土壤采样及昆虫病原线虫（Steinernematidae, Heterorhabditidae）的分离

摘要

昆虫病原线虫是一类栖息于土壤中的线形蠕虫，可寄生多种昆虫。本文展示了利用两种技术从土壤中分离这些线虫的采样方法：昆虫诱捕法用于从土壤样品中回收线虫，改良White诱捕器法则用于从受感染的昆虫尸体中回收线虫。

摘要

昆虫病原线虫（又称EPN）是一类栖息于土壤中的线虫，可寄生多种昆虫。这些线虫属于两个科：斯氏线虫科（Steinernematidae）和异小杆线虫科（Heterorhabditidae）。迄今为止，斯氏线虫科已描述超过70个物种，异小杆线虫科约有20个物种。这类线虫与肠杆菌科（Enterobacteriaceae）细菌形成互利共生关系，二者共同构成一种高效的杀虫复合体，能够杀死多种昆虫物种。

本文重点介绍从土壤中采集昆虫病原线虫（EPN）时最常用的几种技术。本演示文稿的第二部分着重介绍昆虫诱集法，这是一种广泛用于从土壤样品中分离EPN的方法，以及改良的White诱集法，用于从感染的昆虫中回收这些线虫。这些方法和技术是成功在实验室建立EPN培养体系的关键步骤，同时也为将这些线虫作为模式生物用于其他生物学领域研究的各类生物测定实验奠定了基础。本演示文稿中展示的技术对应于S. P. Stock实验室成员所执行和/或设计的方法，以及由不同作者所描述的技术。

引言

许多线虫与昆虫相关，它们与宿主的相互作用从有益到有害不等。本文重点关注一类以昆虫为宿主的病原性线虫，也称为昆虫病原线虫（或EPN）。这类线虫包括两个科：斯氏线虫科（Steinernematidae）和异小杆线虫科（Heterorhabditidae）^11,13。其致病性实际上源于它们与兼性厌氧肠道细菌的共生关系（斯氏线虫与Xenorhabdus细菌共生，异小杆线虫与Photorhabdus细菌共生）²。这些细菌由唯一自由生活的线虫阶段——第三阶段感染性幼虫（又称dauer幼虫、感染性幼虫或IJ）携带，并在土壤中将细菌从一个昆虫宿主传播至另一个宿主。一旦进入昆虫体内，线虫便将细菌释放到昆虫的血淋巴中，引发严重的败血症，从而杀死昆虫宿主。细菌同时降解昆虫的组织，成为线虫的食物来源，使其得以成熟并大量繁殖。通常，昆虫尸体内部会完成一代或两代成虫的发育。最后一世代的子代线虫会以比此前营养关系更为特异的方式重新与少量细菌细胞结合，并在从昆虫尸体移出至土壤的过程中，将这些细菌保留在其肠道内加以培育，以等待下一个可寄生的昆虫宿主^6,11,14 （图1）。

自1927年被发现以来，EPN一直被视为化学杀虫剂的重要替代品，因其能够寄生多种农业害虫昆虫^3,4,5。然而，在过去二十年中，这些线虫及其共生细菌已被认为是研究宿主-微生物相互作用的生物学、生态学和进化特征的一种可塑性模型系统¹⁴。

本演示的目的是展示土壤采样及昆虫病原线虫（EPN）分离最常用的方法与技术。可用于采集土壤样品的工具多种多样，包括：土壤取样器、刮铲、挖坑器、螺旋钻、采样管、手铲等（图2）。

根据研究目的，可采用两种取样策略：a）分层取样，b）随机取样（图3）。分层取样通常用于在特定或划定区域内进行的高强度研究，时间跨度固定。一般做法是划定一条样线，并在该样线上按预定间隔、在一段时间内采集土壤样品（图3A）¹⁵。当研究范围较广时，通常采用随机取样策略。该取样方法已被用于研究大范围地理区域中昆虫病原线虫（EPN）的多样性（图3B）¹²。根据研究重点的不同，可考虑多种影响因素，包括不同海拔、土壤质地和生境类型（例如：农田、森林、牧场、公园、海岸、河岸地带等）。

