在小鼠肺部植入纤维蛋白凝胶以研究肺特异性血管生成

摘要

重现器官特异性的微环境（可刺激局部血管生成）对于受损组织的成功再生至关重要。本报告展示了一种新方法，即将纤维蛋白凝胶植入活体小鼠的肺表面，以探究肺特异性微环境如何调控成年小鼠中的血管生成及肺泡再生。

摘要

近年来，干细胞研究和生物工程技术的重大进展已显著推动了骨科和牙周领域利用生物材料再生和修复简单组织的发展。然而，由于器官再生的生物学过程尚未得到充分探索， attempts to regenerate the structures and functions of more complex three-dimensional (3D) organs such as lungs have not been very successful. 越来越明确的是，血管生成（即新血管的形成）在器官再生中发挥着关键作用。新生的血管系统不仅为器官再生提供必需的氧气、营养物质和多种细胞组分，还向局部再生组织传递指导性信号。因此，要在成体中成功实现肺组织再生，必须重建以血管生成驱动局部肺组织再生为特征的肺特异性微环境。尽管传统的 体内 血管生成检测，例如富含细胞外基质（ECM）的水凝胶皮下植入例如，纤维蛋白或胶原凝胶以及Matrigel（由Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤细胞分泌的细胞外基质蛋白混合物）被广泛用于研究血管生成的一般机制，但由于肺部生物材料原位植入方法尚未完善，肺特异性血管生成的研究仍不充分。本实验方案旨在介绍一种独特的方法，将纤维蛋白凝胶植入活体成年小鼠的肺表面，从而成功在凝胶内重现宿主肺源性血管生成过程。该方法使研究人员能够探究肺特异性微环境在正常和病理条件下调控血管生成与肺泡再生的机制。由于植入的生物材料可向邻近肺组织释放并提供物理和化学信号，将这些生物材料植入病变肺组织可能有助于正常化邻近的病变组织，从而为开发多种肺部疾病的新型治疗策略提供可能。

引言

本实验方案的总体目标是介绍一种在成年小鼠肺表面植入纤维蛋白凝胶的方法，该方法可帮助研究人员表征肺血管和肺泡发育的分子机制，并利用这些知识开发出能够模拟生理性肺血管和肺泡形成的生物仿生材料，以用于治疗多种肺部疾病。

超过3500万美国人患有慢性肺部疾病，包括慢性阻塞性肺病和肺纤维化。这些患者长期存在慢性呼吸系统症状，如呼吸困难、胸闷、持续性咳嗽和疲劳，严重影响其日常生活^1-3。尽管人们已投入大量努力开发针对这些肺部疾病的有效疗法，但目前尚无治愈手段，因此患者的生活质量较差，且带来巨大的经济和人力成本^4-7。目前，肺移植是挽救终末期慢性肺病患者的唯一方法。然而，由于供体短缺、费用高昂、严重并发症以及较低的存活率^8-11，肺移植并非理想方案。近年来组织工程技术的快速发展使研究人员能够通过将去细胞化完整肺支架重新接种多种前体细胞或诱导多能干细胞（iPS细胞）来构建可植入的生物工程肺^12,13。然而，这些生物工程肺在植入宿主动物后仅能维持数小时的功能^12,14,15。利用生物材料再生肺的复杂结构与功能也收效甚微。这可能是因为调控成人肺再生的关键生物学过程尚未被充分研究。在肺中，血管系统的形成是发育和再生过程中最早且最重要的事件之一^16-21。肺内新生的血管不仅输送氧气、营养物质以及器官形成所需的各类细胞组分，还向周围细胞提供具有指导作用的调控信号^22-25。因此，血管生成在成人肺泡再生过程中发挥关键作用^24,26,27。此外，异常的血管生成与多种慢性肺部疾病相关，例如慢性阻塞性肺病（COPD）²⁸、支气管肺发育不良（BPD）^21-23和肺纤维化²⁹。因此，为了开发更有效的肺组织工程策略或慢性肺病治疗方法，有必要深入理解肺特异性血管生成的基本机制。

