方法文章

利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术及自定义数据库表征独特洞穴环境（美国亚利桑那州卡钦纳洞穴）中的土著细菌

DOI：

10.3791/52064

⸱

2015年1月2日

 ,  ,  , 
1School of Mathematical and Natural Sciences, Arizona State University, 2Applied Maths NV

本文内容

摘要

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本研究详细阐述了利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）快速鉴定细菌的操作流程。鉴定步骤包括质谱数据采集、数据库构建以及后续分析。文中介绍了两种鉴定方法：基于相似性系数的方法和基于生物标志物的方法。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF 质谱）已被证明是一种快速且可靠的工具，可用于细菌在属、种甚至某些情况下的菌株水平上的鉴定。尽管已有多种商业软件和开源软件工具被开发用于辅助鉴定，但目前文献中尚未建立通用或标准化的数据分析流程。本文提供了使用 MALDI-TOF 质谱仪进行细菌鉴定的全面且详细的实验演示。质谱数据来源于美国亚利桑那州卡钦纳洞穴（Kartchner Caverns）分离的 15 种不同细菌，这些细菌通过 16S rDNA 测序进行鉴定。在 BioNumerics 7.1 软件中构建了数据库，并对质谱数据进行了后续分析，包括聚类分析、峰匹配以及统计分析。采用从这 15 种细菌中随机选取的盲编码样本进行鉴定验证。本文展示了两种鉴定方法：基于相似性系数的方法和基于生物标志物的方法。结果表明，这两种方法均能将细菌鉴定至种水平。

引言

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基质辅助激光解吸/电离飞行时间（MALDI-TOF）质谱法（MS）已被证明是一种快速且可靠的工具，可用于细菌在属、种甚至某些情况下的菌株水平的鉴定1-4。MALDI-TOF MS 可使来自细菌完整细胞或蛋白质提取物的细胞表面、细胞内膜和核糖体的生物分子（通常为蛋白质）电离1,5。所产生的峰形成所分析细菌的特征性图谱或“指纹”1。细菌的鉴定即基于这些质荷比“指纹”。

最常用的两种鉴定策略是基于文库的策略和基于生物信息学的策略1。基于文库的方法通过将未知样本的质谱图与数据库或文库中已知细菌的质谱图进行比对，从而实现鉴定。目前已有多种商业软件（如 BioNumerics、Biotyper 和 SARAMIS 软件包）以及开源工具（如 SpectraBank6）可用于辅助未知样本与参考细菌质谱图之间的比对及相似性量化分析。基于生物信息学的方法通常依赖于细菌的全基因组测序数据进行鉴定。与不涉及特定峰生物学本质识别的基于文库的方法不同，基于生物信息学的方法包含蛋白质鉴定过程1。

近期大多数基于 MALDI 指纹图谱的研究均采用基于数据库的方法来鉴定细菌1。基于数据库的方法需要构建数据库，并比较质谱图之间的相似性。研究表明，多种实验步骤会影响所获得的质谱图，例如培养基3,7、培养时间8、样品制备方法3以及所使用的基质9。此外，一些亲缘关系密切的物种和菌株产生的质谱图仅有细微差异。因此，基于数据库的方法需要严格标准化的操作流程，以确保重复实验之间获得高度可重复的质谱图。实验方案中的微小差异可能会影响鉴定效果，尤其是在亚种和菌株水平上的鉴定1,3,10。然而，无论是仪器制造商提供的参考数据库，还是已发表的自建数据库，均未包含数据库构建和/或数据分析流程应用的可视化操作记录。基于此，本研究的目标是开发、应用并展示一套全面且详细的基于数据库的细菌鉴定操作流程，使用 MALDI-TOF MS 技术实现。

在本实验中，采集了从喀斯特环境（美国亚利桑那州卡钦纳洞穴）分离出的15种细菌的质谱数据，并将其导入软件以构建模型数据库。随后利用该模型数据库详细阐述了数据处理与分析流程。最后，从这15种细菌中随机选取盲编码细菌，再次采集其质谱数据，并与模型数据库中的参考谱图进行比对以实现鉴定。结果表明，细菌可通过相似性系数或潜在的生物标志物/峰类别被准确鉴定。

