利用“货物定位图谱”分析法表征运动性轴突运输货物上分子马达的组成

摘要

囊泡或细胞器等货物的细胞内运输由分子马达蛋白沿极性微管进行。本方案描述了神经元内单个货物颗粒运输方向性与其相关马达蛋白的种类和相对含量之间的关联分析方法。

摘要

要理解分子马达如何协调其活动以在神经元内运输囊泡货物，需要在单个囊泡水平上对马达与货物的关联进行定量分析。本实验方案的目标是利用定量荧光显微镜技术，将活细胞中货物的运动位置和方向性与其所结合的马达蛋白的组成及相对含量进行关联（“映射”）。这种“货物映射”包括：在微流控装置上培养的轴突中，对荧光标记的货物进行活体成像；在记录活体运动过程中进行化学固定；随后使用针对马达蛋白的抗体，对完全相同的轴突区域进行免疫荧光（IF）染色。通过拟合高斯函数至代表单个荧光点源的衍射受限点扩散函数，并为马达和货物通道分配亚像素级的位置坐标，从而评估货物与其相关马达之间的共定位。将固定的货物和马达图像叠加到货物运动轨迹图上，以将其“映射”至已追踪的运动路径。该方案的优势在于结合了活细胞成像与免疫荧光数据，既能记录囊泡货物在活细胞中的运输过程，又能确定与这些完全相同的囊泡所结合的马达蛋白。该技术克服了以往使用生化方法分析纯化的异质性大量囊泡群体平均马达组成的局限性，因为这些方法无法揭示单个运动中货物上的马达组成。此外，本方案还可适用于其他细胞类型中其他运输和/或 trafficking 通路的分析，以关联个别细胞内结构的运动与其蛋白质组成。该方案的局限性在于转染培养的原代神经元效率较低，导致通量相对较低，以及高分辨率成像可用的视野有限。未来的发展方向可能包括提高表达荧光标记货物的神经元数量的方法。

引言

细胞内运输在所有细胞类型中都至关重要，可将蛋白质、膜结构、细胞器和信号分子递送至细胞的不同区域¹。神经元是具有长而极性突起的高度特化细胞，其轴突远端不同微区所需关键货物的长距离运输严重依赖细胞内运输。这一过程由驱动蛋白（kinesins）和动力蛋白（dyneins）介导——这两类分子马达蛋白大家族分别沿极性微管向顺向和逆向方向运输货物。虽然逆向运输主要由动力蛋白介导，但顺向运输则由功能多样、成员众多的驱动蛋白马达家族完成。因此，轴突货物的顺向运输可能由驱动蛋白超家族中的多个成员共同介导^1-5。尽管部分货物在运输过程中持续朝单一方向移动，但大多数货物呈双向移动，并在其到达最终目的地的过程中频繁改变方向^1,5-13。此外，已有研究表明，具有相反运动方向的马达蛋白可同时结合于同一货物上，这引发了一个问题：相反极性的马达如何协调调控货物的定向运动^5-7。综上所述，轴突货物的运输是一个协同过程，受马达蛋白的组成及其特定生化活性的调控，而这些活性又依赖于多种适配蛋白和调控性结合伴侣¹⁴。

为了准确描述特定货物在轴突运输中的作用机制并揭示其运输过程的调控基础，至关重要的是确定在货物活体运输过程中与其相关联的马达蛋白及其调控性结合伴侣的组成。其他方法，例如生物化学方法，仅能提供对纯化后异质性囊泡群体中马达蛋白组成的平均估算，但无法揭示与单个运动囊泡相关联的马达蛋白类型或数量。此外，沿预先组装微管重建囊泡运输 体外 实现了在单个囊泡水平上测量一种类型分子马达的数量¹⁵然而，这些实验并未将马达蛋白的数量与囊泡的运输特性直接关联，并且在缺乏细胞调控因子的情况下测量了运输过程。