每个器官都表现出独特的力学和化学特性，这些特性在生理和病理条件下可能存在差异^30-33。这些器官特异性的微环境调控内皮细胞行为，并以器官特异性的方式协调血管网络的形成^24,34-36。因此，为了开发更有效的肺再生策略，有必要深入理解肺特异性血管生成的机制。尽管传统的体内血管生成检测方法（如皮下植入水凝胶）已被广泛用于血管生成研究^37-39，但这些方法无法模拟器官特异性的血管生成过程。最近，研究人员开发出一种新方法，将Matrigel植入小鼠肺组织的弹性模具中，成功实现了血液 vessels 和肺上皮细胞向凝胶内的募集²²。这一独特方法将使研究人员能够探索肺特异性血管生成的机制，以及在生理和病理条件下血管与非血管性肺细胞之间的相互作用。然而，由于1）Matrigel不适用于临床应用；2）用于成型凝胶的弹性模具可能影响水凝胶与宿主肺组织之间的相互作用；以及3）肺部的弹性模具可能在呼吸过程中导致肺功能受损和疼痛。因此，作为一种更具临床相关性的替代方案，研究人员已在小鼠肺组织上直接植入含有血管生成因子（血管内皮生长因子（VEGF）/碱性成纤维细胞生长因子（bFGF））的三维纤维蛋白基质，而无需使用弹性模具进行成型，并成功模拟了源自宿主肺组织的血管生成过程。纤维蛋白凝胶是由凝血酶切割纤维蛋白原后形成的聚合纤维结构，已知可在体内捕获多种血管生成因子（如bFGF和VEGF），从而加速血管生成^40,41。由于其良好的再生能力和可生物降解特性⁴²，纤维蛋白凝胶在组织工程领域得到了广泛应用。

本文介绍了一种在活体成年小鼠肺表面植入纤维蛋白凝胶的创新且独特的方法，并证明了宿主肺源性血管生成可在凝胶内部重现 体内该方法可使研究人员研究肺部特异性血管生成，有望推动多种肺部疾病新疗法的开发，并显著促进成年肺组织成功再生的研究进展。

方案

注意：体内动物实验严格遵循美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）《实验动物护理与使用指南》中的建议进行。实验方案已通过波士顿儿童医院动物护理与使用委员会审查并批准（方案编号：13-10-2526R，14-02-2568R）。 本方案中使用的所有药物均为药用级，并在无菌条件下配制。 

1. 纤维蛋白凝胶制备

1. 制备含有VEGF和bFGF的纤维蛋白凝胶。
   1. 将储存于-80 °C的纤维蛋白原和凝血酶储备液在室温（25 °C）下解冻。
   2. 在1.5 ml离心管中，向纤维蛋白原溶液（终浓度：12.5 mg/ml，溶于0.9%氯化钠溶液^43-45）中加入凝血酶（终浓度：2.5 U/ml）、CaCl₂（终浓度：45 mM）、VEGF（终浓度：0–100 ng/ml）和bFGF（终浓度：0–100 ng/ml）。
   3. 通过移液轻轻混匀。
   4. 使用p200移液器吸头，将200 µl混合液逐滴加入无菌塑料培养皿中。
   5. 在37 °C孵育30–60分钟，直至液滴凝固。
      注意：凝固后的凝胶可在密封的塑料培养皿中于室温（25 °C）保存数小时后再进行移植（图1a）。
2. 移植前使用小型手术剪将纤维蛋白凝胶修剪成约3 × 3 × 3 mm的立方体。