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方案

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注意：来自任何环境的未鉴定细菌可能具有致病性，必须采用适当的生物安全规程谨慎操作。活菌培养操作必须在II级生物安全柜中进行，并遵循生物安全二级（BSL-2）操作规程。有关BSL-2操作规程的更多信息，请参见美国疾病控制与预防中心/国立卫生研究院（CDC/NIH）发布的《微生物学和生物医学实验室生物安全》（"Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories,"）第33–38页。该文件可在线获取，网址为 http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/BMBL.pdf。操作时必须穿戴适当的个人防护装备（PPE），包括实验服/隔离衣、护目镜以及腈类或乳胶手套。应遵循标准的微生物学操作规范与预防措施，并对生物危害性废弃物进行妥善处理。

本实验所用细菌分离自美国亚利桑那州卡钦纳洞穴（Kartchner Caverns）的四种环境，包括干燥的洞穴沉积物、流石、潮湿的洞穴沉积物以及钟乳石滴水处（表1）。所有分离菌株均通过16S rDNA测序鉴定，并保存于含25%甘油的R2B培养基中，置于-80 °C条件下。所有实验均在室温（RT）下完成。

注意：我们建议使用相同的样品制备方法来获取用于数据库构建的质谱数据以及未知样品的质谱数据。已有研究表明，样品制备方法会影响质谱的质量和可重复性3。使用不同的样品制备方法可能导致对未知样品的错误鉴定，尤其是在需要较高分类学分辨率（例如，达到菌株水平）时。

1. 在MALDI靶板上点样

注意：多种获取蛋白质提取物的方案需要使用酸类和有机溶剂，必须依照各物质安全数据表（MSDS）中的指南和信息进行操作。应根据所用化学品的种类和用量穿戴适当的个人防护装备（PPE），具体要求可能有所不同。例如在处理大量有毒、易燃溶剂（如乙腈）以及腐蚀性酸（如甲酸和三氟乙酸）时，必须穿戴实验服/防护服、手套、护目镜和呼吸防护装备。

  1. 取1 µl不含活细胞的蛋白质提取物（采用先前描述的适当方法获得11-13），滴加至不锈钢MALDI靶板上，使其自然干燥。在干燥的蛋白质提取物上覆盖1 µl基质溶液（α-氰基-4-羟基肉桂酸溶液），并使其干燥。
  2. 对每个生物学重复，点样适当数量的技术重复（5至20个技术重复）。此处，每个生物学重复点样10个技术重复，共制备3个生物学重复。
    注意：我们建议在使用蛋白质提取样品制备方法时，采用抛光的MALDI钢制靶板。使用磨砂钢制靶板可能导致样品在各个样品孔之外扩散，造成非预期的样品混合。
  3. 在靶板上滴加1 µl校准标准品，并使其干燥。随后覆盖1 µl基质溶液，再使其干燥。
  4. 在靶板上滴加2 µl基质溶液作为空白对照。

2. 质谱数据采集

  1. 使用配备氮气激光器（λ = 337 nm）并采用 Bruker FlexControl 软件操作的 MALDI-TOF 质谱仪。
  2. 以正离子线性模式采集每张质谱图，累积 500 次激光发射，每次增量为 100 次。将离子源 1 电压设为 20 kV；离子源 2 电压设为 18.15 kV；聚焦透镜电压设为 9.05 kV。请注意，这些参数为仪器特有，其他仪器可能需要调整以获得最佳结果。
  3. 将质荷比范围设为每电荷 2 至 20 kDa，用于自动谱图分析。使用质心峰检测算法。将最低分辨率阈值设为 100 Da。将信噪比（S:N）阈值设为 2。将最低强度阈值设为 100。