本文介绍了一种实验方案，该方案通过免疫荧光（IF）技术检测内源性表达的马达蛋白，确定单个运动囊泡的马达蛋白组成（马达类型及相对含量），并将这些参数与同一囊泡在神经元中的活体运输过程相关联¹⁶。该方法的关键在于实现免疫荧光数据与活体囊泡运动数据的精确定位对应（“映射”）。实验采用已建立的方案^17-19，在微流控装置中培养小鼠海马神经元。这些装置可在固定样本和活体光学显微成像模式下，实现轴突及单个运动囊泡的识别与关联（“映射”）（图1）。培养的神经元被转染表达荧光标记的囊泡蛋白，并在高时空分辨率下成像其运输过程，获得详细的运动信息并绘制为动态图谱（kymograph）。在成像过程中，神经元经多聚甲醛固定后，使用针对内源性马达蛋白的抗体进行染色。将固定的囊泡与马达蛋白图像叠加至活体运动的动态图谱上，以“映射”（共定位）其与活体囊泡运动轨迹的对应关系¹⁶。为将囊泡的活体运动与其关联的马达蛋白进行关联分析，采用一种名为“Motor Colocalization”的自定义MATLAB软件包进行共定位分析^16,20。荧光标记的囊泡与马达蛋白产生的信号为衍射极限下的点状结构，可能部分重叠。为解析重叠点状信号的精确位置，该软件首先自动对每个点扩散函数拟合高斯函数，以确定各个独立荧光点的精确X-Y亚像素坐标位置及其强度幅值^21-23。随后比较马达蛋白与囊泡的位置，判断其共定位情况^16,20。因此，与其它方法相比，该方法能更精确地判定荧光点状信号之间的共定位关系²⁴。

该方法的优势在于能够评估固定细胞中马达蛋白与单个货物之间的共定位，其中已记录了活细胞中的运动轨迹（例如，固定时它们的运动方向）。利用该方法，发现驱动蛋白（kinesins）和动力蛋白（dyneins）可同时与携带正常朊蛋白（PrP^C-cellular）的囊泡相关联，这是一种在轴突中双向移动或保持静止的神经元富集性货物¹⁶。该分析促使提出了一个关于PrP^C囊泡运动调控的工作模型，在该模型中，顺向运输（驱动蛋白）和逆向运输（动力蛋白）的马达通过协调其活性，实现囊泡在任一方向上的移动或在与货物结合时保持静止。该方法的另一优势在于其具有广泛适用的潜力，可用于表征几乎所有细胞类型中多种荧光标记货物与任何其他目的蛋白之间的共定位/结合关系。因此，活细胞与固定细胞的关联分析可能有助于检测瞬时的蛋白质-货物相互作用，因为可在所需时间段内分析大量荧光标记的运动颗粒。鉴于该方法的广泛适用性及其所能解答的问题类型，本实验方案将引起广大细胞生物学家的兴趣，包括研究神经元或其他细胞类型中物质运输与转运的研究人员。