2. 小鼠准备

1. 通过腹腔注射（IP）给予成年小鼠（8-12周龄）氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）进行麻醉，并通过捏压小鼠脚趾确认其麻醉程度是否充分。
   1. 使用兽医用眼膏涂抹小鼠眼睛，以防止实验过程中眼睛干涩。
2. 剃除小鼠左侧肋骨区域的毛发。
3. 对小鼠进行气管插管。
4. 将小鼠置于成70°角的插管架上，通过将其上门齿钩在支架顶部的小橡胶圈上来固定小鼠位置。
5. 使用钝头镊子将舌头轻轻向一侧牵拉。
6. 借助光纤鹅颈显微镜照明器观察喉部。
7. 将21 G气管弹性导管插入气管。
8. 确认小鼠是否在平稳地自主呼吸（规律的100-150次/分钟，无矛盾呼吸或浅表呼吸）。
9. 将小鼠置于解剖显微镜下，使其呈俯卧位。
10. 使用啮齿类动物呼吸机对小鼠进行机械通气（呼吸频率150次/分钟，潮气量7 ml/kg）。
11. 计数肋骨以定位第4肋间隙^th 和 5^th 肋
12. 用酒精和聚维酮碘彻底擦拭该区域以建立无菌区域。用无菌手术单充分覆盖手术区域。

3. 小鼠手术

1. 在皮肤局部注射0.25%布比卡因（200 μl）后，使用解剖剪在肋间隙处做一横向皮肤切口（长约1 cm）。
2. 在将0.25%布比卡因（200 μl）注射至肋间肌后，在第4肋间肌处做肌肉切口^th 和 5^th 用精细的小剪刀剪断肋骨。
3. 在肋骨之间插入解剖牵开器，以充分暴露左肺。
   1. 使用精细镊子刮取左肺中心部位脏层胸膜的一小区域（1 × 1 mm²）。
   2. 使用无菌棉签对区域施加轻柔压力，直至出血和漏气完全得到控制。
   3. 使用 p200 移液器吸头，将少量新鲜配制的纤维蛋白原/凝血酶混合液（纤维蛋白胶）（步骤 1.1.2，20 µl）置于该区域。
4. 用小镊子将一个纤维蛋白凝胶（步骤 1.2）轻轻放置于该区域上图1b).
   1. 确认在肺部呼吸运动期间，凝胶已牢固固定于该区域。
5. 确保没有大量漏气或肺组织出血。
6. 使用可吸收缝线缝合切口（肌肉层和皮肤层），无需拆线。
7. 使用27 G针头和1 ml注射器抽吸胸腔，以防止气胸。
8. 终止机械通气。

4. 小鼠恢复

1. 确保小鼠自主平稳呼吸（规律的每分钟100-150次呼吸，无矛盾呼吸或浅表呼吸）。
2. 腹腔注射1 ml预热的0.9% NaCl溶液，以防止脱水。
3. 将小鼠置于循环温水垫上使其恢复。
4. 确认小鼠呼吸稳定后，移除气管插管。
5. 注射美洛昔康（5 mg/kg，皮下注射，术后连续3天 作为术后镇痛药。
6. 密切观察小鼠活动，至少每15分钟检查一次，直至其能够胸卧（可翻身至腹部并保持直立姿势）且意识清醒。
7. 恢复后，将小鼠放回新笼子，并与未接受手术的小鼠隔离饲养。
8. 术后每日监测手术部位是否有感染迹象（红肿、分泌物），观察动物的基本生理功能（食物和水摄入、排尿、排便、体重增长）以及痛苦的临床表现（毛发竖立、活动减少）。

5. 肺组织的收获

1. 植入后7至30天，使用压缩气体来源的CO₂对小鼠实施安乐死。
2. 在剑突尖端与胸骨切迹之间做切口（正中胸骨切开术），切断气管并分离与心脏、肺和气管的所有连接，完整取出带有植入凝胶的肺组织，用于组织学和生物化学分析。
3. 将带有肺组织的植入凝胶在4%多聚甲醛溶液中4 ºC下固定过夜，包埋于OCT包埋剂中，并连续切取厚度为30 µm的切片。
4. 利用共聚焦显微镜进行组织学分析（苏木精-伊红染色）和免疫组织化学分析（内皮细胞标志物：CD31；上皮细胞标志物：水通道蛋白(AQP)5和表面活性蛋白(SP)-B）^22,37,40。
5. 使用三维图像分析软件³⁷，将光学切片堆栈（厚30 µm）整合生成肺内皮细胞和上皮细胞的三维图像。
6. 使用图像分析软件⁴⁶定量分析新生血管的投影面积。