我们展示了昆虫诱集技术，该方法最初由Bedding和Akhurst¹描述，是一种从土壤样品中回收昆虫病原线虫（EPN）的简单且具有选择性的替代方法。该方法基于一个前提，即线虫的感染期幼虫（IJ阶段）会被昆虫宿主吸引并寄生其体内。该技术也可用于分离其他昆虫病原体，如真菌和细菌^8,10。

我们还展示了改良的White陷阱法，该方法用于从被感染的昆虫宿主中回收线虫后代^7,14。这是一种简便的方法，能够有效回收“洁净”的线虫后代，避免昆虫尸体降解产生的碎片污染。

最后，本文所描述和展示的技术对应于我们实验室构思和/或实施的方法，以及由多位同事和合作者所描述的技术。

方案

1. 土壤样品采集

1. 每个采样点的采样面积应至少覆盖 2 - 4 m²。
2. 采集深度至少为 15 cm 的土壤样品（图 4）。
3. 在该区域内至少随机采集 5 个样品。
4. 每个样品采集 3 个子样品。根据研究目的，可将子样品混合或分别保存。
5. 将每个样品放入塑料袋中。建议使用双层袋以防止样品泄漏（图 4）。
6. 使用防水记号笔标记样品。每个采样点应标注以下信息：采样地点信息（包括地理位置/区域/地点名称及 GPS 坐标）、日期、生境、相关植被、温度、海拔等。
   注意：如适用，应收集和/或记录随样品一同采集到的昆虫或其他无脊椎动物，并进行后续鉴定，它们可能是潜在的 EPN 天然宿主。
7. 在样品之间清洁采样工具，需用清水彻底冲洗和/或使用 70% 乙醇或 0.5% 次氯酸钠溶液进行消毒。
8. 运输过程中将样品保存在冷藏箱中（8 - 15 °C）。
9. 取部分土壤样品用于分析，以获取土壤组成、质地、湿度、电导率或其他所需土壤参数的信息。

2. 从土壤样品中分离线虫：昆虫诱集法

1. 去除任何碎屑（即岩石、木块或树皮、树叶 等等.) 在采集样本时需采取措施，避免与腐生微生物发生污染。
2. 加水湿润土壤，以促进线虫的移动。
   注意：使用喷雾瓶缓慢增加土壤的湿度。
3. 将约200至250毫升湿润土壤放入带盖的洁净塑料容器中。
4. 添加昆虫诱饵。在每个样品的土壤表面放置5至10只昆虫（图5).
5. 用盖子盖好容器，并将容器倒置。
6. 将容器避光保存于室温（通常为 22 - 25 °C）。
7. 每2至3天检查一次容器，并移除死亡的昆虫。
   注意：向每个容器中添加更多健康的昆虫，以进一步诱集土壤样品中的生物。
8. 从容器中移除死亡的昆虫。注意：呈棕色或赭色的虫尸通常被斯氏线虫属（steinernematids）寄生，而呈砖红色至深紫色的虫尸通常被异小杆线虫属（heterorhabditids）寄生。
9. 用无菌水冲洗尸体。
10. 将尸体放入改良的White陷阱中以回收线虫子代（见下文操作步骤）。

3. 从感染尸体中回收线虫：改良的怀特陷阱法

1. 将一个直径为50（或60）mm的培养皿上部放入一个较大的培养皿（100 mm）中。
2. 在较小的培养皿内放入一张圆形滤纸（Whatman #1）。
3. 将昆虫尸体放置在较小培养皿的滤纸上，确保尸体彼此不接触，以避免交叉污染。
4. 在外部较大的培养皿中加入约20 ml无菌蒸馏水。切勿向放置尸体的较小培养皿中加水。
5. 用盖子盖住大培养皿及其内容物（图6）。
6. 对培养皿进行相应标记，标注以下信息：线虫名称（种/分离株）、感染日期（建立感染的日期）和设 trap 日期（即设置诱捕装置的日期）。
7. 将诱捕装置置于室温下，直至感染期幼虫（IJs）出现。该过程所需时间因线虫种类或菌株不同，通常为10至25天。
8. 通过移去诱捕装置中外层的大培养皿，将含有感染期幼虫的水倒入烧杯中以收集线虫。
9. 静置烧杯，使线虫自然沉降到烧杯底部。此过程可能需要几分钟。
10. 小心倾倒上清液，确保线虫保留在烧杯底部。
11. 通过加入更多水并让线虫再次沉降，对线虫进行清洗。此步骤可重复2–3次，直至上清液清澈。
12. 将线虫悬浮液转移至组织培养瓶（250 ml）中，悬浮液浓度控制在每毫升1,000–3,000条线虫。
13. 将含有线虫悬浮液的培养瓶置于冷室或培养箱中，温度保持在10–20 °C。
    注意：需定期检查储存的培养瓶，因为昆虫病原线虫的保存寿命存在差异。通常，斯氏线虫可在无需继代培养的情况下保存6–12个月，而异小杆线虫可能需要更频繁的检查。

