正常与疾病状态下纤维蛋白凝块结构的实验与成像技术研究

摘要

本文介绍了用于研究因疾病状态导致的正常与异常血凝块结构之间形态学差异的实验技术，包括血液样本制备、共聚焦显微镜观察以及溶血速率分析。

摘要

纤维蛋白是一种细胞外基质蛋白，负责维持血凝块的结构完整性。近年来，关于纤维蛋白的研究已广泛开展，包括其合成、结构与功能以及凝块溶解的探究。然而，对于由疾病患者所形成的凝块在形态学和结构特征方面的认识仍十分有限。本研究介绍了一些实验技术，可用于检测因糖尿病和镰状细胞贫血等疾病状态导致的异常凝块结构的形态学差异。我们的研究重点在于纤维蛋白凝块的制备与评估，以利用多种实验分析方法和共聚焦显微镜来分析其形态学差异。此外，还描述了一种可对纤维蛋白凝块进行连续、实时溶解速率计算的方法。本文所述技术对于致力于阐明糖尿病或镰状细胞病患者合并血栓性疾病（如心肌梗死、缺血性心脏病和脑卒中）的研究人员和临床医生具有重要意义。

引言

血管内皮层受损后，机体通过止血反应或血凝块的形成来进行修复。当血液渗入细胞外基质时，组织因子会激活血液中的血小板，从而启动凝血级联反应。这一愈合过程中的关键力学组分是纤维蛋白基质，其由具有高度弹性并能承受较大力量的纤维蛋白纤维构成^1-4。过去几十年中，许多研究人员对纤维蛋白的形成、结构和功能进行了广泛研究^5-13。

患有糖尿病和镰状细胞病等疾病的患者，发生血栓性并发症（如心肌梗死、缺血性心脏病和中风）的风险增加^14-19。在美国，每年有超过200万人新诊断为糖尿病。糖尿病分为两种类型：1型糖尿病，即机体无法产生足够的胰岛素；2型糖尿病，即机体对胰岛素产生抵抗。在糖尿病患者中，心血管疾病（CVD）导致了与该疾病相关的80%的发病率和死亡率^20,21。

镰状细胞病（SCD）是一种遗传性血液疾病，在美国影响超过10万人²²。SCD 是一种点突变疾病，会导致红细胞变为新月形，从而难以通过血液循环系统²³。这两种疾病状态均会增加机体发生动脉粥样硬化性血栓性疾病的风险。其中一个原因是疾病状态下纤维蛋白的结构和功能发生改变^14,24-26。

在糖尿病和镰状细胞病中，均存在高凝状态和纤溶活性降低，与健康患者相比，这会诱发动脉粥样硬化性血栓形成和心血管疾病（CVD）^17,27,28。已知纤溶功能减退可促进动脉粥样硬化进展，并导致早发性冠状动脉疾病患者反复发生缺血事件²⁹。在本研究中，我们探讨了纤维蛋白物理特性在这一特定病理环境中的作用。非疾病状态患者的纤维蛋白凝块结构由较细的纤维、较大的孔隙和总体较低的密度组成^14,24。健康患者中较高的孔隙率和较疏松的纤维蛋白凝块已被发现有助于促进纤溶¹⁶。在糖尿病和镰状细胞病等血栓前状态中，纤维蛋白原的生成增加，导致纤维蛋白原浓度从健康患者的正常水平2.5 mg/ml升高^30-33。研究发现，糖尿病患者形成的纤维蛋白凝块与健康非糖尿病患者相比，孔隙更小、更僵硬、分支点更多，且结构更致密^14,24,33-35。这种纤维蛋白结构的改变是由于参与凝块形成的蛋白质发生了糖基化机制所致。非酶促（不可逆）糖基化是指葡萄糖分子与纤维蛋白原分子上的赖氨酸残基结合，从而抑制人凝血因子XIIIa（FXIIIa）对谷氨酰胺和赖氨酸残基的正常交联作用^33,36,37。

