软琼脂集落形成实验

摘要

软琼脂集落形成实验是一种用于体外确认细胞锚定非依赖性生长的方法。in vitro。本实验方案的目标是展示一种严格的方法，用于检测转化细胞的致瘤潜能以及蛋白质对转化细胞的肿瘤抑制作用。

摘要

非贴壁依赖性生长是转化细胞脱离固体表面而独立生长的能力，是癌变过程的典型特征。软琼脂克隆形成实验是表征该能力的成熟方法。 体外 被认为是检测细胞恶性转化的最严格方法之一，并允许对不同处理条件下细胞的这种能力进行半定量评估。在此，我们将利用小鼠肺癌细胞系CMT167演示软琼脂克隆形成实验，以展示Wnt信号通路中两个成员Wnt7A和Frizzled-9（Fzd-9）的肿瘤抑制作用。Wnt7a和Fzd-9的共过表达导致CMT167细胞克隆形成受到抑制。这表明，在小鼠肺癌模型中，Wnt7a配体及其Frizzled-9受体的表达足以抑制肿瘤生长。

引言

软琼脂集落形成实验是一种广泛用于评估细胞转化的常用技术 体外历史上，另一种由Puck描述的检测方法，即克隆形成实验 等 1956年用于评估细胞形成集落的能力¹在此技术中，细胞被分散接种于培养板上，并在饲养细胞或条件培养基存在下培养，以提供必要的生长因子。该技术的局限性在于仅能提供有关集落形成的信息。正常细胞由于一种称为失巢凋亡的特定类型凋亡性死亡，无法进行锚定非依赖性生长。²然而，转化细胞具有无需贴附于基质即可生长和分裂的能力。基于这一特性，研究人员开发了软琼脂克隆形成实验。近年来，该实验已根据特定需求进行了多种改良。其中一种改良方法是加入荧光染料，以实现克隆的高通量计数；另一种改良方法则是使用特殊配方的琼脂溶液，以便在克隆形成后回收具有活性的细胞，用于后续蛋白质或DNA样本的提取。

在传统的软琼脂集落形成实验中，细胞被培养在一层含有细胞培养基的软琼脂中，该层软琼脂覆盖在另一层同样含有细胞培养基但琼脂浓度更高的软琼脂之上。这种结构可防止细胞贴附于培养皿表面，但允许转化细胞形成可见的集落。该技术的原理在于，正常细胞需要与细胞外基质接触才能生长和分裂，而转化细胞则能够在不受周围环境影响的情况下进行生长和分裂。因此，能够在无锚定依赖条件下形成集落的细胞被认为已发生转化并具有致癌性。该方法的总体目标是以半定量且严格的方式测定细胞的这种能力。

Wnt信号通路在胚胎发育过程中至关重要，并且在肿瘤发生中常常出现失调^3-6。与Wnt信号相关的通路有多种。经典通路涉及Wnt信号通过其对转录共激活因子β-catenin的作用，调控下游基因的转录。Wnt还可通过若干非经典通路传递信号，例如平面细胞极性通路，该通路调控参与细胞骨架结构的组分⁷；以及Wnt-钙离子通路，该通路调控内质网中钙离子的释放⁸。Wnt配体通过与Frizzled受体结合而发挥其生物学活性。尽管已有研究表明多种Wnt在肺癌中表达上调，但Wnt7a在非小细胞肺癌中因启动子甲基化而表达下调⁹。Wnt7a与Fzd9结合，并通过非经典通路发挥肿瘤抑制作用。恢复Wnt7a和Fzd9的表达可抑制非小细胞肺癌细胞的生长¹⁰。Wnt7a/Fzd9的作用是通过激活ERK-5介导的，后者进一步激活过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）^11,12。本文中，我们证明Wnt7a和Fzd9的过表达可抑制小鼠肺癌细胞系的锚定非依赖性生长。小鼠CMT167细胞系来源于C57BL/lcrf小鼠的肺部肿瘤¹³，并被稳定转染了Wnt7A和Fzd9。通过定量PCR（Q-PCR）证实了Wnt7A和Fzd9的过表达，并通过下游PPARγ的激活验证了Wnt7A和Fzd9过表达的功能活性。

