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方法文章

利用“货物定位图谱”分析法表征运动性轴突运输货物上分子马达的组成

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DOI：

10.3791/52029

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2014年10月30日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Experimental Medicine, Dorris Neuroscience Center, The Scripps Research Institute, 2Department of Cellular and Molecular Medicine, University of California San Diego, 3Department of Bioengineering, University of California San Diego, 4Department of Neurosciences, University of California San Diego School of Medicine

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

囊泡或细胞器等货物的细胞内运输由分子马达蛋白沿极性微管进行。本方案描述了神经元内单个货物颗粒运输方向性与其相关马达蛋白的种类和相对含量之间的关联分析方法。

摘要

要理解分子马达如何协调其活动以在神经元内运输囊泡货物，需要在单个囊泡水平上对马达与货物的关联进行定量分析。本实验方案的目标是利用定量荧光显微镜技术，将活细胞中货物的运动位置和方向性与其所结合的马达蛋白的组成及相对含量进行关联（“映射”）。这种“货物映射”包括：在微流控装置上培养的轴突中，对荧光标记的货物进行活体成像；在记录活体运动过程中进行化学固定；随后使用针对马达蛋白的抗体，对完全相同的轴突区域进行免疫荧光（IF）染色。通过拟合高斯函数至代表单个荧光点源的衍射受限点扩散函数，并为马达和货物通道分配亚像素级的位置坐标，从而评估货物与其相关马达之间的共定位。将固定的货物和马达图像叠加到货物运动轨迹图上，以将其“映射”至已追踪的运动路径。该方案的优势在于结合了活细胞成像与免疫荧光数据，既能记录囊泡货物在活细胞中的运输过程，又能确定与这些完全相同的囊泡所结合的马达蛋白。该技术克服了以往使用生化方法分析纯化的异质性大量囊泡群体平均马达组成的局限性，因为这些方法无法揭示单个运动中货物上的马达组成。此外，本方案还可适用于其他细胞类型中其他运输和/或 trafficking 通路的分析，以关联个别细胞内结构的运动与其蛋白质组成。该方案的局限性在于转染培养的原代神经元效率较低，导致通量相对较低，以及高分辨率成像可用的视野有限。未来的发展方向可能包括提高表达荧光标记货物的神经元数量的方法。

引言

细胞内运输在所有细胞类型中都至关重要，可将蛋白质、膜结构、细胞器和信号分子递送至细胞的不同区域1。神经元是具有长而极性突起的高度特化细胞，其轴突远端不同微区所需关键货物的长距离运输严重依赖细胞内运输。这一过程由驱动蛋白（kinesins）和动力蛋白（dyneins）介导——这两类分子马达蛋白大家族分别沿极性微管向顺向和逆向方向运输货物。虽然逆向运输主要由动力蛋白介导，但顺向运输则由功能多样、成员众多的驱动蛋白马达家族完成。因此，轴突货物的顺向运输可能由驱动蛋白超家族中的多个成员共同介导1-5。尽管部分货物在运输过程中持续朝单一方向移动，但大多数货物呈双向移动，并在其到达最终目的地的过程中频繁改变方向1,5-13。此外，已有研究表明，具有相反运动方向的马达蛋白可同时结合于同一货物上，这引发了一个问题：相反极性的马达如何协调调控货物的定向运动5-7。综上所述，轴突货物的运输是一个协同过程，受马达蛋白的组成及其特定生化活性的调控，而这些活性又依赖于多种适配蛋白和调控性结合伴侣14。

为了准确描述特定货物在轴突运输中的作用机制并揭示其运输过程的调控基础，至关重要的是确定在货物活体运输过程中与其相关联的马达蛋白及其调控性结合伴侣的组成。其他方法，例如生物化学方法，仅能提供对纯化后异质性囊泡群体中马达蛋白组成的平均估算，但无法揭示与单个运动囊泡相关联的马达蛋白类型或数量。此外，沿....

