在小鼠肺部植入纤维蛋白凝胶以研究肺特异性血管生成

摘要

重现器官特异性的微环境（可刺激局部血管生成）对于受损组织的成功再生至关重要。本报告展示了一种新方法，即将纤维蛋白凝胶植入活体小鼠的肺表面，以探究肺特异性微环境如何调控成年小鼠中的血管生成及肺泡再生。

摘要

近年来，干细胞研究和生物工程技术的重大进展已显著推动了骨科和牙周领域利用生物材料再生和修复简单组织的发展。然而，由于器官再生的生物学过程尚未得到充分探索， attempts to regenerate the structures and functions of more complex three-dimensional (3D) organs such as lungs have not been very successful. 越来越明确的是，血管生成（即新血管的形成）在器官再生中发挥着关键作用。新生的血管系统不仅为器官再生提供必需的氧气、营养物质和多种细胞组分，还向局部再生组织传递指导性信号。因此，要在成体中成功实现肺组织再生，必须重建以血管生成驱动局部肺组织再生为特征的肺特异性微环境。尽管传统的 体内 血管生成检测，例如富含细胞外基质（ECM）的水凝胶皮下植入例如，纤维蛋白或胶原凝胶以及Matrigel（由Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤细胞分泌的细胞外基质蛋白混合物）被广泛用于研究血管生成的一般机制，但由于肺部生物材料原位植入方法尚未完善，肺特异性血管生成的研究仍不充分。本实验方案旨在介绍一种独特的方法，将纤维蛋白凝胶植入活体成年小鼠的肺表面，从而成功在凝胶内重现宿主肺源性血管生成过程。该方法使研究人员能够探究肺特异性微环境在正常和病理条件下调控血管生成与肺泡再生的机制。由于植入的生物材料可向邻近肺组织释放并提供物理和化学信号，将这些生物材料植入病变肺组织可能有助于正常化邻近的病变组织，从而为开发多种肺部疾病的新型治疗策略提供可能。

引言

本实验方案的总体目标是介绍一种在成年小鼠肺表面植入纤维蛋白凝胶的方法，该方法可帮助研究人员表征肺血管和肺泡发育的分子机制，并利用这些知识开发出能够模拟生理性肺血管和肺泡形成的生物仿生材料，以用于治疗多种肺部疾病。

超过3500万美国人患有慢性肺部疾病，包括慢性阻塞性肺病和肺纤维化。这些患者长期存在慢性呼吸系统症状，如呼吸困难、胸闷、持续性咳嗽和疲劳，严重影响其日常生活^1-3。尽管人们已投入大量努力开发针对这些肺部疾病的有效疗法，但目前尚无治愈手段，因此患者的生活质量较差，且带来巨大的经济和人力成本^4-7。目前，肺移植是挽救终末期慢性肺病患者的唯一方法。然而，由于供体短缺、费用高昂、严重并发症以及较低的存活率^8-11，肺移植并非理想方案。近年来组织工程技术的快速发展使研究人员能够通过将去细胞化完整肺支架重新接种多种前体细胞或诱导多能干细胞（iPS细胞）来构建可植入的生物工程肺^12,13。然而，这些生物工程肺在植入宿主动物后仅能维持数小时的功能^12,14,15。利用生物材料再生肺的复杂结构与功能也收效甚微。这可能是因为调控成人肺再生的关键生物学过程尚未被充分研究。在肺中，血管系统的形成是发育和再生过程中最早且最重要的事件之一^16-21。肺内新生的血管不仅输送氧气、营养物质以及器官形成所需的各类细胞组分，还向周围细胞提供具有指导作用的调控信号^....