近年来，纤维蛋白网络的结构分析得到了广泛研究。特别是，研究人员已利用电子显微镜和纤维蛋白网络的三维重建技术³⁸研究了血管内（内皮）细胞和血管外（成纤维细胞和平滑肌）细胞如何影响纤维蛋白结构³⁹利用粘弹性分析和光谱分析来研究纤维蛋白结构⁴⁰ ，并利用实验和计算方法建立了纤维蛋白结构与力学性能之间的关联⁴¹本研究的重点是在模拟糖尿病和镰状细胞血栓形成的条件下构建血凝块结构，并利用共聚焦显微镜检测疾病状态下血凝块的结构与功能。纤维蛋白凝块由人纤维蛋白原、人凝血酶和FXIIIa形成，并使用纤溶酶进行溶解。为模拟糖尿病条件，将高浓度纤维蛋白原在葡萄糖溶液中孵育以诱导 体外 纤维蛋白原糖基化。为了模拟镰状细胞病的凝血条件，采用本课题组先前建立的方法，将升高的纤维蛋白原浓度与来自患者的镰状细胞压积混合。⁴²这些方法被用于研究在疾病条件下纤维蛋白凝块形成及纤溶过程中的结构与功能，以及诱导心血管疾病（CVD）的机制。根据目前对这些疾病的研究，糖化纤维蛋白凝块结构更为致密，孔隙更少且更小。来自镰状细胞病患者红细胞（RBCs）的纤维蛋白凝块同样表现出更高的密度，并呈现红细胞聚集以及纤维蛋白簇的聚集体。这一现象已有明确研究基础，此前已被证实。⁴³还假设与健康的正常纤维蛋白凝块相比，无论是否存在纤溶酶减少的情况，糖化纤维蛋白凝块的纤溶速率均会显著降低。结果表明，对于糖化纤维蛋白凝块，仅在纤溶酶浓度降低的条件下才观察到显著不同的溶解速率。这种使用共聚焦显微镜的实验技术相较于其他成像方法具有显著优势，因为细胞和蛋白质能够保持其天然状态，从而可以实时记录凝血过程的视频影像。这种人工诱导凝血的方法也比获取患者样本并分离纯化单个蛋白质和酶更为经济且节省时间。此外，通过使用分离的蛋白质和酶来合成凝块，可使凝块标准化，避免因血浆中其他蛋白质的存在而导致样本间的差异。

方案

注意：以下方案遵循佐治亚理工学院机构审查委员会（IRB）制定的指南。

1. 血液采集与红细胞分离步骤

1. 从供体采集40-120 ml血液至含10 ml肝素的真空采血管中。采集后4小时内开始外周血单个核细胞（PBMC）的分离。在此期间，将血液置于室温保存。
   注意：血液在室温或 4 °C 下的过夜储存 非 不推荐，因为这会导致PBMC得率降低。
2. 将全血用冰浴（4 °C）预冷的无菌 PBS 按 1:1 比例稀释。
3. 将10 ml预冷的亲水性多糖溶液移入一个空的无菌50 ml锥形管中。轻轻将稀释的全血加至亲水性多糖溶液上层。
4. 使用25 ml移液管调至慢速挡，沿试管壁极其缓慢地加入血液。在离心前确保血液未与糖类混合，因为亲水性多糖对细胞具有毒性，否则将导致PBMC得率降低。
5. 将血液样本在 4 °C 条件下以 400 × g 离心 30 分钟。如有条件，将离心机的刹车速度降至最大值的一半，以获得更佳的离心后分离效果。
6. 吸出离心后血样中的血浆/血小板组分。小心吸除紧贴于压积红细胞层上方的亲水性多糖层。
7. 收集8-10 ml压积红细胞，用未灭菌的0.9% NaCl生理盐水按1:1比例稀释。

2. 糖基化凝块结构的共聚焦显微镜评估（模拟糖尿病凝块）

1. 在 37 °C 下解冻人纤维蛋白原和荧光标记的人纤维蛋白原偶联物。
2. 将以下试剂移入一个 0.5 ml 带刻度的微量离心管中。
   1. 对于健康人正常纤维蛋白凝块，将人纤维蛋白原与 10% 荧光标记的人纤维蛋白原偶联物混合于 50 mM Tris/100 mM NaCl 缓冲液中，终浓度为 5 mg/ml。
   2. 对于人工糖化纤维蛋白原（用于模拟糖尿病患者的凝块），将人纤维蛋白原与 10% 荧光标记的纤维蛋白原偶联物在含有 5 mM 葡萄糖的 50 mM Tris/100 mM NaCl 溶液中孵育，终浓度为 6.8 mg/ml。
3. 使用不透光材料覆盖微量离心管，避免光照。将离心管置于 37 °C 水浴中孵育 48 小时。
4. 通过在载玻片两侧粘贴薄层胶带，在玻璃显微镜载玻片上制作一个腔室。
5. 在 48 小时孵育结束后，于室温下解冻 FXIIIa 和人α凝血酶，以准备纤维蛋白形成的试剂。
6. 将 FXIIIa 用 5 mM CaCl₂ 缓冲液稀释至 80 U/ml。
7. 将凝血酶用 5 mM CaCl₂ 缓冲液稀释至 4 U/ml。
   1. 对于正常凝块，确保纤维蛋白原、FXIIIa 和凝血酶的终浓度分别为 2.5 mg/ml、20 U/ml 和 1 U/ml，总体积为 50 μl。
   2. 对于糖化凝块，确保纤维蛋白原、FXIIIa 和凝血酶的终浓度分别为 3.4 mg/ml、20 U/ml 和 1 U/ml，总体积为 50 μl。
8. 立即吸取 30 μl 纤维蛋白溶液加入由胶带形成的腔室内。
9. 将一块尺寸为 22 mm × 22 mm、厚度为 0.15 mm 的玻璃盖玻片置于两层胶带之上，并用透明胶密封开放的两侧，防止纤维蛋白凝块干燥。确保胶带不与纤维蛋白凝块发生接触或相互作用。
10. 在 21–23 °C 下静置 2 小时，使纤维蛋白凝块充分聚合，随后进行共聚焦成像。
11. 使用配备 40X/1.30 Oil M27 物镜和 488 nm 氩激光器的共聚焦显微镜采集凝块的共聚焦显微图像。