3. 数据库构建

  1. 数据库设计
    1. 在 BioNumerics 7.1 中创建一个新的数据库 "新建数据库向导".
    2. 创建光谱实验类型， 例如， Maldi，使用命令在 "实验类型" 面板
    3. 使用以下方法创建层级 "数据库设计面板". 使用以下方法添加新层级 "水平 > 添加新层级…”命令在 "数据库" 菜单中，分别创建“物种”层级、“生物学重复”层级和“技术重复”层级。
  2. 导入和预处理原始质谱数据
    1. 使用 FlexAnalysis 点击将原始质谱数据导出为 .txt 文件 "导出 > 质谱图" 命令在 "文件" 菜单
    2. 将原始质谱数据（.txt 文件）按技术重复的层级导入数据库。
    3. 预处理原始质谱数据。
      1. 导入并重采样（使用二次拟合算法）。
      2. 执行基线减除（使用大小为50个点的滚动圆盘）。
      3. 计算噪声 [连续小波变换（CWT）]，平滑处理（凯撒窗，窗长20个点，beta值为10个点），并进行第二次基线校正（滚动圆盘法，半径为200个点）。
      4. 检测峰 [采用最小信噪比（S:N）为10的小波变换（CWT）]。
    4. 预处理后，保存每张质谱图的特征模式，例如包含峰大小、峰强度、信噪比（S:N）的峰列表， 等等。数据库中。
  3. 创建复合质谱图
    1. 使用预处理后的光谱数据生成复合光谱 "总结……”命令在 "分析" 菜单。选择 "生物学重复" 作为目标水平。
    2. 此处，将同一菌落的10次技术重复的质谱数据合并，以生成该菌落的复合质谱，从而为该分离株在该条件下获得三个复合质谱 "生物学重复" 水平。
    3. 此处，对三个复合谱图进行汇总，以生成该分离株的一个复合谱图 "物种" 水平。
      注意：复合谱图是技术重复样本逐点取平均值得到的。若重复样本与平均谱图的相似性（皮尔逊相关系数）低于95%（默认设置），则将其从复合谱图中剔除。仅当峰在所纳入的重复样本中出现比例达到75%（默认设置）时，才在复合谱图中标注该峰。对于生物学重复样本，上述阈值分别设置为90%和60%。

4. 质谱数据分析

  1. 选择数据库中的条目，然后单击以创建比较 "创建新的比较" 命令在 "比较" 面板
  2. 此处，使用质谱图中的数据 "技术重复" 和/或 "生物学重复" 水平以展示比较和分析。
  3. 基于相似性的聚类分析与多维尺度分析（MDS）
    1. 用颜色创建分组。选择三个生物学复合质谱图，然后单击 "从所选内容创建新组" 命令在 "组别" 菜单中为相应分离株创建一个组，并为这三个质谱自动指定一种颜色。
    2. 或者，使用相应命令通过颜色定义字段状态 "数据库条目" 面板中基于此定义字段的任何分组均使用为该组定义的相同颜色。
    3. 进行聚类分析。点击 "计算聚类分析" 命令在 "聚类" 菜单。在比较设置页面1中，选择 "皮尔逊相关系数" 并保持其他参数为默认设置。在第2页中，选择 "UPGMA"然后点击 "完成".
    4. 使用MDS图获取 "多维尺度分析……”命令在 "统计学" 菜单
  4. 峰匹配
    1. 点击谱图类型 "基质辅助激光解吸电离（MALDI）" 在 "实验" 面板，然后选择 "布局 > 显示图像"谱带以凝胶条带形式展示。
    2. 使用以下方法进行峰匹配 "进行峰匹配" 命令在 "光谱" 菜单
  5. 峰类别的鉴定
    1. 进行主成分分析（PCA）。突出显示 "基质辅助激光解吸电离（MALDI）" 实验类型在 "实验的" 面板并使用 "主成分分析……”命令在 "统计学" 执行 PCA 的菜单。
    2. 进行双向聚类。点击 "统计学 > 基质挖掘”…在 "比较" 窗口。与峰类别匹配的峰强度以不同颜色表示（热图）。

