（图1，上图，第1泳道）。使用抗HA抗体进行免疫印迹证实了PRMT1的表达（图 1，中图)。使用Ponseau-S染色以证明在两个反应中GST-G3BP1的上样量相等（图1，下图）
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讨论
本文所述方案常规用于确定已鉴定的PRMT底物的甲基化状态。这一可靠且一致的检测方法还可为PRMT对其底物的特异性提供确凿证据。该检测成功的关键要素包括：1. 在哺乳动物细胞中表达PRMT；2. 纯化PRMT的活性；3. 底物的表达与纯化；4. 将蛋白质完全转印至硝酸纤维素膜。
从细菌中表达并纯化的重组PRMTs也可用于 体外 甲基化反应10,11,13然而，由于每种PRMT所需的纯化策略、保存条件和保存温度各不相同，重组PRMT在应用中的使用受到限制。 体外 甲基化反应可能并不理想。此外，重组的PRMTs也具有较短的半衰期11考虑到这些挑战，我们认为从哺乳动物细胞中纯化PRMTs具有操作简便和结果稳定的优势 体外 甲基化反应。如果在哺乳动物细胞中进行PRMTs的瞬时表达显得不便，可考虑构建PRMTs的稳定细胞系。最重要的是，在哺乳动物细胞中表达PRMTs是目前唯一可用于检测PRMT催化活性对刺激因素响应的方法。 例如, 生长因子，细胞因子 等等。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由美国退伍军人事务部的杰出奖以及美国国立卫生研究院资助项目 R01CA138528（资助对象：RW）支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| S-腺苷-L-[甲基-3H] 蛋氨酸 | Perkin Elmer | ||
| Ecoscint ultra | 国家诊断公司（National Diagnostics） | LS-270 | |
| 瓶口分液器 | 国家诊断公司（National Diagnostics） | LS-900 | |
| AutoFluor | 国家诊断公司（National Diagnostics） | LS-315 | |
| 6 ml 闪烁瓶 | 国家诊断公司（National Diagnostics） | 货号：SVC-06 | |
| GST-Sepharose | GE 生命科学（GE Life Sciences） | ||
| 还原型 L-谷胱甘肽 | 西格玛（Sigma） | G4251 | |
| Lipofectamine | 英潍捷基（Invitrogen） | 转染试剂 | |
| Beas2B | 美国典型培养物保藏中心（ATCC） | ||
| OptiMEM | 英潍捷基（Invitrogen） | ||
| NP-40 | 美国生物（US-Biologicals） | ||
| SDS | 西格玛（Sigma） | ||
| 脱氧胆酸钠 | 西格玛（Sigma） | ||
| PMSF | 西格玛（Sigma） | ||
| 抗 HA 亲和基质 | 罗氏（Roche） | ||
| Tris | 西格玛（Sigma） | ||
| NaCl | 西格玛（Sigma） | ||
| Bio-rad 凝胶成像系统 | Bio Rad | ||
| 抗 HA 抗体 | 罗氏（roche） | ||
| Ponceau S | 费希尔科技（Fisher Scientific） |
参考文献
- Paik, W. K., Kim, S. Protein methylase I. Purification and properties of the enzyme. J Biol Chem. 243, 2108-2114 (1968).
- Lin, W. J., Gary, J. D., Yang, M. C., Clarke, S., Herschman, H. R. The mammalian immediate-early TI....
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