结果

土壤样品采集

昆虫病原线虫（EPN）的三龄感染性幼虫是其生活史中唯一自由生活的阶段，存在于土壤中（图1）。因此，采集土壤样本是回收这些线虫的一种非常高效的方法。图4展示了一个土壤剖面图，指示了应采样的深度。保持样本的湿度是线虫存活的关键因素。因此，在将土壤样本运送至实验室的过程中，必须将其保存在塑料袋中，并维持低温环境（图4）。

线虫回收

在自然界中，昆虫被昆虫病原线虫（EPN）自然寄生的概率通常低于3%，除非处于流行暴发期，才可能发现较多被EPN侵染的昆虫样本。因此，利用昆虫诱集土壤样本是提高从自然环境中回收EPN的有效方法。图5展示了土壤诱集技术。本实验中使用了一个250 ml带螺旋盖的塑料容器，将约250 g土壤放入容器中，并在土壤表面添加5–10只G. mellonella幼虫（图5

讨论

本演示是介绍研究侵染性线虫（EPN）及其共生细菌常用技术的两个展示中的第一个。这些技术代表了在实验室中成功建立EPN培养的关键步骤，同时也构成了以EPN作为模式生物进行研究的其他生物测定方法的基础。

多种针对昆虫病原线虫（EPN）的土壤调查表明，其丰度和分布随季节、生境和地理区域的不同而变化^{4, 5,9,15}。土壤质地、含水量、温度以及寄主的可获得性等因素可能在其分布中起关键作用。因此，开展调查前获取初步数据至关重要。样品采集后，应尽快进行处理。若无法立即处理，应将其储存在冷藏室或其他具备温度控制的适当设备中。根据样品来源地的不同，昆虫诱捕容器的储存温度也应有所差异。通常，温带地区的样品采用较低温度（例如，15 °C）储存，而热带地区的样品则考虑使用较高温度（例如，30 °C）储存。

昆虫诱集法是从土壤样品中回收昆虫病原线虫（EPN）最常用的方法。该方法是一种便捷的策略，可在实验室中实现EPN的回收。大蜡螟的末龄幼虫被用于此过程。 Galleria mellon...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Galleria mellonella	Timberline	http://www.timberlinefisheries.com/ProductDetails.asp?ProductCode=WAXLG	用于昆虫诱捕技术
滤纸，55 mm，1号纤维素	Whatman/VWR	28450-048	感染室和White诱捕器组装
60 × 15 mm 培养皿	VWR	25384-092	感染室和White诱捕器组装
100 × 15 mm 培养皿	VWR	25384-088	感染室和White诱捕器组装
ZIPloc塑料袋	Ace Hardware或当地五金店		土壤取样
机械移液器 P1000、P200 μl	VWR	89130-562; 89130-566	感染室和White诱捕器组装
移液器吸头 1000 μl、200 μl	VWR	16466-004 ; 53510	感染室和White诱捕器组装
漂白剂	Ace Hardware或当地五金店		土壤取样，消毒
次氯酸钠	Ace Hardware或当地五金店		土壤取样，消毒
70% 乙醇	AAPER	17212945	土壤取样，消毒
铲子	Ace Hardware或当地五金店	N/A	土壤取样
管状土壤取样器	Accuproducts		土壤取样
土壤探针，长柄	Nupla	PRB4T 69401 Classic	土壤取样
卷尺	Ace Hardware或当地五金店		土壤取样
标志带，多种颜色	Ace Hardware或当地五金店		土壤取样
组织培养瓶	VWR	Falcon, 29185-304	White诱捕器，EPN收集
洗瓶，聚乙烯材质，广口	VWR	16650-107	White诱捕器，EPN收集