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方法文章

实时分析代谢谱 离体 小鼠肠道隐窝类器官培养

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DOI：

10.3791/52026

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2014年11月3日

 , 
1Department of Medicine, Albert Einstein College of Medicine, 2Department of Cell Biology, Albert Einstein College of Medicine

本文内容

摘要

培养的小肠隐窝类器官 离体 提供一种组织培养系统，该系统可重现依赖于干细胞及其微环境的隐窝生长。我们建立了一种在原代小鼠隐窝类器官中实时检测代谢谱的方法。我们发现类器官能够维持由其来源所决定的生理特性。

摘要

小肠黏膜呈现出一种重复性的结构，由两种基本构造组成：绒毛和隐窝。绒毛突向肠腔，由成熟的肠上皮细胞、杯状细胞和肠内分泌细胞构成；隐窝则位于黏膜下层和肌层附近，包含成体干细胞、祖细胞、成熟的潘氏细胞，以及隐窝微环境中的间质细胞和免疫细胞。直到最近几年， 体外 小肠的研究以往仅限于源自良性和恶性肿瘤的细胞系，无法代表正常肠上皮的生理特性及其所处微环境的影响。本文中，我们展示了一种改进自Sato的方法 等 (2009) 用于培养源自 C57BL/6 小鼠的原代小鼠肠隐窝类器官。此外，我们介绍了利用隐窝类器官培养系统通过测定基础耗氧量、糖酵解速率、ATP 生成量和呼吸能力，实时分析隐窝代谢特征的方法。类器官保留了其来源所决定的特性，并通过耗氧率和细胞外酸化率反映出其代谢适应性的部分特征。在此隐窝类器官培养体系中进行的实时代谢研究，是探讨隐窝类器官能量代谢及其受营养和药理因素调控机制的有力工具。

引言

结直肠癌（CRC）是美国癌症相关死亡的第三大原因。散发性结肠癌——即在较晚年龄（>50岁）发生且无明确遗传易感因素的结肠癌——约占所有病例的80%，其发病率受长期饮食模式的显著影响1,2。这类肿瘤表现出向依赖有氧糖酵解的代谢转变，即所谓的瓦博格效应（Warburg effect），该效应可能通过谷氨酰胺分解（glutaminolysis）部分地为细胞提供更高浓度的生物合成前体和能量，从而支持甚至驱动肿瘤细胞的高速增殖3-5。对结肠癌以及其他胃肠道癌症（包括小肠癌）的研究为揭示肿瘤形成的原因提供了重要线索。探究胃肠道器官系统在正常、促肿瘤形成及肿瘤形成状态之间的代谢差异，有助于评估肿瘤发生的相对风险以及早期发现肿瘤病变。此外，了解涉及线粒体呼吸和糖酵解的生物能量代谢，将为细胞生理、衰老和疾病状态如何干扰肠道稳态提供基础性认识。利用细胞外通量分析的生物能量测定技术，可实时同步评估培养细胞中线粒体呼吸和糖酵解的速率6,7。

直到最近， 体外 对小肠的研究仅限于源自良性或恶性肿瘤的细胞系8,9 且不能代表正常肠上皮的生理状态及其所处微环境的影响。2009年，Sato 等.10 引入了一种 离体 用于培养三维小鼠肠上皮类器官（或上皮“迷你肠道”）的培养系统，适用于实验、诊断和治疗研究10,11此外，从热量限制小鼠中分离出的隐窝在类器官培养中仍保持其改变的生长特性12与转化细胞系相比，隐窝类器官培养可用于生成具有生理相关性的数据，提供更理想的模型来理解 体内 状态

我们将生物能量学分析技术用于检测肠道隐窝类器官的能量代谢。小鼠肠道隐窝类器官被培养 离体 为开展隐窝类器官能量代谢研究，检测了隐窝类器官在有无两种不同代谢抑制剂（寡霉素、鱼藤酮）及一种离子载体（羰基氰-p-三氟甲氧基苯腙）存在条件下的氧消耗率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR）。这些化合物对隐窝类器官的代谢影响通过ECAR和OCR数值的变化得以成功反映。

细胞能量代谢研究将阐明代谢状态与癌症、肥胖症、糖尿病、代谢紊乱及线粒体疾病等疾病的发病风险和表型之间的相互作用，并有助于推进具有转化医学直接意义的筛查方法。本文中，我们描述了一种分离小肠隐窝并培养隐窝类器官的详细方案。此外，我们介绍了一种利用隐窝类器官培养物进行代谢检测的新方法。

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方案

本研究严格遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》中的建议进行。实验方案已获阿尔伯特·爱因斯坦医学院动物实验伦理委员会批准。