方案

1. 材料与试剂的准备

1. 为每个待研究的细胞系或实验条件，在组织培养处理过的6孔板上标记相应的孔。
2. 通过将1 g粉末培养基和0.2 g碳酸氢钠溶解于去离子水中，定容至50 ml，配制2倍浓度的细胞培养基。
3. 用0.2 μm滤膜过滤该培养基以实现灭菌。
4. 添加目标细胞系正常培养所需其他组分。例如，将CMT 167细胞系培养于RPMI 1640培养基中，添加10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素溶液。使用前在37 °C水浴中预热培养基。
5. 按目标细胞系正常培养条件，单独配制1倍浓度的细胞培养基。
6. 将1 g琼脂糖加入100 ml去离子水中，配制1%琼脂糖溶液。
   注意：仅靠振荡无法使琼脂糖完全溶解。
7. 将0.6 g琼脂糖加入100 ml去离子水中，配制0.6%琼脂糖溶液。两种琼脂糖溶液均可在带可密封盖的100 ml玻璃瓶中配制，以便长期储存。
8. 将琼脂糖混合物进行高压灭菌。这些混合物可提前配制，并在4 °C保存；但在实验时需再次加热，直至琼脂糖完全溶解。
9. 通过将硝基蓝四氮唑氯化物溶于1×PBS（8 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na₂HPO₄ 和 0.24 g KH₂PO₄ 溶于H₂O，定容至1,000 ml）中，配制1 mg/ml的储备液。该溶液将在实验结束时用于菌落染色。

2. 铺制琼脂底层

1. 松开1% noble agar瓶盖，放入微波炉加热约1-2分钟。在微波炉加热过程中需密切观察溶液，防止沸腾溢出。持续加热并间歇混匀，直至琼脂完全溶解且溶液澄清。
   注意：加热后使用耐热手套操作烧瓶。未采取防护可能导致烫伤或严重伤害。
2. 将融化的琼脂溶液和预热的2倍培养基置于装有热水（42 °C）的冰桶中。同时将一支50 ml锥形管放入冰桶内的试管架中，并置于热水中。将冰桶转移至细胞培养操作台以进行后续步骤。
3. 对于6孔板每孔的底层琼脂，需使用1.5 ml琼脂与培养基的混合液。
4. 为确保混合液充足，每块6孔板需准备总量12 ml的混合液。
5. 首先向50 ml锥形管中加入6 ml培养基，再加入6 ml 1% noble agar溶液。
6. 反复倒置锥形管数次以充分混匀。操作应迅速，以防止软琼脂过早凝固。
7. 用5 ml移液管吸取约5.5 ml混合液。
8. 在将混合液加入各孔前，先让移液管内的气泡上升至液柱顶部，然后向每孔加入1.5 ml混合液。注意避免将气泡排入孔中。
9. 盖上培养板，于细胞培养操作台内室温静置30分钟，使琼脂混合液凝固。

3. 铺加含细胞的上层琼脂

1. 待下层琼脂凝固后，开始准备上层琼脂。
2. 首先通过胰蛋白酶消化法收集细胞，并按1:5比例将其稀释于培养基中（例如，每1 ml胰蛋白酶加入4 ml培养基），转移至15 ml锥形管中。
3. 计数细胞，并计算每孔所需细胞数量，以在此时制备最终的细胞悬液。该数值因细胞类型而异。可先以每孔5,000个细胞作为起始点，并根据需要进行调整。对于该细胞数量，应制备浓度为6,667个细胞/ml的细胞悬液（即，每孔将加入0.75 ml该悬液和0.75 ml琼脂，总体积为1.5 ml；细胞浓度将因此稀释1:2，最终细胞总数为5,000个）。
4. 每孔所需细胞悬液体积仍为1.5 ml。每块6孔板需额外准备总计12 ml的细胞悬液。
5. 如前所述，用微波炉熔化0.6%琼脂溶液，并将其连同装有50 ml锥形管的试管架以及第3.3步所得的最终细胞悬液一同放入盛有热水的冰桶中。
6. 将含有熔融0.6%琼脂的冰桶转移至细胞培养超净台，用于后续操作。
7. 按1:1比例混合0.6%琼脂与细胞悬液，每块6孔板共制备12 ml总体积。每孔需1.5 ml，但应如上所述额外多制备一些。
8. 用移液器将6 ml细胞悬液转移至50 ml锥形管中。
9. 然后向管中加入6 ml 0.6%琼脂。
   注意：此混合液的温度必须保持在约42 °C，以防止过早凝固并最大限度提高细胞存活率。
10. 迅速操作，将此混合液轻柔吹打2–3次以混匀细胞，然后用5 ml血清移液器吸取5.5 ml混合液。
11. 在将1.5 ml混合液加入每孔之前，先让移液器内的气泡上升至液柱顶部，注意避免将气泡排入培养板孔中。
12. 将细胞/琼脂混合液置于细胞培养超净台中室温下静置30分钟，使其凝固，然后放入37 °C、加湿的细胞培养孵箱中。
13. 不同细胞系形成足够克隆所需时间各异，通常约为21天。
14. 应在上层琼脂上方维持一层生长培养基，以防止干燥。每周两次每次添加100 μl培养基即可满足此需求。

