本文介绍了用于研究因疾病状态导致的正常与异常血凝块结构之间形态学差异的实验技术，包括血液样本制备、共聚焦显微镜观察以及溶血速率分析。
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本文内容
摘要
摘要
纤维蛋白是一种细胞外基质蛋白，负责维持血凝块的结构完整性。近年来，关于纤维蛋白的研究已广泛开展，包括其合成、结构与功能以及凝块溶解的探究。然而，对于由疾病患者所形成的凝块在形态学和结构特征方面的认识仍十分有限。本研究介绍了一些实验技术，可用于检测因糖尿病和镰状细胞贫血等疾病状态导致的异常凝块结构的形态学差异。我们的研究重点在于纤维蛋白凝块的制备与评估，以利用多种实验分析方法和共聚焦显微镜来分析其形态学差异。此外，还描述了一种可对纤维蛋白凝块进行连续、实时溶解速率计算的方法。本文所述技术对于致力于阐明糖尿病或镰状细胞病患者合并血栓性疾病（如心肌梗死、缺血性心脏病和脑卒中）的研究人员和临床医生具有重要意义。
引言
血管内皮层受损后，机体通过止血反应或血凝块的形成来进行修复。当血液渗入细胞外基质时，组织因子会激活血液中的血小板，从而启动凝血级联反应。这一愈合过程中的关键力学组分是纤维蛋白基质，其由具有高度弹性并能承受较大力量的纤维蛋白纤维构成1-4。过去几十年中，许多研究人员对纤维蛋白的形成、结构和功能进行了广泛研究5-13。
患有糖尿病和镰状细胞病等疾病的患者，发生血栓性并发症（如心肌梗死、缺血性心脏病和中风）的风险增加14-19。在美国，每年有超过200万人新诊断为糖尿病。糖尿病分为两种类型：1型糖尿病，即机体无法产生足够的胰岛素；2型糖尿病，即机体对胰岛素产生抵抗。在糖尿病患者中，心血管疾病（CVD）导致了与该疾病相关的80%的发病率和死亡率20,21。
镰状细胞病（SCD）是一种遗传性血液疾病，在美国影响超过10万人22。SCD 是一种点突变疾病，会导致红细胞变为新月形，从而难以通过血液循环系统23。这两种疾病状态均会增加机体发生动脉粥样硬化性血栓性疾病的风险。其中一个原因是疾病状态下纤维蛋白的结构和功能发生改变14,24-26。
在糖尿病和镰状细胞病中，均存在高凝状态和纤溶活性降低，与健康患者相比，这会诱发动脉粥样硬....
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方案
注意：以下方案遵循佐治亚理工学院机构审查委员会（IRB）制定的指南。
1. 血液采集与红细胞分离步骤
- 从供体采集40-120 ml血液至含肝素的10 ml真空采血管中。采集后4小时内开始外周血单个核细胞（PBMC）的分离。在此期间，将血液置于室温保存。
注意：血液在室温或在 4 °C 是 NOT 不推荐，因为这会导致PBMC得率降低。 - 将全血用预冷至冰浴温度的溶液按1:1比例稀释4 °C无菌 PBS
- 将10 ml预冷的亲水性多糖溶液移入一个空的无菌50 ml锥形管中。轻轻将稀释的全血加至亲水性多糖溶液上层。
- 使用25 ml移液管，调至慢速模式，沿管壁极其缓慢地加入血液。在离心前，确保血液未与糖类混合，因为亲水性多糖对细胞具有毒性，否则将导致外周血单个核细胞（PBMC）的得率降低。
- 400 × g 条件下，4 ℃离心血液样本 30 分钟 4 °C如有条件，离心后将离心机的刹车速度降低至最大值的一半，以获得更好的分离效果。
- 吸出离心后血样中的血浆/血小板组分。小心吸除紧贴于压积红细胞层上方的亲水性多糖层。
- 收集8-10 ml压积红细胞，用未灭菌的0.9% NaCl生理盐水按1:1比例稀释。
2. 糖基化凝块结构的共聚焦显微镜评估（....
