实时分析代谢谱 离体 小鼠肠道隐窝类器官培养

摘要

培养的小肠隐窝类器官 离体 提供一种组织培养系统，该系统可重现依赖于干细胞及其微环境的隐窝生长。我们建立了一种在原代小鼠隐窝类器官中实时检测代谢谱的方法。我们发现类器官能够维持由其来源所决定的生理特性。

摘要

小肠黏膜呈现出一种重复性的结构，由两种基本构造组成：绒毛和隐窝。绒毛突向肠腔，由成熟的肠上皮细胞、杯状细胞和肠内分泌细胞构成；隐窝则位于黏膜下层和肌层附近，包含成体干细胞、祖细胞、成熟的潘氏细胞，以及隐窝微环境中的间质细胞和免疫细胞。直到最近几年， 体外 小肠的研究以往仅限于源自良性和恶性肿瘤的细胞系，无法代表正常肠上皮的生理特性及其所处微环境的影响。本文中，我们展示了一种改进自Sato的方法 等 (2009) 用于培养源自 C57BL/6 小鼠的原代小鼠肠隐窝类器官。此外，我们介绍了利用隐窝类器官培养系统通过测定基础耗氧量、糖酵解速率、ATP 生成量和呼吸能力，实时分析隐窝代谢特征的方法。类器官保留了其来源所决定的特性，并通过耗氧率和细胞外酸化率反映出其代谢适应性的部分特征。在此隐窝类器官培养体系中进行的实时代谢研究，是探讨隐窝类器官能量代谢及其受营养和药理因素调控机制的有力工具。

引言

结直肠癌（CRC）是美国癌症相关死亡的第三大原因。散发性结肠癌——即在较晚年龄（>50岁）发生且无明确遗传易感因素的结肠癌——约占所有病例的80%，其发病率受长期饮食模式的显著影响^1,2。这类肿瘤表现出向依赖有氧糖酵解的代谢转变，即所谓的瓦博格效应（Warburg effect），该效应可能通过谷氨酰胺分解（glutaminolysis）部分地为细胞提供更高浓度的生物合成前体和能量，从而支持甚至驱动肿瘤细胞的高速增殖^3-5。对结肠癌以及其他胃肠道癌症（包括小肠癌）的研究为揭示肿瘤形成的原因提供了重要线索。探究胃肠道器官系统在正常、促肿瘤形成及肿瘤形成状态之间的代谢差异，有助于评估肿瘤发生的相对风险以及早期发现肿瘤病变。此外，了解涉及线粒体呼吸和糖酵解的生物能量代谢，将为细胞生理、衰老和疾病状态如何干扰肠道稳态提供基础性认识。利用细胞外通量分析的生物能量测定技术，可实时同步评估培养细胞中线粒体呼吸和糖酵解的速率^6,7。

直到最近， 体外 对小肠的研究仅限于源自良性或恶性肿瘤的细胞系^8,9 且不能代表正常肠上皮的生理状态及其所处微环境的影响。2009年，Sato 等.¹⁰ 引入了一种 离体 用于培养三维小鼠肠上皮类器官（或上皮“迷你肠道”）的培养系统，适用于实验、诊断和治疗研究^10,....

方案

本研究严格遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》中的建议进行。实验方案已获阿尔伯特·爱因斯坦医学院动物实验伦理委员会批准。

1. 隐窝分离与培养

1. 从小肠中分离隐窝：
   1. 从任何感兴趣的 小鼠模型 中分离肠隐窝。使用 CO₂ 随后进行颈椎脱位处死。
   2. 沿纵向切开腹部，用冰冻的磷酸盐缓冲液（PBS，不含钙）灌注小肠（SI）²⁺；-Mg²⁺) 加入2倍抗生素-抗真菌剂（anti-anti）。迅速分离小肠。
   3. 使用解剖刀彻底去除肠系膜脂肪。操作时注意勿穿破组织，全程保持组织被冰冻 PBS 浸润。沿纵轴切开肠道，并用冰冻 PBS 充分冲洗。
   4. 将小肠切成两段，用湿润的棉签展平，用预冷的载玻片轻轻刮取绒毛。用冰冻的磷酸盐缓冲液剧烈冲洗数次。
   5. 在每 20 ml 含 3 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）/0.5 mM 二硫苏糖醇（DTT）的 1× PBS 中孵育 3 分钟，以进行组织的非酶解离。
   6. 使用剃刀在预冷的载玻片上将组织切成小块（2–4 mm）。将组织块转移至含有20 ml冰浴PBS的50 ml离心管中。
   7. 使用10 ml无菌一次性移液管轻轻吹打10次。静置，使组织碎片自然沉降。用移液管吸除上清液。重复此步骤三次；确保上清液澄清。
   <....