4. 染色培养皿并计数菌落

1. 通过向每个孔中加入 200 μl 氯化硝基蓝四唑溶液对细胞进行染色，并将培养板在 37 °C 下孵育过夜。
2. 待菌落染色后，使用成像仪拍摄各孔的图像，并利用图像分析软件计数菌落。

结果

Wnt7A 和 Fzd9 在 CMT167 细胞中的表达可通过软琼脂克隆形成实验观察到具有肿瘤抑制作用。初步实验中，我们采用定量 PCR（Q-PCR）证实，Wnt7A 和 Fzd9 的 mRNA 在 CMT167 细胞中表达水平较低。与 MLE-12 细胞（一种 SV40 转化的鼠肺上皮细胞系）相比，CMT167 细胞中内源性 Wnt7A 和 Fzd9 的表达水平较低。图1随后，我们使用两种分别表达人源Wnt7A（LNCX-Wnt7A）和Fzd9（LPCX-Fzd9）的逆转录病毒过表达载体转染CMT167细胞，以建立稳定共表达Wnt7A和Fzd9的细胞系（CMT LL Wnt7a/Fzd9）。我们通过Q-PCR在该细胞系中验证了Wnt7A和Fzd9的表达图2）。正如我们之前的研究所示，PPARγ 是 Wnt7A/Fzd9 信号通路的下游效应分子。Wnt 信号通路具有多样性，因此必须通过已知可被特定 Wnt/Fzd 配体-受体对激活的下游效应分子来评估该 Wnt 及其 Fzd 受体的正确表达与激活状态。对于 Wnt7A 和 Fzd9，正是基于这一原因选择了 PPARγ 作...

讨论

体外验证信号蛋白的肿瘤抑制功能具有挑战性。目前可用于研究该特性的最严格的方法之一是软琼脂克隆形成实验。本文中，我们以稳定过表达 Wnt7a 和 Fzd9 的小鼠肺癌细胞系与亲本 CMT167 细胞系为模型，展示了软琼脂克隆形成实验的操作过程。

关于软琼脂实验，有几个重要的注意事项需要考虑。该实验中最关键的步骤是细胞铺板。细胞计数必须准确，且琼脂溶液的温度不能过高。如果未形成菌落，可能是细胞因热应激而受损。在这种情况下，应重复实验，并采取预防措施，使琼脂温度尽可能接近 42 °C。或者，也可以增加铺板的细胞数量。

软琼脂实验存在一些局限性。其一，该实验需要两到三周才能完成；其二，实验结束后无法回收细胞。对该技术的一些改进采用了特殊的琼脂溶液，使实验结束后能够收获细胞用于DNA或蛋白质分析。其他替代方法则利用荧光染料，以实现高通量检测。尽管如此，传统的软琼脂克隆形成实验仍然是验证细胞锚定非依赖性生长的最严格检测方法之一。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
感兴趣的癌细胞系	Sigma-Aldrich	10032302	CMT-167 细胞
粉末状 RPMI 1640 培养基	Gibco	31800-089	用于配制 2x 细胞培养基。
液体 RPMI 1650 培养基	Cellgro	10-040-CV	称为 1x 细胞培养基。
胎牛血清	HyClone	SH30910.03	用于补充细胞培养基。
青霉素/链霉素	CellGro	30-002-Cl	用于细胞培养基中。
Difco Noble 琼脂	BD Biosciences	214230	用于配制 1.0% 和 0.6% 琼脂。
碳酸氢钠	Fisher	BP-328-1	用于 2x 细胞培养基中。
胰蛋白酶	Cellgro	25-050-Cl
无菌瓶顶滤器	Fisher	09-761-126	用于对 2x 培养基进行无菌过滤。
Lipofectamine 试剂	Invitrogen	18324-020	用于 PPAR-RE 荧光素酶检测。
6 孔细胞培养板
37 °C/5% CO2 培养箱
Chemi-Doc 成像仪	Bio-Rad		用于拍摄克隆集落图像。
Quantity One 软件	Bio-Rad		用于计数细胞克隆集落。
15 ml 锥形管
50 ml 锥形管
250 ml 三角烧瓶
微波炉
5 ml 移液管
移液器辅助器
微量移液器
血细胞计数板（带盖玻片）
移液器吸头
倒置光学显微镜
离心机
耐热手套
保鲜膜
冰桶