3. 镰状细胞病患者含红细胞纤维蛋白凝块的共聚焦显微镜评估

1. 在 37 °C 下解冻人纤维蛋白原和荧光标记的人纤维蛋白原偶联物。
2. 将以下成分移入一个 0.5 ml 带刻度的微量离心管中。
   1. 对于健康的正常纤维蛋白凝块，将人纤维蛋白原与 10% 荧光标记的人纤维蛋白原偶联物混合于 50 mM Tris/100 mM NaCl 缓冲液中，终浓度为 5 mg/ml。
   2. 对于含有镰状细胞病（SCD）红细胞的凝块，将人纤维蛋白原与 10% 荧光标记的人纤维蛋白原偶联物混合于 50 mM Tris/100 mM NaCl 缓冲液中，使纤维蛋白原的终浓度为 10 mg/ml。
3. 使用细胞标记溶液对分离的红细胞（包括正常红细胞和通过红细胞分离方案获得的镰状细胞病患者红细胞）进行标记。
   1. 将细胞悬浮于任选的无血清培养基中，密度为 1 × 10⁶ 个/ml。
   2. 向细胞标记溶液中加入 5 μl/ml 的细胞悬液，轻轻吹打混匀。
   3. 在 37 °C 下孵育 20 分钟。
   4. 在 37 °C 下以 1,500 rpm 离心标记后的细胞悬液管 5 分钟。
   5. 弃去上清液，并将细胞轻轻重悬于 37 °C 的培养基中。
   6. 重复洗涤步骤（3.3.4 和 3.3.5）两次。
4. 将 FXIIIa 用 5 mM CaCl₂ 缓冲液稀释至 80 U/ml。
5. 将凝血酶用 5 mM CaCl₂ 缓冲液稀释至 4 U/ml。
   1. 对于正常凝块，确保纤维蛋白原、FXIIIa 和凝血酶的终浓度分别为 2.5 mg/ml、20 U/ml 和 1 U/ml，总体积为 50 μl。
   2. 对于含有镰状细胞病红细胞的凝块，确保纤维蛋白原、FXIIIa 和凝血酶的终浓度分别为 5 mg/ml、20 U/ml 和 1 U/ml，总体积为 50 μl。
6. 将 10 μl 标记的红细胞移入纤维蛋白溶液中。将 30 μl 含红细胞的纤维蛋白溶液移至显微镜玻片上（参见糖化凝块的玻片制备方法）。
7. 在 21–23 °C 下静置 2 小时，使纤维蛋白聚合，然后进行共聚焦成像。
8. 使用共聚焦显微镜采集凝块的图像，并采用波长为 488 nm 和 633 nm 的激发激光分别激发荧光标记的纤维蛋白和红细胞。

4. 糖基化凝块结构中纤溶速率的共聚焦显微镜评估

1. 对糖化凝块重复进行共聚焦显微镜实验流程（第2步），以评估糖化凝块的纤溶速率。
2. 不要用透明胶带封闭腔室的两端。将纤维蛋白凝块置于密封容器中，在21–23 °C下聚合1.5小时，容器内放置250 ml水以防止脱水。
3. 聚合完成后，使用共聚焦显微镜获取凝块的图像。
4. 将纤溶酶通过移液加入腔室的开放端，并利用毛细作用使纤溶酶在凝块中扩散。
   1. 对于正常浓度条件下的正常及糖化凝块纤溶实验，向腔室开口处加入25 μl浓度为200 μg/ml的纤溶酶。
   2. 对于低浓度条件下的糖化凝块实验，向腔室开口处加入25 μl浓度为50 μg/ml的纤溶酶。
5. 使用共聚焦显微镜软件中的时间序列功能（见图1），实时记录纤溶酶溶解凝块的动态视频。
   1. 点击采集模式，然后选择“时间序列”。设置循环次数和录制时间间隔。

