软琼脂集落形成实验是一种用于体外确认细胞锚定非依赖性生长的方法。in vitro。本实验方案的目标是展示一种严格的方法，用于检测转化细胞的致瘤潜能以及蛋白质对转化细胞的肿瘤抑制作用。
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本文内容
摘要
摘要
非贴壁依赖性生长是转化细胞脱离固体表面而独立生长的能力，是癌变过程的典型特征。软琼脂克隆形成实验是表征该能力的成熟方法。 体外 被认为是检测细胞恶性转化的最严格方法之一，并允许对不同处理条件下细胞的这种能力进行半定量评估。在此，我们将利用小鼠肺癌细胞系CMT167演示软琼脂克隆形成实验，以展示Wnt信号通路中两个成员Wnt7A和Frizzled-9（Fzd-9）的肿瘤抑制作用。Wnt7a和Fzd-9的共过表达导致CMT167细胞克隆形成受到抑制。这表明，在小鼠肺癌模型中，Wnt7a配体及其Frizzled-9受体的表达足以抑制肿瘤生长。
引言
软琼脂集落形成实验是一种广泛用于评估细胞转化的常用技术 体外历史上，另一种由Puck描述的检测方法，即克隆形成实验 等 1956年用于评估细胞形成集落的能力1在此技术中，细胞被分散接种于培养板上，并在饲养细胞或条件培养基存在下培养，以提供必要的生长因子。该技术的局限性在于仅能提供有关集落形成的信息。正常细胞由于一种称为失巢凋亡的特定类型凋亡性死亡，无法进行锚定非依赖性生长。2然而，转化细胞具有无需贴附于基质即可生长和分裂的能力。基于这一特性，研究人员开发了软琼脂克隆形成实验。近年来，该实验已根据特定需求进行了多种改良。其中一种改良方法是加入荧光染料，以实现克隆的高通量计数；另一种改良方法则是使用特殊配方的琼脂溶液，以便在克隆形成后回收具有活性的细胞，用于后续蛋白质或DNA样本的提取。
在传统的软琼脂集落形成实验中，细胞被培养在一层含有细胞培养基的软琼脂中，该层软琼脂覆盖在另一层同样含有细胞培养基但琼脂浓度更高的软琼脂之上。这种结构可防止细胞贴附于培养皿表面，但允许转化细胞形成可见的集落。该技术的原理在于，正常细胞需要与细胞外基质接触才能生长和分裂，而转化细胞则能够在不受周围环境影响的情况下进行生长和分裂。因此，能够在无锚定依赖条件下形成集落的细胞被认为已发生转化并具有致癌性。该方法的总体目标是以半定量且严格的方式测定细胞的这种能力。
Wnt信....
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方案
1. 材料与试剂的准备
- 为每个待研究的细胞系或实验条件，在组织培养处理过的6孔板上标记相应的孔。
- 通过将1 g粉末培养基和0.2 g碳酸氢钠溶解于去离子水中，定容至50 ml，配制2倍浓度的细胞培养基。
- 用0.2 μm滤膜过滤该培养基以实现灭菌。
- 添加目标细胞系正常培养所需其他组分。例如，将CMT 167细胞系培养于RPMI 1640培养基中，添加10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素溶液。使用前在37 °C水浴中预热培养基。
- 按目标细胞系正常培养条件，单独配制1倍浓度的细胞培养基。
- 将1 g琼脂糖加入100 ml去离子水中，配制1%琼脂糖溶液。
注意：仅靠振荡无法使琼脂糖完全溶解。 - 将0.6 g琼脂糖加入100 ml去离子水中，配制0.6%琼脂糖溶液。两种琼脂糖溶液均可在带可密封盖的100 ml玻璃瓶中配制，以便长期储存。
- 将琼脂糖混合物进行高压灭菌。这些混合物可提前配制，并在4 °C保存；但在实验时需再次加热，直至琼脂糖完全溶解。
- 通过将硝基蓝四氮唑氯化物溶于1×PBS（8 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na2HPO4 和 0.24 g KH2PO4 溶于H2O，定容至1,000 ml）中，配制1 m....