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结果
糖化纤维蛋白凝块结构的共聚焦显微镜分析
正常凝块与糖化凝块的共聚焦显微镜图像见图3。对正常凝块和糖化凝块进行的共聚焦显微镜分析显示，无论在凝块聚合过程中是否添加FXIIIa，糖化凝块均比正常凝块更为致密，且孔隙更小。图3A和图3B中纤维蛋白浓度较低，形成的结构密度低于纤维蛋白浓度较高的糖化凝块（图3C和图3D）。
在糖化凝块中观察到的更高密度（单位面积内的纤维数量）是由于糖尿病患者体内纤维蛋白原浓度升高所致。在正常凝块中，纤维蛋白纤维更为线性，并在FXIIIa作用下聚合形成更长的纤维，这可能是FXIIIa在纤维之间形成交联的结果。而在糖化凝块中，即使添加了FXIIIa，纤维仍显得较短。这很可能是由于纤维蛋白原分子上的糖化区域改变了聚合过程所致。此外，通过分析图3可以发现，糖化还可能导致纤维直径减小，这可能是糖化纤维荧光强度较低.......
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讨论
为了获得有关疾病状态下凝血机制结构的有意义数据，重要的是分离出参与凝血的相关因子，以确定这些条件下蛋白质和细胞的作用。本方案旨在研究糖尿病和镰状细胞病（SCD）状态下纤维蛋白凝块的结构 体外.
了解疾病状态下纤维蛋白形成和纤维蛋白溶解所涉及的机制十分必要，因为异常状况会导致高凝状态、动脉粥样硬化性血栓形成以及心血管疾病（CVD）。从本实验获得的共聚焦图像可以明显看出，在糖尿病和镰状细胞病（SCD）状态下均存在高凝活性，导致纤维蛋白原浓度升高。纤维蛋白原浓度升高会形成更致密的纤维蛋白网络，分支点增多，网络中的孔隙更小。在SCD患者的纤维蛋白网络中，不仅纤维蛋白含量增加，镰状细胞患者红细胞的聚集特性也会改变网络结构，使纤维蛋白被包裹成团块。镰状细胞患者红细胞的聚集还降低了纤维蛋白团块的孔隙率，但在整体网络中似乎增加了空隙浓度。糖化凝块的纤维蛋白溶解分析结果支持了以下假设：与健康正常凝块相比，糖化凝块在纤溶酶减少的情况下溶解速率较低。然而，该结果并未对含有正常浓度纤溶酶的糖化凝块的溶解速率提供确凿证据。因此可以得出结论：对于纤溶酶浓度正常的糖尿病患者，可能具有足够的纤维.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢佐治亚理工学院Lam实验室在开发实验检测方法过程中提供的许多有益讨论。本出版物中报道的研究工作得到了美国国立卫生研究院国家心肺血液研究所的资助，资助编号为K01HL115486，以及美国国立卫生研究院院长办公室新创新者奖1DP2OD007433-01的支持。本内容仅由作者负责，不代表美国国立卫生研究院的官方观点。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| PBS | Life Technologies | 10010031 | |
| Ficoll-Paque（亲水性多糖） | GE Healthcare | 45-001-749 | |
| 10 ml 肝素抗凝真空采血管 | BD Biosciences | 366643 | |
| 人纤维蛋白原 | Enzyme Research Laboratories | N/A | |
| Alexa Fluor 488 标记的人纤维蛋白原偶联物 | Molecular Probes | F13191 | |
| 0.5 ml 带刻度微量离心管 | Fisher Scientific | 05-408-120 | |
| 葡萄糖粉末 | Life Technologies | 15023-02 | |
| FXIIIa | Enzyme Research Laboratories | N/A | |
| VIS 共聚焦显微镜 | Zeiss LSM 510 | LSM 510 | |
| 50 mM Tris | Lonza | S50-642 | |
| 氯化钙（CaCl2） | Sigma Aldrich | 449709-10G | |
| Vybrant DiD 细胞标记溶液 | Life Technologies | L7781 | |
| 纤溶酶 | Enzyme Research Laboratories | N/A | |
| 氯化钠（5 M NaCl） | Life Technologies | AM9759 | |
| 统计建模软件 | IBM | SPSS Statistics 22 |
参考文献
- Averett, R. D., et al. A Modular Fibrinogen Model that Captures the Stress-Strain Behavior of Fibers. Biophysical Journal. 103, 1537-1544 (2012).
- Carlisle, C. R., et al. The mechanical properties of individual, electrospun fibrinogen fibers.
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