为了分析斑马鱼心脏发育过程中的心脏基因表达谱，必须从分离的心脏中提取总RNA。本文介绍了一种通过快速手工解剖斑马鱼胚胎以获取功能性/跳动心脏的方案，从而获得心脏特异性的mRNA。
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本文内容
摘要
摘要
斑马鱼胚胎心脏仅由数百个细胞组成，占整个胚胎的一小部分。因此，为防止心脏转录组被整体胚胎转录组所掩盖，必须收集足够数量的心脏用于后续分析。此外，由于斑马鱼心脏发育进程迅速，心脏采集与RNA提取方法必须快速，以确保样本的均一性。本文介绍一种快速的手动解剖方案，用于从斑马鱼胚胎中收集具有功能（跳动）的心脏。这是后续进行心脏特异性RNA提取、并通过转录组分析（如定量实时聚合酶链式反应，RT-qPCR）测定心脏特异性基因表达水平的必要前提。该方法基于斑马鱼胚胎心脏与其他组织在黏附特性上的差异；通过流体剪切力破坏、逐步过滤以及手动收集转基因荧光标记的心脏，可实现心脏组织与非心脏组织的快速物理分离。
引言
斑马鱼（Danio rerio）因其快速、透明且在体外进行的胚胎发育，以及个体小和存在多种组织特异性表达荧光蛋白的转基因报告品系，被广泛应用于发育生物学中以在活体条件下研究器官发生。in vivo。这种小型脊椎动物特别适用于心脏发育的研究，因为早期斑马鱼胚胎的氧供不依赖于心跳和血流；这些特性使得大量心血管突变体得以被鉴定和表征1,2，目前斑马鱼已成为研究心脏疾病的公认模式生物3。
为了研究胚胎发育过程中的基因表达，通常通过整体原位杂交（whole-mount in situ hybridization, WISH）4、逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）5、微阵列（microarrays）6 或下一代测序技术（RNA-Seq）7 来分析转录本。虽然 WISH 能够在整个胚胎范围内实现基因表达的时空分析，但转录本水平通常通过 RT-qPCR、微阵列或 RNA-Seq 方法进行评估。然而，这些方法需要对特定基因表达谱进行组织富集。
由于斑马鱼胚胎心脏仅占整个胚胎的很小一部分，因此在心脏发育过程中进行转录组研究需要一种分离并富集心脏组织的方案。此外，为了获得具有生理相关性的数据，必须在RNA提取前始终保持心脏组织处于完全功能状态。本文描述了一种从数百个斑马鱼胚胎中快速分离出生理状态正常且仍在跳动的心脏的方案，以高效获取高质量的RNA样本用于后续分析。本方法基于Burns和MacRae于2006年报道的方案8。为富集心脏组织，两种方法均使用了转基因心肌报告品系，并利用了斑马鱼胚胎心脏与其他组织之间不同的黏附特性。简而言之，通过将大量胚胎反复经由狭窄的移液枪头吹打，可同时将心脏从胚胎体部分离出来，并在两个快速过滤步骤中进一步与胚胎碎片分离；随后，通过手工分选出荧光标记的心脏，收集起来用于后续处理。
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方案
本方案遵循德国及柏林州动物护理法规；斑马鱼操作由当地动物保护机构（柏林-勃兰登堡州卫生与社会事务办公室，LaGeSo）监督。
1. 获取斑马鱼胚胎用于心脏提取
- 将心脏报告基因斑马鱼（如 Tg(myl7:EGFP)twu34 转基因品系9）进行杂交，以获得具有心脏特异性 GFP 表达的胚胎。
- 将胚胎置于卵水中，于 28.5 °C 条件下培养至所需胚胎发育阶段10,11。确保收集的胚胎群体在遗传背景和发育阶段上均具有一致性，以减少基因表达的变异。
- 手动去除胚胎的绒毛膜。
2. 斑马鱼胚胎心脏的解剖
注意：所有溶液均需保持在冰上。如果可能，建议分工合作：一人负责从胚胎中解剖心脏，另一人则在荧光体视显微镜下对心脏进行分选。这样可在数小时内处理数百个胚胎。
- 将约100个胚胎转移至1.5 ml离心管中。用三卡因（Tricaine）（E3培养基中含0.16 mg/ml）麻醉胚胎。待胚胎明显麻醉后（不再游动并沉降至管底，但心脏仍在跳动）继续操作。
- 移除三卡因/E3溶液，并用1 ml L-15/10% FBS培养基洗涤胚胎一次，随后置于冰上保存。
注意：L-15/10% FBS培养基在整个解剖过程中至关重要，可维持器官和细胞的活性，直至心脏被转移至RNAlater或Trizol中。 - 向胚胎中加入1 ml L-15/10% FBS培养基，使用圆头凝胶上样枪头上下吹打5–8次，直至卵黄完全破碎。将胚胎以液滴形式逐滴滴加至溶液表面，使液滴破裂，从而轻柔地破碎胚胎。
注意：吹打的强度和次数取决于胚胎的发育阶段，i.e. 发育较晚阶段（e.g. 56 hpf）需要更多次吹打。 - 对首批解剖的胚胎，应在体视显微镜下评估胚胎完整性及心脏解离比例，因为若吹打过轻，部分心脏可能仍附着于胚胎组织上。根据观察结果调整后续解剖操作中的吹打方式。