结果

为了检测宿主肺源性血管形成是否在植入肺部的生物材料内部重现，将添加了主要促血管生成因子 VEGF 和 bFGF（浓度分别为 0、10 和 100 ng/ml）的纤维蛋白凝胶，按照先前使用 Matrigel 报道的方法，植入活体小鼠肺表面 ²²纤维蛋白凝胶 ⁴⁷ 含有这些促血管生成生长因子的材料按图示制备 图1a开胸术后，使用镊子刮擦小鼠左肺表面的一小片区域，并用少量纤维蛋白胶将制备的纤维蛋白凝胶植入成年小鼠肺组织。该纤维蛋白胶经美国食品药品监督管理局（FDA）批准，广泛用于肺部手术中有效封闭漏气和减少出血。 ^48,49 (图1b）。大多数小鼠在没有严重呼吸系统症状的情况下恢复例如，气胸，呼吸窘迫）。植入后7天，处死小鼠并收获肺组织。植入的纤维蛋白凝胶在植入后7天已整合入宿主肺组织中图1c）。共聚焦荧光图像的三维重建显示，植入后7天，宿主来源的CD31阳性内皮细胞在凝胶内形成血管网络，该过程呈VEGF/bFGF剂量依赖性（图2a，c

讨论

本文介绍了一种在活体成年小鼠肺表面植入生物材料的新方法。利用该系统，可在材料内部成功重现由宿主肺组织介导的血管生成过程。该系统使研究人员能够探究内皮细胞、其他细胞（例如，上皮细胞、间充质细胞、免疫细胞）以及各种细胞外基质（ECM）组分之间的相互作用，这些组分是局部血管生成^50-53和肺泡再生^24,54所必需的。尽管传统的体内皮下水凝胶植入方法已被广泛用于血管生成研究^37-39，但这些方法无法模拟器官特异性的血管生成过程。而本系统通过将水凝胶直接植入肺表面，使研究人员能够在成年小鼠肺组织中探索肺特异性微环境在血管生成和肺泡再生中的作用。这些凝胶可由多种富含ECM的生物材料（例如，胶原蛋白、纤维蛋白）制备，并可添加多种化学因子（例如，促血管生成因子、生长因子）^55,56、前体细胞和/或诱导性多能干细胞（iPS细胞）。除了化学因子外，机械力也在调控血管生成过程中发挥重要作用^23,37。纤维蛋白凝胶的刚度随纤维蛋白原浓度变化而改变⁵⁷，调节纤维...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
人胎盘纤维蛋白原	Sigma	F4883	用于制备纤维蛋白凝胶
牛血浆凝血酶	Sigma	T9549	用于制备纤维蛋白凝胶
重组小鼠VEGF 164	R&D	493-MV	用于添加至纤维蛋白凝胶
重组小鼠bFGF	R&D	3139-FB	用于添加至纤维蛋白凝胶
啮齿类动物插管支架	Braintree Scientific INC	RIS 100	用于插管
光纤光源	Fisher Scientific	12-565-35	用于插管
21 G 弹性导管	B.Braun	4251652-02	用于插管
MiniVent 呼吸机	Harvard Apparatus	CGS-8009	用于通气
Stemi DV4 体视显微镜	Fisher Scientific	12-070-515	用于手术
可吸收缝线	Ethicon	PDP304	外科缝线
抗CD31抗体	BD Biosciences	553370	免疫组织化学
抗AQP5抗体	Abcam	AB78486	免疫组织化学
抗SP-B抗体	Abcam	AB40876	免疫组织化学