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方案

所有实验均按照批准的方案进行，并遵循机构关于实验动物人道护理的指南。新生小鼠通过断头法处死。

1. 细胞培养用微流控装置的制备

  1. 按照 Harris 及同事所述方法制备用于培养海马神经元的聚二甲基硅氧烷（PDMS）微流控装置17-19。以下为针对货物定位实验方案所做的部分修改。
    注意：微流控装置也可从商业途径获得（材料清单），因此无需具备加工设备。
  2. 使用丙酮清洗 1½ 号盖玻片（24 × 40 mm）三次，接着用 100% 乙醇清洗三次，再用水清洗三次。将盖玻片储存于 4 °C 水中待用。这些处理步骤有助于确保盖玻片无可能干扰细胞接种、造成污染或影响细胞存活的碎屑残留。
    注意：丙酮和乙醇具有可燃性，若接触皮肤（刺激物）、眼睛（刺激物）、摄入或吸入时具有危害性。应根据官方规定进行处置。
  3. 使用前，将每片盖玻片放入 60 mm 细胞培养皿中，每个培养皿对应一个微流控装置，并在生物安全柜中敞口晾干 45 分钟，以避免污染。
  4. 当装置从模具上切割下来，并打孔形成储液池后（图 1A, B），将其微流控通道面朝上置于配备紫外灯的生物安全柜中，进行 45 分钟的灭菌处理。
    注意：若紫外照射时间超过 2 小时，可能会影响 PDMS 的完整性。
  5. 将每个装置放置于 60 mm 塑料细胞培养皿内的盖玻片上....

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结果

图1展示了用于培养海马神经元的微流控装置的概览（图1A，B）。神经元被接种于储液池1中。微通道的尺寸可阻止细胞体（胞体）扩散至轴突区，而通道的长度则可防止树突突起完全延伸至轴突区。培养约2-3天后，神经元开始通过微通道将轴突延伸至轴突区（图1B，C）。通过荧光显微镜可识别转染后表达黄色荧光蛋白标记的正常朊蛋白的轴突（YFP-PrPC）（图1C）。使用质粒转染表达荧光标记蛋白时，应验证其正确的亚细胞定位和功能，因为过表达可能因蛋白构象改变而引入实验假象。因此，共定位实验应同时辅以生化共沉淀研究以及内源性表达蛋白的免疫荧光染色（IF）。本研究中所用YFP-PrPC的行为此前已有验证16。在瞬时转染的神经母细胞瘤细胞（N2a）中，YFP-PrPC的表达水平较低，提示瞬时转染不会导致YFP-PrPC的高水平过表达16。此外，使用抗PrPC抗体对转染YFP-Pr.......

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讨论

本方案可实现运动方向性与 个体 基于荧光标记微管的运动货物颗粒及其相关马达蛋白的类型和相对含量 活体 神经元。此前，轴突囊泡运输货物的完整运动成分是在生化纯化的囊泡和细胞器的异质群体上进行检测的9,15然而，对运动成分进行表征对于一项 单个 细胞内货物类型的研究一直具有挑战性，原因是难以纯化出均一的囊泡群体。此外，尽管对马达蛋白失速力的测量可提供活跃马达分子数量的估算， 果蝇 胚胎中，尚不清楚运动方向性是否与马达蛋白稳定结合于货物有关，还是与活性马达蛋白快速结合/脱离货物相关12因此，本文所述的“货物定位”方案旨在进一步研究活神经元中单个移动货物所关联的马达蛋白类型及其相对数量之间的关系。

要成功获取“货物定位”数据，关键在于：1）以高时间和空间分辨率对货物运动及固定后的免疫荧光信号进行成像；2）在成像过程中立即对样品进行固定；3）对活细胞和固定后的图像中感兴趣区域进行对齐，并将固定后的货物与马达蛋白定位映射到同一图像的运动轨迹图（kymograph）上；4）精确定位.......