方案

所有实验均按照批准的方案进行，并遵循机构关于实验动物人道护理的指南。新生小鼠通过断头法处死。

1. 细胞培养用微流控装置的制备

1. 按照 Harris 及同事所述方法制备用于培养海马神经元的聚二甲基硅氧烷（PDMS）微流控装置^17-19。以下为针对货物定位实验方案所做的部分修改。
   注意：微流控装置也可从商业途径获得（材料清单），因此无需具备加工设备。
2. 使用丙酮清洗 1½ 号盖玻片（24 × 40 mm）三次，接着用 100% 乙醇清洗三次，再用水清洗三次。将盖玻片储存于 4 °C 水中待用。这些处理步骤有助于确保盖玻片无可能干扰细胞接种、造成污染或影响细胞存活的碎屑残留。
   注意：丙酮和乙醇具有可燃性，若接触皮肤（刺激物）、眼睛（刺激物）、摄入或吸入时具有危害性。应根据官方规定进行处置。
3. 使用前，将每片盖玻片放入 60 mm 细胞培养皿中，每个培养皿对应一个微流控装置，并在生物安全柜中敞口晾干 45 分钟，以避免污染。
4. 当装置从模具上切割下来，并打孔形成储液池后（图 1A, B），将其微流控通道面朝上置于配备紫外灯的生物安全柜中，进行 45 分钟的灭菌处理。
   注意：若紫外照射时间超过 2 小时，可能会影响 PDMS 的完整性。
5. 将每个装置放置于 60 mm 塑料细胞培养皿内的盖玻片上，使微流控通道面朝下，完成装置组装。轻轻按压装置顶部（避免触碰微通道），使装置与盖玻片之间形成非永久性密封。用盖子盖好每个 60 mm 细胞培养皿。
6. 使用移液器，通过向顶部两个微流控储液池（图 1A 中的 1 和 2）加入细胞培养级水进行装置水化，使水流动通过通道。随后用移液器吸除水，并向微流控储液池 1（200 µl）和 2（100 µl）中加入 1 mg/ml 的多聚-L-赖氨酸。体积差将促使多聚-L-赖氨酸流经微通道（图 1A, B）。
7. 为防止 60 mm 细胞培养皿内的装置在 37 °C 培养箱中倾倒，将三个含装置的 60 mm 细胞培养皿放入一个 150 mm 塑料细胞培养皿中，并用盖子盖好。在 37 °C、5% CO₂ 条件下过夜培养。通常每个装置中超过 90% 的通道可用，且无气泡或物理堵塞。
8. 次日，用水替换多聚-L-赖氨酸，并将装置在培养箱中至少静置 1 小时。重复此洗涤步骤三次。吸除水后，向每个装置中加入 Neurobasal-A 生长培养基（含 2% B-27 补充剂和 500 µM GlutaMAX）。在 37 °C、5% CO₂ 条件下过夜培养。
9. 次日，按以下方法接种海马神经元。

2. 在微流控装置中接种小鼠海马原代神经元

注意：新生大鼠海马神经元的培养制备方法此前已在 JoVE 中发表²⁵。以下是一些针对在微流控装置中培养小鼠海马神经元并优化转染效果所采用的改进步骤。

1. 在小鼠脑组织解剖前，将含10%胎牛血清（FBS；不含抗生素）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）、混合液A（500 ml磷酸盐缓冲液（PBS）中含125 mg DL-半胱氨酸、125 mg牛血清白蛋白（BSA）和3.125 g D-葡萄糖；经0.22 µm滤膜过滤除菌）以及脱氧核糖核酸酶I溶液（DNase I：100 ml汉克平衡盐溶液（HBSS）中含50 mg DNase I和0.5 ml 1.2 M MgSO₄溶液，经0.22 µm滤膜过滤除菌）置于37 °C水浴中预热。
   1. 将Neurobasal-A生长培养基置于37 °C、5% CO₂的培养箱中预热，以平衡pH值。
2. 按照既定方案²⁶分离1至3日龄新生小鼠的海马组织。将海马组织置于含有10 ml解剖缓冲液（HBSS含10 mM HEPES pH 7.4、50 mM葡萄糖、100 U/ml青霉素和100 µg/ml链霉素）的15 ml锥形管中，并置于冰上。每支15 ml锥形管中最多放入4个海马组织。
3. 后续操作均需在生物安全柜内无菌条件下进行。
4. 将45单位木瓜蛋白酶溶于5 ml混合液A中，涡旋混匀，于37 °C孵育5分钟至木瓜蛋白酶粉末完全溶解。加入1 ml DNase I溶液。用0.22 µm注射器滤器过滤该混合液。
5. 小心吸除含有海马组织的15 ml锥形管中的HBSS。向海马组织中加入10 ml冷（4 °C）HBSS，并静置使组织沉降至管底。小心吸除15 ml锥形管中的HBSS。
6. 向最多4个海马组织中加入1 ml木瓜蛋白酶/DNase I混合液，于37 °C孵育20–30分钟。每隔5分钟倾斜锥形管一次，使海马组织充分接触混合液。也可将海马组织置于37 °C水浴摇床中，轻柔振荡（约100 rpm）。
7. 吸除木瓜蛋白酶/DNase I混合液，用预热至37 °C、含10% FBS的DMEM洗涤海马组织两次。
8. 第二次洗涤后，向海马组织中加入2 ml预热的含10% FBS的DMEM，使用1 ml移液枪头反复吹打约10–12次，手动进行机械解离以分散神经元。
9. 静置约1分钟，使未完全解离的组织块沉降至锥形管底部。将含有解离神经元的上清液转移至新的15 ml锥形管中，避免转移已沉降的较大组织块。
10. 以1,000 x g离心2分钟，小心吸除上清液，勿扰动细胞沉淀。用80 μl Neurobasal-A生长培养基轻轻吹打重悬细胞。
11. 移除微流控装置储液池1和1’中的培养基。向储液池1中加入20 µl细胞悬液（约275,000个细胞），使其自然流入通道。将装置置于37 °C、5% CO₂培养箱中孵育20分钟。
12. 在显微镜下观察，确认细胞已贴附于盖玻片表面。向所有储液池中补充Neurobasal-A生长培养基至满。将装置连同细胞放回37 °C、5% CO₂培养箱中继续培养。
13. 每隔约2–3天检查装置，并用含2% B-27补充剂（不含GlutaMAX）的Neurobasal-A培养基补充各储液池，防止蒸发。神经元通常在接种后约2–3天开始通过微流控通道延伸轴突。一般在接种后7–10天对神经元进行转染处理。

