光遗传学刺激听觉神经

摘要

人工耳蜗（CIs）通过直接电刺激听觉神经来实现听力功能。然而，较差的频率和强度分辨能力限制了人工耳蜗使用者的听力质量。本文介绍了一种在小鼠中对听觉神经进行光遗传学刺激的方法，作为听觉研究及未来人工耳蜗开发的替代策略。

摘要

人工耳蜗（CIs）通过直接电刺激螺旋神经节神经元（SGNs），使大多数植入耳聋患者能够实现开放集言语理解^1-6然而，由于当前人工耳蜗植入体（CIs）中每个电极接触点产生的电流扩散范围较广，会沿耳蜗的音调拓扑轴激活大量螺旋神经节神经元（SGNs），导致声音编码在频率和强度分辨率方面表现较差。^7-9光学刺激被认为是一种可替代电刺激的方法，有望实现对螺旋神经节神经元（SGNs）更精确的空间局限性激活，从而提高编码的频率分辨率。近年来，对螺旋神经节神经元的直接红外照射 耳蜗已被用于诱发听觉神经的反应¹⁰然而，它所需的能量高于电刺激。^10,11 其潜在机制仍不明确¹²本文描述了一种基于光遗传学的方法，利用表达通道视紫红质2（ChR2）的转基因小鼠，通过低强度蓝光刺激螺旋神经节神经元（SGNs）。¹³ 或通过病毒介导表达ChR2变体CatCh¹⁴我们采用微发光二极管（µLEDs）和光纤耦合激光器，通过人工创建的小型开孔（耳蜗造口）或圆窗刺激表达ChR2的螺旋神经节神经元（SGNs）。通过头皮记录光诱发的诱发电位（光遗传听觉脑干反应：oABR），或通过听觉通路的微电极记录来检测反应，并与声学刺激和电刺激的结果进行比较。

引言

根据世界卫生组织的数据，全球有 3.6 亿人患有听力损失。在耳聋患者中，人工耳蜗通过直接对螺旋神经节神经元（SGNs）进行电刺激 使其中大多数能够实现开放性言语理解^1,2,4,5尽管人工耳蜗已在全球超过20万人中植入，成为最成功的感觉神经假体，但目前人工耳蜗驱动的声音编码仍存在局限性。人工耳蜗通过一定数量的电极进行电刺激，每个电极激活听觉神经的特定拓扑区域，从而绕过耳蜗内功能受损的柯蒂氏器。正常听力者能够分辨超过2,000种频率，而目前的人工耳蜗仅使用12至22个频率通道。⁴这是由于每个刺激电极产生的电流广泛流动所致^7,9，激活大量代表不同声音频率的螺旋神经节神经元^8,15这一局限性可通过多极刺激加以改善，但会以更高的功耗为代价。^16,17其对声音强度的输出动态范围也有限，通常低于6-20 dB^4,18因此，提高频率和强度分辨率是提升人工耳蜗性能的重要目标，以改善在噪声环境中的言语识别、语调理解以及音乐感知能力。

刺激听觉神经的另一种方法是光刺激。光可以方便地聚焦，以靶向少量螺旋神经节神经元（SGN），有望实现更好的空间限制，提高频率分辨能力，并扩大动态范围，从而改善强度分辨能力。事实上，在动物模型中，使用红外光进行耳蜗刺激已显示出优异的频率分辨能力^10,11,19。这种刺激方式的一个缺点是，其所需的能量高于电刺激....

方案

本研究中所进行的所有实验均遵循德国实验动物保护法所规定的伦理标准。哥廷根大学动物福利委员会及下萨克森州动物福利办公室已批准本实验。

1. µLED刺激器的制备

1. 对于µLED，首先准备µLED刺激器。使用具有200 × 200 μm有源表面的蓝色LED（µLED，参见材料表）。
2. 将导线焊接到µLED上，然后使用环氧胶对µLED及其连接部分进行封装。将器件放置过夜，使环氧树脂充分固化。
3. 为确保机械稳定性并实现电绝缘，将导线穿过一根细玻璃毛细管（使用外径1 mm的硼硅酸盐毛细管），并在连接处用环氧树脂密封（图1D），以便将毛细管安装在机械操纵器上。
   注意：封装层厚度需权衡——应足够厚以实现良好的电绝缘（避免刺激伪迹），但又不能过厚，以免影响LED在鼓室内的自由移动以及在耳蜗造口处的准确定位。建议制备多个LED备用。
4. 为验证良好的电绝缘性，先准备一个含有0.9% NaCl溶液的培养皿，并将3 根裸露铜线末端浸入液体中。该设置用于模拟带有ABR电极的动物。将导线连接至ABR放大器，再接入示波器。
5. 然后将LED连接至刺激器，并将其完全浸入溶液中。以允许的最大电流驱动LED脉冲（参见步骤3.1.1），持续时间超过20分钟，观察是否存在刺激伪迹。若出现伪迹，则弃用该LED，并尝试更换新的LED。