1. 隐窝分离与培养

  1. 从小肠中分离隐窝：
    1. 从任何感兴趣的 小鼠模型 中分离肠隐窝。使用 CO2 随后进行颈椎脱位处死。
    2. 沿纵向切开腹部，用冰冻的磷酸盐缓冲液（PBS，不含钙）灌注小肠（SI）2+；-Mg2+) 加入2倍抗生素-抗真菌剂（anti-anti）。迅速分离小肠。
    3. 使用解剖刀彻底去除肠系膜脂肪。操作时注意勿穿破组织，全程保持组织被冰冻 PBS 浸润。沿纵轴切开肠道，并用冰冻 PBS 充分冲洗。
    4. 将小肠切成两段，用湿润的棉签展平，用预冷的载玻片轻轻刮取绒毛。用冰冻的磷酸盐缓冲液剧烈冲洗数次。
    5. 在每 20 ml 含 3 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）/0.5 mM 二硫苏糖醇（DTT）的 1× PBS 中孵育 3 分钟，以进行组织的非酶解离。
    6. 使用剃刀在预冷的载玻片上将组织切成小块（2–4 mm）。将组织块转移至含有20 ml冰浴PBS的50 ml离心管中。
    7. 使用10 ml无菌一次性移液管轻轻吹打10次。静置，使组织碎片自然沉降。用移液管吸除上清液。重复此步骤三次；确保上清液澄清。
    8. 每 2 mM EDTA 加入 20 ml PBS，轻柔摇晃混匀，于 4 °C 孵育 30 分钟。
    9. 让组织沉淀，弃去上清液。加入15 ml预冷的PBS，用10 ml移液管上下吹打5次。让组织碎片沉淀，收集上清液作为组分1（F1）。重复收集F2–F5，各组分分别保存。
    10. 加入15 ml 冰冷的PBS，用手剧烈振荡15秒。收集F6组分，并对F7、F8重复此操作。若组织碎片开始上浮，轻敲容器以助其沉降。
    11. 在显微镜下检查每份组分的等分试样，合并含有隐窝的组分。
    12. 将合并的组分通过70 µm尼龙细胞滤网过滤，收集隐窝至50 ml离心管中。
    13. 在 4 °C 条件下以 100 × g 离心 5 分钟，弃去上清液，将沉淀重悬于 10 ml 冰冷的含 2× anti–anti 的 PBS 中，将隐窝转移至 15 ml 离心管。重复洗涤一次。
    14. 用10 ml冰冻的ADF（Advanced DMEM/F-12，Dulbecco）洗涤隐窝一次"s 改良伊格尔培养基/哈姆"s F-12) – 2倍青霉素-链霉素双抗溶液。
    15. 用 10 ml ADF – 1x 抗-抗 溶液洗涤隐窝一次。
    16. 使用血细胞计数板对隐窝进行计数。调整隐窝溶液的体积，转移至1.5 ml离心管中，使重悬后的最终隐窝浓度为每50 µl基底膜基质（Matrigel）中含有100–500个隐窝。在4 °C下以100 × g离心5分钟，弃上清，将隐窝重悬于基底膜基质中。
    17. 在24孔板中每孔接种50 µl隐窝-明胶蛋白混合悬液（生长面积：2 cm²）2），小心地将悬液滴加到每个孔的中央。将培养板置于CO₂培养箱中维持。237 °C 培养箱中孵育约 30 分钟，直至悬液凝固。
    18. 加入500 µl预冷的完全培养基（Advanced DMEM/F12，含1×抗-抗，10 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES），1× GlutaMAX，1× B27添加剂，1× N2添加剂，1 mM N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC），50 ng/ml表皮生长因子（EGF），100 ng/ml Noggin，500 ng/ml R-Spondin）。
      1. 用 PBS 中的 0.1% 牛血清白蛋白 (BSA) 重悬生长因子。
  2. 隐窝类器官培养与传代
    1. 接种后14至21天（或根据需要）传代培养隐窝类器官，步骤如下：
      1. 每周五和周一更换培养基。每周三将一半培养基替换为新鲜培养基。
    2. 移除培养基。用500 µl PBS清洗样品，每隔5分钟清洗一次，共清洗两次。
    3. 吸除 PBS，使用无菌的 P1000 微量移液器吸头轻轻搅散胶状蛋白质混合物。
    4. 向单个孔中加入1 ml完全培养基，并用1 ml培养基重悬类器官。
    5. 使用 P1000 移液器轻轻吹打类器官 20–30 次，使其充分解离（在显微镜下观察，确保类器官解离适度且隐窝得率良好，直至掌握稳定的操作技术）。
    6. 将隐窝转移至1.5 ml微量离心管中；在4 °C下以100 x g离心5 min。
    7. 用1 ml完全培养基将沉淀洗涤两次。
    8. 根据需要以1:3或1:6的比例进行分割，每孔用50 µl Matrigel重悬隐窝。后续步骤同上所述（第1.1.16-18节).
  3. 隐窝类器官冻存
    1. 移除培养基。用500 µl PBS洗涤样品。
    2. 使用 P1000 移液器吸头将凝胶状蛋白质混合物分散均匀。
    3. 向单个孔中加入 1 ml 培养基，并用 1 ml 培养基重悬类器官。
    4. 使用 P1000 移液器轻轻吹打类器官 20–30 次以分散。
    5. 将类器官转移至1.5 ml离心管中，在4 °C、100 x g条件下离心5分钟。
    6. 用1 ml完全培养基将沉淀洗涤两次。
    7. 将隐窝重悬于500 µl冻存液中。
    8. 将隐窝转移至冻存管中，将冻存管放入冻存盒，于-80 °C冰箱中过夜保存。
    9. 将隐窝转移至液氮中2 罐
      1. 将冻存的隐窝类器官在37 °C水浴中快速解冻。用500 µl完全培养基洗涤一次，以100 × g离心5分钟，重悬于基质胶蛋白混合物中，并按上述方法进行培养。为提高复苏效率，可在冻存培养基中添加ROCK抑制剂（Y-27632）。