3. 微流控装置中培养的海马神经元的转染

1. 每个装置中，将 1.2 µl Lipofectamine 2000 与 30 µl Neurobasal-A 混合，同时将 0.5 µg 荧光标记的货物融合质粒与 30 µl Neurobasal-A 混合，室温孵育 5 分钟。将 Lipofectamine 混合液加入 DNA 混合液中，室温孵育 20 分钟。向 DNA/Lipofectamine 混合液中加入 60 µl 含 4% B-27 添加剂的 Neurobasal-A，并通过轻弹管壁混匀。
2. 移除微流控装置 2 和 2’ 中的所有培养基，并小心地用含 2% B-27 添加剂的 Neurobasal-A 填充孔，避免液体溢出至其他区域。
3. 移除微流控装置 1 和 1’ 中的培养基，向微流控装置 1 中加入 120 µl DNA/Lipofectamine 混合液，并使其流动。将装置放回 37 °C、含 5% CO₂ 的培养箱中孵育 3–4 小时。
4. 移除微流控装置 1 和 1’ 中的所有培养基，更换为含 2% B-27 添加剂的 Neurobasal-A，继续培养 24 小时（或直至准备成像）。通常在这些条件下，约有 5–7 根穿过微通道的轴突被成功转染，转染效率约为 1–3%，与已发表的海马神经元培养细胞的转染效率一致²⁶。