方案

注意：体内动物实验严格遵循美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）《实验动物护理与使用指南》中的建议进行。实验方案已通过波士顿儿童医院动物护理与使用委员会审查并批准（方案编号：13-10-2526R，14-02-2568R）。 本方案中使用的所有药物均为药用级，并在无菌条件下配制。 

1. 纤维蛋白凝胶制备

1. 制备含有VEGF和bFGF的纤维蛋白凝胶。
   1. 将储存于-80 °C的纤维蛋白原和凝血酶储备液在室温（25 °C）下解冻。
   2. 在1.5 ml离心管中，向纤维蛋白原溶液（终浓度：12.5 mg/ml，溶于0.9%氯化钠溶液^43-45）中加入凝血酶（终浓度：2.5 U/ml）、CaCl₂（终浓度：45 mM）、VEGF（终浓度：0–100 ng/ml）和bFGF（终浓度：0–100 ng/ml）。
   3. 通过移液轻轻混匀。
   4. 使用p200移液器吸头，将200 µl混合液逐滴加入无菌塑料培养皿中。
   5. 在37 °C孵育30–60分钟，直至液滴凝固。
      注意：凝固后的凝胶可在密封的塑料培养皿中于室温（25 °C）保存数小时后再进行移植（图1a）。
2. 移....

结果

为了检测宿主肺源性血管形成是否在植入肺部的生物材料内部重现，将添加了主要促血管生成因子 VEGF 和 bFGF（浓度分别为 0、10 和 100 ng/ml）的纤维蛋白凝胶，按照先前使用 Matrigel 报道的方法，植入活体小鼠肺表面 ²²纤维蛋白凝胶 ⁴⁷ 含有这些促血管生成生长因子的材料按图示制备 图1a开胸术后，使用镊子刮擦小鼠左肺表面的一小片区域，并用少量纤维蛋白胶将制备的纤维蛋白凝胶植入成年小鼠肺组织。该纤维蛋白胶经美国食品药品监督管理局（FDA）批准，广泛用于肺部手术中有效封闭漏气和减少出血。 ^48,49 (图1b）。大多数小鼠在没有严重呼吸系统症状的情况下恢复例如，气胸，呼吸窘迫）。植入后7天，处死小鼠并收获肺组织。植入的纤维蛋白凝胶在植入后7天已整合入宿主肺组织中图1c）。共聚焦荧光图像的三维重建显示，植入后7天，宿主来源的CD31阳性内皮细胞在凝胶内形成血管网络，该过程呈VEGF/bFGF剂量依赖性（图2a，c

讨论

本文介绍了一种在活体成年小鼠肺表面植入生物材料的新方法。利用该系统，可在材料内部成功重现由宿主肺组织介导的血管生成过程。该系统使研究人员能够探究内皮细胞、其他细胞（例如，上皮细胞、间充质细胞、免疫细胞）以及各种细胞外基质（ECM）组分之间的相互作用，这些组分是局部血管生成^50-53和肺泡再生^24,54所必需的。尽管传统的体内皮下水凝胶植入方法已被广泛用于血管生成研究^37-39，但这些方法无法模拟器官特异性的血管生成过程。而本系统通过将水凝胶直接植入肺表面，使研究人员能够在成年小鼠肺组织中探索肺特异性微环境在血管生成和肺泡再生中的作用。这些凝胶可由多种富含ECM的生物材料（例如，胶原蛋白、纤维蛋白）制备，并可添加多种化学因子（例如，促血管生成因子、生长因子）^55,56、前体细胞和/或诱导性多能干细胞（iPS细胞）。除了化学因子外，机械力也在调控血管生成过程中发挥重要作用^23,37。纤维蛋白凝胶的刚度随纤维蛋白原浓度变化而改变⁵⁷，调节纤维.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
人胎盘纤维蛋白原	Sigma	F4883	用于制备纤维蛋白凝胶
牛血浆凝血酶	Sigma	T9549	用于制备纤维蛋白凝胶
重组小鼠VEGF 164	R&D	493-MV	用于添加至纤维蛋白凝胶
重组小鼠bFGF	R&D	3139-FB	用于添加至纤维蛋白凝胶
啮齿类动物插管支架	Braintree Scientific INC	RIS 100	用于插管
光纤光源	Fisher Scientific	12-565-35	用于插管
21 G 弹性导管	B.Braun	4251652-02	用于插管
MiniVent 呼吸机	Harvard Apparatus	CGS-8009	用于通气
Stemi DV4 体视显微镜	Fisher Scientific	12-070-515	用于手术
可吸收缝线	Ethicon	PDP304	外科缝线
抗CD31抗体	BD Biosciences	553370	免疫组织化学
抗AQP5抗体	Abcam	AB78486	免疫组织化学
抗SP-B抗体	Abcam	AB40876	免疫组织化学