2. 隐窝类器官代谢检测

  1. 24孔板准备：
    1. 根据方案分离并计数隐窝（参见第1.1节进行隐窝分离，第1.2节进行隐窝传代）。
    2. 将隐窝重悬于凝胶状蛋白混合物中（每20 µl含100–200个隐窝）。
    3. 将隐窝-凝胶状蛋白混合物悬液接种至24孔检测板中（确保每个样本至少设三个复孔），并在37 °C、含CO2的培养箱中孵育使其凝固，随后加入500 µl完全培养基。
    4. 培养隐窝（如第1.1节所述），并在显微镜下观察，直至隐窝发育为成熟的类器官。
  2. 细胞外通量检测：
    1. 将检测探针板在无CO2（0% CO2）、37 °C培养箱中水化过夜。
    2. 移除培养基，用500 µl DMEM（不含葡萄糖、L-谷氨酰胺、丙酮酸钠和碳酸氢钠；含酚红）洗涤类器官两次，每次静置5分钟。
    3. 每孔加入675 µl检测培养基（含2 mM L-谷氨酰胺和5 mM D-葡萄糖的DMEM）。
    4. 在显微镜下检查隐窝类器官的形态，确保洗涤后类器官及凝胶状蛋白混合物保持完整。随后在无CO2、37 °C培养箱中孵育1小时。
    5. 用检测培养基配制10 µM的可注射化合物（寡霉素、羰基氰化物-对-三氟甲氧基苯腙（FCCP）、鱼藤酮）。
    6. 按以下顺序将75 µl 10 µM可注射化合物加入检测探针板的加样孔中：A孔—寡霉素；B孔—FCCP；C孔—鱼藤酮（检测过程中终浓度为1 µM）。
    7. 将探针板置于无CO2、37 °C培养箱中孵育30分钟至1小时。
    8. 同时开启XF分析仪，并建立检测方案模板。
    9. 将探针板和辅助板放入XF分析仪中，运行“校准”程序。
    10. 在显微镜下检查隐窝类器官，确保其仍附着于凝胶状蛋白混合物上。
    11. 将细胞培养板装入仪器，运行检测方案。

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结果

类器官源自饲喂纯化啮齿类动物饮食美国营养学会76A（AIN76A）的8月龄C57BL/6小鼠的隐窝。单个隐窝可在体外长期培养形成肠道隐窝类器官（图1A，单个红色箭头）。在培养18-20天后，类器官长出类似隐窝的结构（图1B，红色箭头）。隐窝每3周传代一次，每次传代后类器官均能高效恢复生长。

Seahorse 生物能量学仪器可实时同步评估培养细胞中线粒体呼吸和糖酵解的速率。我们改进了该技术以检测隐窝类器官的代谢。使用来自饲喂 AIN76A 纯化饮食 8 个月小鼠的类器官，我们测定了：1. 氧消耗速率（OCR），如图 2A 所示——红线代表隐窝类器官中的氧消耗速率（pmol/min），蓝色为仅含 Matrigel（明胶样蛋白混合物）的对照孔；2. 细胞外酸化速率（ECAR），如图 2B 所示——红线代表隐窝类器官中的细胞外酸化速率（mpH/min），蓝色为仅含明胶样蛋白混合物的对照孔。

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讨论

我们检测了从8月龄小鼠分离的隐窝细胞培养形成的类器官的氧消耗率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR） 离体 在测定基础速率后，依次加入寡霉素、羰基氰化物-对-三氟甲氧基苯腙（FCCP）和鱼藤酮，评估隐窝代谢。