4. “货物定位”分析

1. 货物运动的活体成像
   1. 在配备有37 °C培养箱和CO₂控制腔室的倒置落射荧光显微镜上进行成像。
   2. 将生长有海马神经元的盖玻片（置于微流控装置中）安装到显微镜载物台上。为避免神经元死亡，操作应迅速，使样品在显微镜下的停留时间不超过1小时。
   3. 使用高分辨率物镜（100倍），找到穿过微流控腔室通道的转染细胞的轴突，并记录转染轴突所在的通道编号。使用手动计数器统计通道数量。
      1. 为了最佳记录活体运动并进行后续共定位分析，应选择在通道中相对平坦生长的轴突，以便大多数囊泡的成像均处于焦平面内。
   4. 用1 ml塑料移液管从储液池2和2’中移除大部分培养基。为便于后续将固定图像与运动轨迹在明场图（kymograph）上对齐，在成像时将微通道的右边缘与视野对齐（图1B, C）。
   5. 为便于在成像过程中固定样品，建议由两人协作完成活体成像。或者，若由单人操作，则应使用配备漂移校正系统的显微镜。
   6. 根据所分析货物的运输动力学特性，设置特定的时间序列参数，开始活体货物运动的成像（用于成像YFP-PrP^C的显微镜参数和设置详见图2图注及材料清单）。
   7. 在收集到足够的活体运动数据后，由一人向储液池2和2’中加入预热的含0.04 g/ml蔗糖的4%多聚甲醛PBS溶液以固定细胞。操作时避免触碰微流控装置，以免影响活体成像的焦距。另一人应在添加固定液的同时调整焦距。当观察到运动立即停止时，表明固定成功。随后向储液池1和1’中添加固定液。
      注意：货物荧光可能出现暂时性光漂白，但在完成运动蛋白的免疫荧光染色（下一步）后，荧光仍会保留。
      注意：多聚甲醛经吸入、皮肤接触或吞咽有害，对眼睛、呼吸系统和皮肤具有刺激性。应按照官方规定进行处置。
2. 用于共定位分析的运动蛋白免疫荧光染色
   注意：为定量分析与单个运动货物相关联的运动蛋白的相对水平（通过抗体染色确定），需验证并滴定抗体，以确保抗体-抗原结合达到饱和。可通过在目标蛋白被敲除或敲低的神经元中验证抗体特异性，并通过逐步增加抗体浓度进行免疫荧光分析来实现。阴性对照组神经元仅使用二抗染色，不加一抗。有关抗体验证的更详细描述，参见Encalada 等¹⁶ 和 Szpankowski 等²⁰。
   1. 将生长有海马神经元的盖玻片（置于微流控装置中）从显微镜载物台上取下。切勿将微流控装置从盖玻片上剥离，因为微通道必须保持完整，以便将活体图像与固定图像叠加。以下步骤均在湿盒中进行。
   2. 为确保溶液能流入微通道，在后续所有步骤中，维持储液池1、1’与2、2’之间的缓冲液体积差至少为30 µl。例如，向微流控储液池2、2’中加入100 µl培养基，向储液池1、1’中加入70 µl培养基。
   3. 从微流控装置的腔室中移除固定液，并用PBS洗涤细胞三次，每次间隔10分钟。
   4. 向所有储液池中加入用PBS稀释的0.1% Triton X-100，孵育5分钟，以通透细胞。
   5. 移除所有储液池中的溶液，并用PBS洗涤。重复洗涤三次，每次间隔10分钟。
   6. 移除所有储液池中的溶液，加入封闭液（含10%正常驴血清和3%无蛋白酶、无免疫球蛋白G（IgG）的BSA的PBS），室温孵育至少30分钟。