5. 使用自定义数据库进行细菌鉴定

  1. 基于相似性系数的方法
    1. 基于质谱图创建比较并生成系统发育树 "技术重复" 如步骤4.3.3所述，保存该层级的树状图以用于相似性比较。
    2. 选择一个未知的质谱图，然后单击 "分析 > 确定选定条目"识别对话框出现。
    3. 选择 "基于比较" 分类器类型（或已保存的分类器）并单击 "下一步"在下一页中，选择已保存的系统发育树作为参考比对，然后点击 "下一步".
    4. 选择 "基本相似性" 作为鉴定方法，然后单击 "下一步".
    5. 选择 "最大相似性" 作为评分方法。为每个参数输入适当的阈值和最小差异值，然后单击 "下一步".
    6. 计算完成后，识别窗口将出现。在 "结果" 面板中列出了与未知样本匹配度最高的数据库成员。
    7. 保存鉴定项目，并使用以下方法验证鉴定结果 "交叉验证分析" 命令在 "鉴定项目" 面板
  2. 潜在生物标志物检测方法
    1. 定义峰类。在 "基质挖掘" 窗口中，选择具有共同特征的峰组，并将这些峰定义为特定的峰类别（潜在生物标志物） "光谱 > 管理峰型类别……”在 "比较窗口".
    2. 在此，针对全部15个分离株，分别定义各自特异的峰类。
    3. 选择未知物的质谱图，并将这些谱图的峰与前述已定义的峰类别进行匹配。

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结果

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本示范中构建的数据库包含四个层级，从高到低分别为“所有层级”、“物种”、“生物学重复”和“技术重复”（图1A）。“技术重复”层级包含所有技术重复的预处理后谱图。“生物学重复”和“物种”层级包含组合（汇总）谱图。“所有层级”则包含所有技术重复谱图以及所有组合谱图。

使用代表性峰展示的谱图汇总流程如图1所示。每位成员的质谱以细灰色线条表示，复合谱图以红色线条表示。相邻峰用不同颜色标记，以便于视觉观察（图1B）。

计算并展示了30次重复实验（三次生物学重复，每次包含十次技术重复）的质谱可重复性，结果见表1。其中，Bacillus物种B的可重复性最高，为98.0 ± 1.4；Curvibacter物种的可重复性最低，为89.4 ± 7.8（表1）。

在生物学重复水平上进行的聚类...

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讨论

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本演示展示了利用 MALDI-TOF 质谱技术结合自定义数据库对细菌进行表征与鉴定的详细操作流程。与传统的分子方法（例如 16S rDNA 测序）相比，基于 MALDI-TOF 质谱的指纹图谱法能够更快速地鉴定多种细菌。由于该技术具有良好的稳健性，已被广泛应用于对环境中及临床样本中的细菌、病毒、真菌和酵母进行表征1,14-16。此外，已有报道表明，在某些情况下，MALDI-TOF 质谱可提供更高的分类分辨率1。例如，B. sp. A、B、D 和 E 尽管倾向于聚为一组（图 2），但彼此之间仍可被明确区分，不同 B. sp. 菌株间的谱图相似性低于 80%（图 2）。相比之下，这些分离株的 16S rDNA 序列具有高度相似性，无法用于在物种水平上区分它们。B. sp. B 与 D 的 16S rDNA 序列经多序列比对分析显示相似性达 99%，而 B. sp. A 与 E 相对于 B. sp. B 与 D 的序列相似性分别为 95% 和 ...

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披露

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作者 Vranckx 和 Janssens 是 Applied Maths NV 公司的员工，该公司是本视频中所使用数据分析软件的制造商。Applied Maths NV 提供了本视频中重点介绍的部分软件模块，以及与本视频相关的部分出版费用。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本工作由亚利桑那州立大学跨学科艺术与科学新学院、Applied Maths NV 以及美国国家科学基金会（MCB0604300 号奖项的 ROA 补充资助）提供支持。本文所表达的观点、发现、结论或建议均为作者（们）的观点，不一定反映美国国家科学基金会的观点。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
α-氰基-4-羟基肉桂酸ACROS Organics163440050≥ 97%，CAS 28168-41-8
Bruker FlexControl 软件Bruker Daltonics版本 3.0
Bruker FlexAnalysis 软件Bruker Daltonics版本 3.0
Bionumerics 软件Applied Maths版本 7.1

参考文献

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