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结果
Wnt7A 和 Fzd9 在 CMT167 细胞中的表达可通过软琼脂集落形成实验观察到具有肿瘤抑制作用。初步实验中，我们采用定量聚合酶链反应（Q-PCR）证实，CMT167 细胞中 Wnt7A 和 Fzd9 的 mRNA 表达水平较低。与 SV40 转化的鼠肺上皮细胞系 MLE-12 相比，CMT167 细胞内源性 Wnt7A 和 Fzd9 的表达水平较低图1随后，我们使用两种分别表达人源 Wnt7A（LNCX-Wnt7A）和 Fzd9（LPCX-Fzd9）的逆转录病毒过表达载体转染 CMT167 细胞，以建立稳定表达 Wnt7A 和 Fzd9 的细胞系（CMT LL Wnt7a/Fzd9）。通过 Q-PCR 在该细胞系中验证了 Wnt7A 和 Fzd9 的表达图2）。正如我们之前的研究所示，PPARγ 是 Wnt7A/Fzd9 信号通路的下游效应分子。Wnt 信号通路具有多样性，因此必须通过已知可被特定 Wnt/Fzd 配体-受体对激活的下游效应分子来评估特定 Wnt 及其 Fzd 受体的正确表达与激活情况。对于 Wnt7A 和 Fzd9，正是基于这一原因选择了 PP.......
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讨论
体外验证信号蛋白的肿瘤抑制功能具有挑战性。目前可用于研究该特性的最严格的方法之一是软琼脂克隆形成实验。本文中，我们以稳定过表达 Wnt7a 和 Fzd9 的小鼠肺癌细胞系与亲本 CMT167 细胞系为模型，展示了软琼脂克隆形成实验的操作过程。
关于软琼脂实验，有几个重要的注意事项需要考虑。该实验中最关键的步骤是细胞铺板。细胞计数必须准确，且琼脂溶液的温度不能过高。如果未形成菌落，可能是细胞因热应激而受损。在这种情况下，应重复实验，并采取预防措施，使琼脂温度尽可能接近 42 °C。或者，也可以增加铺板的细胞数量。
软琼脂实验存在一些局限性。其一，该实验需要两到三周才能完成；其二，实验结束后无法回收细胞。对该技术的一些改进采用了特殊的琼脂溶液，使实验结束后能够收获细胞用于DNA或蛋白质分析。其他替代方法则利用荧光染料，以实现高通量检测。尽管如此，传统的软琼脂克隆形成实验仍然是验证细胞锚定非依赖性生长的最严格检测方法之一。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由美国退伍军人事务部的杰出贡献奖以及美国国立卫生研究院资助项目 R01CA1385282522717（资助对象：RW）提供支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 感兴趣的癌细胞系 | Sigma-Aldrich | 10032302 | CMT-167 细胞 |
| 粉末状 RPMI 1640 培养基 | Gibco | 31800-089 | 用于配制 2x 细胞培养基。 |
| 液体 RPMI 1650 培养基 | Cellgro | 10-040-CV | 称为 1x 细胞培养基。 |
| 胎牛血清 | HyClone | SH30910.03 | 用于补充细胞培养基。 |
| 青霉素/链霉素 | CellGro | 30-002-Cl | 用于细胞培养基中。 |
| Difco Noble 琼脂 | BD Biosciences | 214230 | 用于配制 1.0% 和 0.6% 琼脂。 |
| 碳酸氢钠 | Fisher | BP-328-1 | 用于 2x 细胞培养基中。 |
| 胰蛋白酶 | Cellgro | 25-050-Cl | |
| 无菌瓶顶滤器 | Fisher | 09-761-126 | 用于对 2x 培养基进行无菌过滤。 |
| Lipofectamine 试剂 | Invitrogen | 18324-020 | 用于 PPAR-RE 荧光素酶检测。 |
| 6 孔细胞培养板 | |||
| 37 °C/5% CO2 培养箱 | |||
| Chemi-Doc 成像仪 | Bio-Rad | 用于拍摄克隆集落图像。 | |
| Quantity One 软件 | Bio-Rad | 用于计数细胞克隆集落。 | |
| 15 ml 锥形管 | |||
| 50 ml 锥形管 | |||
| 250 ml 三角烧瓶 | |||
| 微波炉 | |||
| 5 ml 移液管 | |||
| 移液器辅助器 | |||
| 微量移液器 | |||
| 血细胞计数板（带盖玻片） | |||
| 移液器吸头 | |||
| 倒置光学显微镜 | |||
| 离心机 | |||
| 耐热手套 | |||
| 保鲜膜 | |||
| 冰桶 |
参考文献
- Puck, T. T., Marcus, P. I., Cieciura, S. J. Clonal growth of mammalian cells in vitro; growth characteristics of colonies from single HeLa cells with and without a feeder layer. J Exp Med. 103, 273-283 (1956).
- Taddei, M. L., Giannoni, E., Fiaschi, T., Chiarugi, P.
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重印与许可