结果

类器官源自饲喂纯化啮齿类动物饮食美国营养学会76A（AIN76A）的8月龄C57BL/6小鼠的隐窝。单个隐窝可在体外长期培养形成肠道隐窝类器官（图1A，单个红色箭头）。在培养18-20天后，类器官长出类似隐窝的结构（图1B，红色箭头）。隐窝每3周传代一次，每次传代后类器官均能高效恢复生长。

Seahorse 生物能量学仪器可实时同步评估培养细胞中线粒体呼吸和糖酵解的速率。我们改进了该技术以检测隐窝类器官的代谢。使用来自饲喂 AIN76A 纯化饮食 8 个月小鼠的类器官，我们测定了：1. 氧消耗速率（OCR），如图 2A 所示——红线代表隐窝类器官中的氧消耗速率（pmol/min），蓝色为仅含 Matrigel（明胶样蛋白混合物）的对照孔；2. 细胞外酸化速率（ECAR），如图 2B 所示——红线代表隐窝类器官中的细胞外酸化速率（mpH/min），蓝色为仅含明胶样蛋白混合物的对照孔。

讨论

我们检测了从8月龄小鼠分离的隐窝细胞培养形成的类器官的氧消耗率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR） 离体 在测定基础速率后，依次加入寡霉素、羰基氰化物-对-三氟甲氧基苯腙（FCCP）和鱼藤酮，评估隐窝代谢。

基础OCR和基础ECAR记录时间为0 - 29分钟（图 2A 和 2B）。在第29^th min时，将寡霉素（来自A孔）注入每个孔中（n = 3，隐窝组和对照组孔均包括在内）。寡霉素是一种ATP合成抑制剂，用于阻止状态3（磷酸化）呼吸。因此，寡霉素的注入导致OCR轻微下降，原因是线粒体中的ATP合成被阻断，隐窝转而通过糖酵解满足其ATP需求，从而引起ECAR升高。在第64^th 分钟时，将FCCP（来自B孔）注入各孔。FCCP是一种可移动的离子载体，可将氢离子转运通过线粒体膜，导致能量迅速消耗，而无需生成ATP。由于解偶联作用，氧消耗率（OCR）升高；同时，由于隐窝通过糖酵解生成ATP以维持其能量平衡，从而合成并分泌乳酸，导致细胞外酸化率（ECAR）升高.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BD Matrigel 基底膜基质，GFR，无酚红，无LDEV	BD Biosciences	356231
PBS（磷酸盐缓冲盐水），无镁，无钙，pH 7.2	Life Technologies	20012-027
Advanced DMEM/F-12 (1x)	Life Technologies	12634-028
Dulbecco′s 改良 Eagle′s 培养基，不含葡萄糖、L-谷氨酰胺、酚红、丙酮酸钠和碳酸氢钠	Sigma-Aldrich	D5030
酚红钠盐	Sigma-Aldrich	P4758	在DMEM（D5030）中的终浓度为15 mg/L — 步骤 2.2.2
抗生素-抗真菌剂，100倍浓缩液，100 ml	Life Technologies	15240-062	终浓度为1倍或2倍
青霉素-链霉素溶液	Life Technologies	15140-122	终浓度为1倍
Gibco® GlutaMAX™ 添加剂	Life Technologies	35050061	终浓度为1倍
Gibco® HEPES（N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸），1 M	Life Technologies	15630-080	终浓度为10 mM
N-乙酰-L-半胱氨酸，25 g	Sigma-Aldrich	A9165-25G	终浓度为1 mM
100倍浓缩N-2添加剂，液体	Invitrogen	17502-048	终浓度为1倍
50倍浓缩B-27® 添加剂（不含维生素A），液体	Invitrogen	12587-010	终浓度为1倍
重组小鼠R-Spondin 1，CF，50 μg	R&D Systems	3474-RS-050	终浓度为500 ng/ml
重组小鼠EGF，100 μg	Peprotech	315-09	终浓度为50 ng/ml
重组小鼠Noggin，20 μg	Peprotech	250-38	终浓度为100 ng/ml
Gibco® L-谷氨酰胺，200 mM	Life Technologies	25030-081	终浓度为2 mM
Gibco® 葡萄糖粉末	Life Technologies	15023-021	终浓度为5 mM
Ambion® 0.5 M EDTA（乙二胺四乙酸），pH 8.0	Life Technologies	AM9260G	用于 步骤 1.1.5 时终浓度为3 mM；用于 步骤 1.1.8 时终浓度为2 mM
[header]
DTT（二硫苏糖醇），1 M	Life Technologies	P2325	终浓度为3 mM
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma-Aldrich	A2058	在PBS中浓度为0.1%
胎牛血清（FBS）	Life Technologies	16000-044	在PBS中浓度为1%
Recovery™ 无血清细胞冻存液	Life Technologies	12648-010
ROCK抑制剂（Y-27632）	Sigma-Aldrich	Y0503	终浓度为10 μM
寡霉素	Sigma-Aldrich	O4876	终浓度为1 μM
羰基氰化物对三氟甲氧基苯腙（FCCP）	Sigma-Aldrich	C2920	终浓度为1 μM
鱼藤酮	Sigma-Aldrich	R8875	终浓度为1 μM
氢氧化钠	Sigma-Aldrich	221465	在PBS中终浓度为0.1 N
XF24 细胞外通量分析仪（XF Analyzer）	Seahorse Bioscience