结果

最佳的耳蜗开窗至关重要，可提高实验成功的概率。这意味着开窗应规则、尺寸小，且未损伤耳蜗内部结构。例如，出血提示血管纹已受损。图1B展示了理想情况的一个良好示例。

利用表达ChR2的转基因小鼠，ChR2在耳蜗内的螺旋神经节神经元（SGNs）中表达（图1C）。通过µLED或激光进行蓝光照射可引出较大的光诱发听觉脑干反应（oABR），其在波形和振幅上均不同于声诱发听觉脑干反应（aABR）。oABR（图1F）的振幅大于aABR（图1E），但与电诱发听觉脑干反应（eABR，图1G）相当。 这可以解释为：与声音诱发的aABR相比，oABR和eABR反映了更多的SGNs被募集和/或SGNs的激活更为同步。

为了引发电听觉脑干反应（eABR），将一种用于啮齿类动物的电子耳蜗（MED-EL）插入圆窗。我们采用双相电流脉.......

讨论

所述实验展示了对螺旋神经节神经元（SGNs）的光遗传学刺激，原则上也可用于刺激内毛细胞和/或外毛细胞，前提是这些细胞表达了视蛋白。这些实验需要极大的耐心和细致操作。如前所述，最关键的步骤是良好的耳蜗开窗/圆窗插入，以及光源适当的位置和方向。

使用ChR2进行光遗传学刺激时存在一定的局限性。在我们的实验中，oABR振幅随光强和脉冲持续时间的增加而增大，但随着刺激频率的升高而减小¹⁵。反应潜伏期也依赖于光强，当刺激强度增加时，潜伏期缩短。我们认为这些反应特性是由ChR2的动力学特性以及螺旋神经节神经元（SGNs）中表达的通道数量所决定的。此外，ChR2在高频率放电时可能导致额外的峰电位、反应失败以及膜电位的累积^27,40。目前已有持续的研究致力于克服这些局限性^32,33。我们近期报道了通过病毒介导在SGNs中表达ChR2变体CatCh¹⁴，该方法降低了对光强的需求，并支持更高频率刺激下的神经元放电³⁹。最近，Boyden实验室报道了一种名为Chronos的通道视紫红质，其具有更.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
乌拉坦	Sigma Aldrich	U2500-100G	麻醉剂
盐酸赛拉嗪	RXV		镇静与镇痛
布托啡诺	Reckitt Benckiser		镇痛剂
Dumont #5 镊子	Fine Science Tools	11251-10	用于夹持硬组织，例如骨组织或材料。切勿用于夹持柔软 delicate 组织
Dumont #5 细型镊子	Fine Science Tools	11254-20	仅用于夹持软组织
精细剪刀 - 锐利	Fine Science Tools	14060-09	切开皮肤并辅助肌肉解剖
Lempert 咬骨钳	Fine Science Tools	16004-16	它们对于轻松去除鼓泡中的骨骼非常有用
473 nm 激光器	长春新产业	MLL-III473	100 mW 固态 473 nm 激光器
激光驱动器	长春新产业	DPSSL MLL 100 mW	TTL 操作的激光驱动器
250 µm 光纤	任何商业产品；例如 Thorlabs	M42L05
声光调制器	Crystal Technology, Inc.	PCAOM 可见光	控制从激光器耦合到光纤中的光量
声光调制器控制器	Crystal Technology, Inc.	160T1-8SAR-24-0.8	控制声光调制器
Solo2 激光功率 &和能量计	Gentec-EO		用于测量LED和光纤耦合激光器的光强
蓝色 µLED	克里	C470UT200	需要构建多个 μLED 设备因容易损坏或隔离效果不佳
TDT 系统	Tucker-Davis Technologies	RZ6-A-P1	可使用任意系统进行刺激生成  展示与数据采集
单束16通道硅探针	Neuronexus	a1x16-5mm-100-177-CM16LP	这些是易损设备，必须小心操作，使用后需进行清洁。
Omnidrill	世界精密仪器公司	503598	进行开颅手术以记录颅内信号并植入参考电极螺钉
微型钻头钢制磨头	任何商业性； 例如 Fine Science Tools	19007-07
自攻骨螺钉	任何商业性； 例如 Fine Science Tools	19010-10	参照螺钉
显微操作仪	任何商业性； 例如 Luigs+Neumann InVivo Unit Junior 4轴		记录探针的定位