本研究详细阐述了利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）快速鉴定细菌的操作流程。鉴定步骤包括质谱数据采集、数据库构建以及后续分析。文中介绍了两种鉴定方法：基于相似性系数的方法和基于生物标志物的方法。
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摘要
摘要
基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF 质谱）已被证明是一种快速且可靠的工具，可用于细菌在属、种甚至某些情况下的菌株水平上的鉴定。尽管已有多种商业软件和开源软件工具被开发用于辅助鉴定，但目前文献中尚未建立通用或标准化的数据分析流程。本文提供了使用 MALDI-TOF 质谱仪进行细菌鉴定的全面且详细的实验演示。质谱数据来源于美国亚利桑那州卡钦纳洞穴（Kartchner Caverns）分离的 15 种不同细菌，这些细菌通过 16S rDNA 测序进行鉴定。在 BioNumerics 7.1 软件中构建了数据库，并对质谱数据进行了后续分析，包括聚类分析、峰匹配以及统计分析。采用从这 15 种细菌中随机选取的盲编码样本进行鉴定验证。本文展示了两种鉴定方法：基于相似性系数的方法和基于生物标志物的方法。结果表明，这两种方法均能将细菌鉴定至种水平。
引言
基质辅助激光解吸/电离飞行时间（MALDI-TOF）质谱法（MS）已被证明是一种快速且可靠的工具，可用于细菌在属、种甚至某些情况下的菌株水平的鉴定1-4。MALDI-TOF MS 可使来自细菌完整细胞或蛋白质提取物的细胞表面、细胞内膜和核糖体的生物分子（通常为蛋白质）电离1,5。所产生的峰形成所分析细菌的特征性图谱或“指纹”1。细菌的鉴定即基于这些质荷比“指纹”。
最常用的两种鉴定策略是基于文库的策略和基于生物信息学的策略1。基于文库的方法通过将未知样本的质谱图与数据库或文库中已知细菌的质谱图进行比对，从而实现鉴定。目前已有多种商业软件（如 BioNumerics、Biotyper 和 SARAMIS 软件包）以及开源工具（如 SpectraBank6）可用于辅助未知样本与参考细菌质谱图之间的比对及相似性量化分析。基于生物信息学的方法通常依赖于细菌的全基因组测序数据进行鉴定。与不涉及特定峰生物学本质识别的基于文库的方法不同，基于生物信息学的方法包含蛋白质鉴定过程1。
近期大多数基于 MALDI 指纹图谱的研究均采用基于数据库的方法来鉴定细菌1。基于数据库的方法需要构建数据库，并比较质谱图之间的相似性。研究表明，多种实验步骤会影响所获得的质谱图，例如培养基3,7....
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方案
注意：来自任何环境的未鉴定细菌可能具有致病性，必须采用适当的生物安全规程谨慎操作。活菌培养操作必须在II级生物安全柜中进行，并遵循生物安全二级（BSL-2）操作规程。有关BSL-2操作规程的更多信息，请参见美国疾病控制与预防中心/国立卫生研究院（CDC/NIH）发布的《微生物学和生物医学实验室生物安全》（"Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories,"）第33–38页。该文件可在线获取，网址为 http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/BMBL.pdf。操作时必须穿戴适当的个人防护装备（PPE），包括实验服/隔离衣、护目镜以及腈类或乳胶手套。应遵循标准的微生物学操作规范与预防措施，并对生物危害性废弃物进行妥善处理。
本实验所用细菌分离自美国亚利桑那州卡钦纳洞穴（Kartchner Caverns）的四种环境，包括干燥的洞穴沉积物、流石、潮湿的洞穴沉积物以及钟乳石滴水处（表1）。所有分离菌株均通过16S rDNA测序鉴定，并保存于含25%甘油的R2B培养基中，置于-80 °C条件下。所有实验均在室温（RT）下完成。
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结果
本示范中构建的数据库包含四个层级，从高到低分别为“所有层级”、“物种”、“生物学重复”和“技术重复”（图1A）。“技术重复”层级包含所有技术重复的预处理后谱图。“生物学重复”和“物种”层级包含组合（汇总）谱图。“所有层级”则包含所有技术重复谱图以及所有组合谱图。
使用代表性峰展示光谱汇总流程，如图1所示。每个成员的质谱以细灰色线条显示，复合光谱以红色线条表示。相邻峰用不同颜色标记，以便于视觉观察（图1B）。
计算并展示了30次重复实验（三次生物学重复，每次包含十次技术重复）的质谱可重复性，结果见表1。其中，Bacillus物种B的可重复性最高，为98.0 ± 1.4；Curvibacter物种的可重复性最低，为89.4 ± 7.8（表1）。
在生物学重复水平上进行的聚类.......
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讨论
本演示展示了利用 MALDI-TOF 质谱技术结合自定义数据库对细菌进行表征与鉴定的详细操作流程。与传统的分子方法（例如 16S rDNA 测序）相比，基于 MALDI-TOF 质谱的指纹图谱法能够更快速地鉴定多种细菌。由于该技术具有良好的稳健性，已被广泛应用于对环境中及临床样本中的细菌、病毒、真菌和酵母进行表征1,14-16。此外，已有报道表明，在某些情况下，MALDI-TOF 质谱可提供更高的分类分辨率1。例如，B. sp. A、B、D 和 E 尽管倾向于聚为一组（图 2），但彼此之间仍可被明确区分，不同 B. sp. 菌株间的谱图相似性低于 80%（图 2）。相比之下，这些分离株的 16S rDNA 序列具有高度相似性，无法用于在物种水平上区分它们。B. sp. B 与 D 的 16S rDNA 序列经多序列比对分析显示相似性达 99%，而 B. sp. A 与 E 相对于 B. sp. B 与 D 的序列相似性分别为 95% 和 .......
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披露
作者 Vranckx 和 Janssens 是 Applied Maths NV 公司的员工，该公司是本视频中所使用数据分析软件的制造商。Applied Maths NV 提供了本视频中重点介绍的部分软件模块，以及与本视频相关的部分出版费用。
致谢
本工作由亚利桑那州立大学跨学科艺术与科学新学院、Applied Maths NV 以及美国国家科学基金会（MCB0604300 号奖项的 ROA 补充资助）提供支持。本文所表达的观点、发现、结论或建议均为作者（们）的观点，不一定反映美国国家科学基金会的观点。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| α-氰基-4-羟基肉桂酸 | ACROS Organics | 163440050 | ≥ 97%，CAS 28168-41-8 |
| Bruker FlexControl 软件 | Bruker Daltonics | 版本 3.0 | |
| Bruker FlexAnalysis 软件 | Bruker Daltonics | 版本 3.0 | |
| Bionumerics 软件 | Applied Maths | 版本 7.1 |
参考文献
- Sandrin, T. R., Goldstein, J. E., Schumaker, S. MALDI TOF MS profiling of bacteria at the strain level: A review. Mass Spectrom Rev. 32 (3), 188-217 (2013).
- Siegrist, T. J., et al.
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重印与许可