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢 Ge Yang、Gaudenz Danuser、Khuloud Jaqaman 和 Daniel Whisler 在适应和开发用于定量货物定位分析的软件方面提供的帮助，感谢 Emily Niederst 在制作微流控装置方面的协助。本工作部分由美国国立卫生研究院衰老研究所（NIH-NIA）资助项目 AG032180（资助对象 L.S.B.G.）以及霍华德·休斯医学研究所支持。L.S. 的研究部分得到了美国国立卫生研究院生物信息学培训基金 T32 GM008806 的支持；S.E.E. 受到了达蒙·鲁尼恩癌症研究基金会博士后奖学金、美国国立卫生研究院神经可塑性培训基金 AG000216 以及艾略特医学基金会“衰老研究新学者奖”资助项目的支持；G.E.C. 受到了美国国立卫生研究院国家转化科学促进中心（NIH/NCATS） 1 TL1 奖项 TR001114 和大学科学家成就奖励基金会的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
聚-L-赖氨酸SigmaP5899-20mg
D-MEM（Dulbecco’s 改良 Eagle 培养基），高糖，含 L-谷氨酰胺，不含丙酮酸钠（1x）Life Technologies11965092
FBS（胎牛血清）Life Technologies10082147
Neurobasal-A 培养基（1x）Life Technologies10888022
B-27 无血清添加剂Life Technologies10888022
GlutaMAX I 添加剂（100x）Life Technologies35050061
HBSS（1x）（Hank’s 平衡盐溶液）Life Technologies24020117
DPBS（Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液，不含镁、不含钙）（1x）Life Technologies14190250
青霉素/链霉素（100x）Life Technologies15140122
Corning cellgro 细胞培养用水 Fisher ScientificMT46000CM
木瓜蛋白酶USB Corporation19925
DL-半胱氨酸盐酸盐Sigma-AldrichC9768
BSA（牛血清白蛋白）Sigma-AldrichA7906
D-葡萄糖Sigma-AldrichG6152
DNA酶 I，II 型Roche Applied Sciences10104159001
Lipofectamine 2000Life Technologies 11668027
16% 电镜级甲醛溶液Fisher Scientific50980487注意：吸入、皮肤接触或吞咽有害。对眼睛、呼吸系统和皮肤有刺激性。应按照官方规定进行处置。
蔗糖Fisher ScientificS5-500
HEPESSigmaH-3375
正常驴血清Jackson Immuno Research017-000-0121
无脂肪酸和IgG的BSAJackson Immuno Research001-000-162
丙酮Fisher ScientificBP2403-4
乙醇Fisher ScientificBP2818-100
ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂Life TechnologiesP36934
盖玻片 1 1/2，24 × 40 mmCorning2980-244
Axis 微流控装置，450 µmMilliporeAX450
Adobe PhotoshopAdobe
Nikon Eclipse TE2000-U Nikon
Coolsnap HQ 相机 Roper Scientific
60 mm 细胞培养皿Fisher Scientific12-565-95
150 mm 细胞培养皿Fisher Scientific12-565-100
所用抗体：
抗驱动蛋白轻链抗体，V-17Santa Cruz sc-13362使用 KLC1-/- 神经元验证特异性（参考文献 16），推荐稀释比例为 1:100。
抗动力蛋白重链 1 抗体，R-325Santa Cruz sc-9115使用针对 DYN1HC1 的 shRNA 验证特异性（参考文献 16），推荐稀释比例为 1:100
Alexa Fluor 568 驴抗兔 IgG 抗体Life TechnologiesA10042 推荐稀释比例为 1:200。
Alexa Fluor 647 驴抗兔 IgG（H+L）抗体Life TechnologiesA31573 推荐稀释比例为 1:200。
Alexa Fluor 568 驴抗山羊 IgG（H+L）抗体Life TechnologiesA11057 推荐稀释比例为 1:200。
Alexa Fluor 647 驴抗山羊 IgG（H+L）抗体Life TechnologiesA21447 推荐稀释比例为 1:200。
插件与宏
ImageJ http://imagej.nih.gov/ij/index.html. 
ImageJ 轨迹图插件http://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html.

参考文献

  1. Goldstein, A. Y. N., Wang, X., Schwarz, T. L. Axonal transport and the delivery of pre-synaptic components. Curr. Opin. Neurobiol. 18, 495-503 (2008).
  2. Hirokawa, N. Kinesin and dynein superfamily proteins and the mechanism of organelle transport. Science.

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