   7. 将一抗原液在20,000 × g下离心5分钟，以去除沉淀物。将抗体用封闭液稀释至适当浓度。用抗体溶液替换微流控装置中的封闭液。室温孵育2小时，或4 °C过夜。
   8. 移除所有储液池中的溶液，并用PBS洗涤三次，每次间隔10分钟。
   9. 将二抗原液在20,000 × g下离心5分钟，以去除沉淀物。将抗体用封闭液稀释至适当浓度。用二抗溶液替换PBS。室温孵育1小时。
   10. 移除所有储液池中的溶液，并用PBS洗涤三次，每次间隔10分钟。
   11. 用移液器直接将约10–20 µl封片剂滴加至连接储液池的通道开口处，替换PBS。让封片剂在室温下干燥约20分钟至1小时。
   12. 将样品置于4 °C避光保存，以防止光漂白，并在染色后两天内（最长不超过一周）完成轴突成像。
   13. 染色完成后，将生长有海马神经元的盖玻片（置于微流控装置中）重新安装到显微镜载物台上。定位步骤4.1.1–4.1.7中成像的转染轴突区域。
   14. 使用高分辨率物镜（例如，高数值孔径油镜或水镜），对三个通道（货物、运动蛋白1、运动蛋白2）分别采集Z轴层扫图像（步长300 nm）。
       注意：采集Z轴层扫图像非常重要，因为轴突在微通道中通常并非完全平坦生长，因此并非所有荧光斑点均处于同一焦平面。
3. 货物定位映射
   1. 使用图像分析软件生成货物运动的明场图（kymograph）。推荐使用Rietdorf和Seitz（EMBL）开发的ImageJ插件生成明场图（下载信息见 材料清单）。
      注意：ImageJ是由美国国立卫生研究院开发的基于Java的公共领域图像处理程序^27,28（下载信息见材料清单）。
   2. 使用商业绘图软件（材料清单），通过将固定后的荧光货物图像（步骤4.2.14生成）手动叠加至明场图中固定时刻的轨迹位置，实现图像对齐（图2A, B）。手动对齐时，首先将固定货物图像叠加到明场图上，然后手动选择与明场图中特定轨迹相对应的货物荧光斑点。为获得最佳对齐效果，应选择货物定位最清晰的Z层图像，可使用多个Z层图像。
   3. 对于Z轴层扫图像中的每一幅（货物、运动蛋白1和运动蛋白2；步骤4.2.14生成），使用已建立的算法确定每个荧光斑点的X-Y坐标和强度幅值，该算法通过二维高斯拟合来拟合代表三个通道中每个点光源的点扩散函数^16,20,21（图2D）。
      注意：为获取X-Y坐标，开发了一套名为“Motor Colocalization”的定制MATLAB软件包^16,20，其中集成了Jaqaman、Danuser及其同事开发的高斯拟合算法^21–23。该软件包及详细使用说明可应要求提供。
   4. 对于已映射到明场图中移动或静止轨迹上的各个货物斑点，从“Motor Colocalization”程序的结果中提取其X-Y坐标和强度幅值（这些货物在图2B中被单独标记）。使用步骤4.2.14中采集的多个Z轴层扫图像，以映射位于不同焦平面的更多货物。
   5. 将已映射货物的各个X-Y坐标与相应Z层中各运动蛋白通道的坐标进行比较（图2D）。确定并选择距离货物300 nm半径范围内的运动蛋白X-Y坐标。对于在同一焦平面内具有信号的货物和运动蛋白，使用“Motor Colocalization”软件包确定位于300 nm半径范围内的斑点。