5. 纤维蛋白溶解速率的计算

1. 通过设定一个区域（2,500 µm²）并计算溶解固定面积血凝块所需的时间来确定纤溶速率。使用以下公式计算纤溶速率（图2）：
   

6. 纤维蛋白溶解速率的统计学分析

1. 使用统计分析软件分析裂解数据。进行单因素方差分析（one-way ANOVA）和 事后检验 Tukey-Kramer 检验^44,45.

结果

糖化纤维蛋白凝块结构的共聚焦显微镜分析

正常凝块与糖化凝块的共聚焦显微镜图像见图3。对正常凝块和糖化凝块的共聚焦显微镜分析显示，无论在凝块聚合过程中是否添加FXIIIa，糖化凝块均比正常凝块更为致密，且孔隙更小。图3A和图3B中纤维蛋白浓度较低，形成的结构密度低于纤维蛋白浓度较高的糖化凝块（图3C和图3D）。

在糖化凝块中观察到的更高密度（单位面积内的纤维数量）是由于糖尿病患者体内纤维蛋白原浓度升高所致。在正常凝块中，纤维蛋白纤维更为线性，并在FXIIIa作用下聚合形成更长的纤维，这可能是FXIIIa在纤维之间形成交联的结果。而在糖化凝块中，即使添加了FXIIIa，纤维仍显得较短。这很可能是由于纤维蛋白原分子上的糖化区域改变了聚合过程所致。此外，通过分析图3可以推断，糖化还可能导致纤维直径减小，这可能是糖化纤维荧光强度较低的原...

讨论

为了获得有关疾病状态下凝血机制结构的有意义数据，重要的是分离出参与凝血的相关因子，以确定这些条件下蛋白质和细胞的作用。本方案旨在研究糖尿病和镰状细胞病（SCD）状态下纤维蛋白凝块的结构 体外.

有必要了解疾病状态下纤维蛋白形成和纤维蛋白溶解所涉及的机制，因为异常条件会导致高凝状态、动脉粥样硬化性血栓形成以及心血管疾病（CVD）。从本实验获得的共聚焦图像可以看出，糖尿病和镰状细胞病（SCD）状态下均存在高凝活性，导致纤维蛋白原浓度升高。纤维蛋白原浓度升高会形成更致密的纤维蛋白网络，分支点增多，网络中的孔隙更小。在SCD患者的纤维蛋白网络中，不仅纤维蛋白含量增加，镰状细胞患者红细胞的聚集特性也会改变网络结构，使纤维蛋白被包裹成团块。镰状细胞患者红细胞的聚集还降低了纤维蛋白团块的孔隙率，但在整体网络中似乎增加了空隙浓度。糖化凝块的纤维蛋白溶解分析结果支持了以下假设：与健康正常凝块相比，糖化凝块在纤溶酶减少的情况下裂解速率较低。然而，该结果并未对含有正常浓度纤溶酶的糖化凝块的裂解速率提供确凿证据。因此可以得出结论：对于纤溶酶浓度正常的糖尿病患者，可能存在足够的纤维蛋白溶解...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
PBS	Life Technologies	10010031
Ficoll-Paque（亲水性多糖）	GE Healthcare	45-001-749
10 ml 肝素抗凝真空采血管	BD Biosciences	366643
人纤维蛋白原	Enzyme Research Laboratories	N/A
Alexa Fluor 488 标记的人纤维蛋白原偶联物	Molecular Probes	F13191
0.5 ml 带刻度微量离心管	Fisher Scientific	05-408-120
葡萄糖粉末	Life Technologies	15023-02
FXIIIa	Enzyme Research Laboratories	N/A
VIS 共聚焦显微镜	Zeiss LSM 510	LSM 510
50 mM Tris	Lonza	S50-642
氯化钙（CaCl2）	Sigma Aldrich	449709-10G
Vybrant DiD 细胞标记溶液	Life Technologies	L7781
纤溶酶	Enzyme Research Laboratories	N/A
氯化钠（5 M NaCl）	Life Technologies	AM9759
统计建模软件	IBM	SPSS Statistics 22