基础OCR和基础ECAR记录时间为0 - 29分钟（图 2A 和 2B）。在第29th min时，将寡霉素（来自A孔）注入每个孔中（n = 3，隐窝组和对照组孔均包括在内）。寡霉素是一种ATP合成抑制剂，用于阻止状态3（磷酸化）呼吸。因此，寡霉素的注入导致OCR轻微下降，原因是线粒体中的ATP合成被阻断，隐窝转而通过糖酵解满足其ATP需求，从而引起ECAR升高。在第64th 分钟时，将FCCP（来自B孔）注入各孔。FCCP是一种可移动的离子载体，可将氢离子转运通过线粒体膜，导致能量迅速消耗，而无需生成ATP。由于解偶联作用，氧消耗率（OCR）升高；同时，由于隐窝通过糖酵解生成ATP以维持其能量平衡，从而合成并分泌乳酸，导致细胞外酸化率（ECAR）升高...

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致谢

本研究由美国国立卫生研究院资助，资助项目编号为 RO1 CA 135561、R01 CA151494、R01 CA174432 和 P3013330。

我们感谢 Michele Houston、Elena Dhima 和 Anna Velcich 博士在开发隐窝分离方案过程中提供的宝贵意见。

我们还要感谢由美国国立卫生研究院（NIH）P60DK20541项目资助的阿尔伯特·爱因斯坦医学院糖尿病培训与研究中心，以及分别负责指导和运行Seahorse检测平台的Michael Brownlee博士和Xue-Liang Du博士。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
BD Matrigel 基底膜基质，GFR，无酚红，无LDEVBD Biosciences356231
PBS（磷酸盐缓冲盐水），无镁，无钙，pH 7.2Life Technologies20012-027
Advanced DMEM/F-12 (1x)Life Technologies12634-028
Dulbecco′s 改良 Eagle′s 培养基，不含葡萄糖、L-谷氨酰胺、酚红、丙酮酸钠和碳酸氢钠Sigma-AldrichD5030
酚红钠盐Sigma-AldrichP4758在DMEM（D5030）中的终浓度为15 mg/L — 步骤 2.2.2
抗生素-抗真菌剂，100倍浓缩液，100 mlLife Technologies15240-062终浓度为1倍或2倍
青霉素-链霉素溶液Life Technologies15140-122终浓度为1倍
Gibco® GlutaMAX™ 添加剂Life Technologies35050061终浓度为1倍
Gibco® HEPES（N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸），1 MLife Technologies15630-080终浓度为10 mM
N-乙酰-L-半胱氨酸，25 gSigma-AldrichA9165-25G终浓度为1 mM
100倍浓缩N-2添加剂，液体Invitrogen17502-048终浓度为1倍
50倍浓缩B-27® 添加剂（不含维生素A），液体Invitrogen12587-010终浓度为1倍
重组小鼠R-Spondin 1，CF，50 μgR&D Systems3474-RS-050终浓度为500 ng/ml
重组小鼠EGF，100 μgPeprotech315-09终浓度为50 ng/ml
重组小鼠Noggin，20 μgPeprotech250-38终浓度为100 ng/ml
Gibco® L-谷氨酰胺，200 mMLife Technologies25030-081终浓度为2 mM
Gibco® 葡萄糖粉末Life Technologies15023-021终浓度为5 mM
Ambion® 0.5 M EDTA（乙二胺四乙酸），pH 8.0Life TechnologiesAM9260G用于 步骤 1.1.5 时终浓度为3 mM；用于 步骤 1.1.8 时终浓度为2 mM
[header]
DTT（二硫苏糖醇），1 MLife TechnologiesP2325终浓度为3 mM
牛血清白蛋白（BSA）Sigma-AldrichA2058在PBS中浓度为0.1%
胎牛血清（FBS）Life Technologies16000-044在PBS中浓度为1%
Recovery™ 无血清细胞冻存液Life Technologies12648-010
ROCK抑制剂（Y-27632）Sigma-AldrichY0503终浓度为10 μM
寡霉素Sigma-AldrichO4876终浓度为1 μM
羰基氰化物对三氟甲氧基苯腙（FCCP）Sigma-AldrichC2920终浓度为1 μM
鱼藤酮Sigma-AldrichR8875终浓度为1 μM
氢氧化钠Sigma-Aldrich221465在PBS中终浓度为0.1 N
XF24 细胞外通量分析仪（XF Analyzer）Seahorse Bioscience

参考文献

  1. Jemal, A., et al. CA Cancer J Clin. 58, 71-96 (2008).
  2. Slattery, M. L., Boucher, K. M., Caan, B. J., Potter, J. D., Ma, K. N. Eating patterns and risk of colon cancer. Am J Epidemiol. 148, 4-16 (1998).
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  10. Sato, T., et al. Single LGR5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
  11. Sato, T., Clevers, H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 340, 1190-1194 (2013).
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