结果

图1展示了用于培养海马神经元的微流控装置的概览（图1A，B）。神经元被接种于储液池1中。微通道的尺寸可阻止细胞体（胞体）扩散至轴突区，而通道的长度则可防止树突突起完全延伸至轴突区。培养约2-3天后，神经元开始通过微通道向轴突区延伸其轴突（图1B，C）。通过荧光显微镜可识别转染后表达正常朊蛋白并标记黄色荧光蛋白的轴突（YFP-PrP^C）（图1C）。使用质粒转染表达荧光标记蛋白时，应验证其正确的亚细胞定位和功能，因为过表达可能因蛋白构象改变而引入实验假象。因此，共定位实验应同时辅以生化共沉淀研究以及内源性表达蛋白的免疫荧光（IF）染色。本研究中所用YFP-PrP^C的行为此前已有验证¹⁶。在瞬时转染的神经母细胞瘤细胞（N2a）中，YFP-PrP^C的表达水平较低，提示瞬时转染不会导致YFP-PrP^C的高水平过表达¹⁶。此外，使用抗PrP^C抗体对转染YFP-Pr...

讨论

本方案可实现运动方向性与 个体 基于荧光标记微管的运动货物颗粒及其相关马达蛋白的类型和相对含量 活体 神经元。此前，轴突囊泡运输货物的完整运动成分是在生化纯化的囊泡和细胞器的异质群体上进行检测的^9,15然而，对运动成分进行表征对于一项 单个 细胞内货物类型的研究一直具有挑战性，原因是难以纯化出均一的囊泡群体。此外，尽管对马达蛋白失速力的测量可提供活跃马达分子数量的估算， 果蝇 胚胎中，尚不清楚运动方向性是否与马达蛋白稳定结合于货物有关，还是与活性马达蛋白快速结合/脱离货物相关¹²因此，本文所述的“货物定位”方案旨在进一步研究活神经元中单个移动货物所关联的马达蛋白类型及其相对数量之间的关系。

要成功获取“货物定位”数据，关键在于：1）以高时间和空间分辨率对货物运动及固定后的免疫荧光信号进行成像；2）在成像过程中立即对样品进行固定；3）对活细胞和固定后的图像中感兴趣区域进行对齐，并将固定后的货物与马达蛋白定位映射到同一图像的运动轨迹图（kymograph）上；4）精确定位...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
聚-L-赖氨酸	Sigma	P5899-20mg
D-MEM（Dulbecco’s 改良 Eagle 培养基），高糖，含 L-谷氨酰胺，不含丙酮酸钠（1x）	Life Technologies	11965092
FBS（胎牛血清）	Life Technologies	10082147
Neurobasal-A 培养基（1x）	Life Technologies	10888022
B-27 无血清添加剂	Life Technologies	10888022
GlutaMAX I 添加剂（100x）	Life Technologies	35050061
HBSS（1x）（Hank’s 平衡盐溶液）	Life Technologies	24020117
DPBS（Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液，不含镁、不含钙）（1x）	Life Technologies	14190250
青霉素/链霉素（100x）	Life Technologies	15140122
Corning cellgro 细胞培养用水	Fisher Scientific	MT46000CM
木瓜蛋白酶	USB Corporation	19925
DL-半胱氨酸盐酸盐	Sigma-Aldrich	C9768
BSA（牛血清白蛋白）	Sigma-Aldrich	A7906
D-葡萄糖	Sigma-Aldrich	G6152
DNA酶 I，II 型	Roche Applied Sciences	10104159001
Lipofectamine 2000	Life Technologies	11668027
16% 电镜级甲醛溶液	Fisher Scientific	50980487	注意：吸入、皮肤接触或吞咽有害。对眼睛、呼吸系统和皮肤有刺激性。应按照官方规定进行处置。
蔗糖	Fisher Scientific	S5-500
HEPES	Sigma	H-3375
正常驴血清	Jackson Immuno Research	017-000-0121
无脂肪酸和IgG的BSA	Jackson Immuno Research	001-000-162
丙酮	Fisher Scientific	BP2403-4
乙醇	Fisher Scientific	BP2818-100
ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂	Life Technologies	P36934
盖玻片 1 1/2，24 × 40 mm	Corning	2980-244
Axis 微流控装置，450 µm	Millipore	AX450
Adobe Photoshop	Adobe
Nikon Eclipse TE2000-U	Nikon
Coolsnap HQ 相机	Roper Scientific
60 mm 细胞培养皿	Fisher Scientific	12-565-95
150 mm 细胞培养皿	Fisher Scientific	12-565-100
所用抗体：
抗驱动蛋白轻链抗体，V-17	Santa Cruz	sc-13362	使用 KLC1-/- 神经元验证特异性（参考文献 16），推荐稀释比例为 1:100。
抗动力蛋白重链 1 抗体，R-325	Santa Cruz	sc-9115	使用针对 DYN1HC1 的 shRNA 验证特异性（参考文献 16），推荐稀释比例为 1:100
Alexa Fluor 568 驴抗兔 IgG 抗体	Life Technologies	A10042	推荐稀释比例为 1:200。
Alexa Fluor 647 驴抗兔 IgG（H+L）抗体	Life Technologies	A31573	推荐稀释比例为 1:200。
Alexa Fluor 568 驴抗山羊 IgG（H+L）抗体	Life Technologies	A11057	推荐稀释比例为 1:200。
Alexa Fluor 647 驴抗山羊 IgG（H+L）抗体	Life Technologies	A21447	推荐稀释比例为 1:200。
插件与宏
ImageJ			http://imagej.nih.gov/ij/index.html.
ImageJ 轨迹图插件			http://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html.