注意：使用低吸附性移液枪头和微量离心管，以尽量减少心脏黏附于塑料器皿表面。 - 将样品转移至置于50 ml离心管上的100 μm滤器中；用1 ml L-15/10% FBS培养基冲洗1.5 ml离心管，并将冲洗液一并加入滤器，以尽量减少样品损失（部分心脏可能黏附在管壁上）。用1 ml L-15/10% FBS培养基洗涤滤器两次。此步骤中，心脏将穿过滤器并收集于50 ml离心管中。
- 将滤过液转移至置于15 ml离心管上的30 μm滤器中，并用1 ml L-15/10% FBS培养基冲洗滤器一次。在第二次过滤步骤中，心脏被截留在滤器上，而较小的碎片被冲洗除去。
- 将滤器翻转，用连续三次1 ml L-15/10% FBS培养基冲洗，将心脏从滤器中冲出，收集至经1%琼脂糖包被的培养皿中。
- 在荧光体视显微镜下，用镊子手动将GFP阳性心脏与非荧光胚胎碎片（e.g. 晶状体）分离，并将其集中于培养皿中央。按步骤3所述方法收集心脏。
注意：若胚胎 发育超过24 hpf，心脏应仍在跳动，表明组织仍处于生理正常状态。
3. 从解剖的心脏中分离 mRNA
- 在尽可能小的体积中收集心脏例如 10 µl），移液至含有 0.75 ml RNAlater（置于冰上）的 1.5 ml 离心管中。在荧光体视显微镜下观察移液枪头，确认无心脏组织残留。
- 或者，如果荧光显微镜附近配备有化学通风橱，可在通风橱内将收集的心脏转移至Trizol中（注意）。此操作可避免心脏黏附在移液器吸头以及离心过程中可能造成的心脏损失（步骤3.4、3.5和3.7）。将多轮分离获得的心脏汇集至同一含有Trizol的离心管中，随后直接进入步骤3.8。 最终的 体积不应超过原始Trizol体积的10%。
注意：使用Trizol前请阅读其材料安全数据表（MSDS）。应在通风橱中操作Trizol试剂，并穿戴推荐的个人防护装备。避免与皮肤、眼睛和衣物接触。移除所有点火源。 - 将多轮分离得到的心脏组织收集到同一管含RNAlater的离心管中（置于冰上），因为收集的组织量越多，RNA提取效率越高。若总样本体积超过原有RNAlater体积的10%，需另加一管含0.75 ml RNAlater的离心管用于储存（置于冰上）。
- 在 4 °C 条件下以 15,700 x g 离心 20 分钟，使心脏组织沉淀。
- 在荧光体视显微镜下，小心地将尽可能多的上清液转移至含有3 ml L-15/10% FBS培养基的1%琼脂糖包被培养皿中，注意不要扰动离心管底部已沉淀的心脏组织。由于RNAlater的高黏性，最多可能有15%的心脏组织残留在上清液中，需按照步骤3.7所述方法回收。
- 在化学通风橱中，向含有沉淀心脏的离心管中加入0.5 ml Trizol，并置于冰上保存。
- 在荧光显微镜下，将步骤3.5中来自含RNAlater/L-15/10% FBS溶液的1%琼脂糖包被培养皿中的心脏组织转移至另一含有3 ml L-15/10% FBS的1%琼脂糖包被培养皿中，以稀释RNAlater。将心脏组织收集至培养皿中央，用少量液体将其转移至化学通风橱中Trizol内已沉淀的心脏组织管中。
- 将含有心脏组织的1.5 ml离心管在Trizol中涡旋振荡以破碎心脏组织，室温孵育5分钟。
- 在化学通风橱中，加入100 µl 氯仿（注意），充分混匀，将Trizol/氯仿溶液转移至预先在最大转速下离心30秒的1.5 ml预旋PLG管中。室温孵育3分钟。
注意：使用氯仿前请阅读其材料安全数据表（MSDS）。氯仿试剂应在通风橱中操作，并穿戴推荐的个人防护装备。避免与皮肤、眼睛和衣物接触。远离金属、碱类等不相容物质。 - 在 4 °C 条件下以 15,700 x g 离心 15 分钟，然后将水相转移至新的 1.5 ml 离心管中。
- 加入5-10 µg甘油三酯和250 µl预冷（-20 °C）的异丙醇；充分混匀，于-20 °C过夜孵育。
- 在 4 °C 条件下以 15,700 x g 离心 30 分钟，弃去上清液。
- 用1 ml 75%乙醇洗涤沉淀，于4 °C以15,700 x g离心15 min，弃上清液。
- 让乙醇在室温下挥发，干燥沉淀物直至变白（例如 10-15 分钟。
- 加入 20 µl 无 RNase 的 ddH₂O2将O加入沉淀中，55 °C孵育10–15分钟以溶解RNA，随后置于冰上保存。
- 通过吸光度测量评估RNA浓度和纯度。将样品在1%琼脂糖凝胶上电泳以评估RNA完整性。
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结果
本文描述了一项代表性的心脏解剖实验，使用斑马鱼 Tg(myl7:GFP)twu34 转基因品系9，该品系在心肌组织中特异性表达绿色荧光蛋白（GFP）（图1）。我们同时收集了分离的心脏以及来源胚胎，以评估心脏样本的纯度。简言之，将纯合的 Tg(myl7:GFP)twu34 斑马鱼9 与野生型鱼杂交，使所有胚胎心脏均带有GFP标记。将约500个胚胎（56 hpf）转移至1.5 ml离心管中（每管约100个胚胎）（图1A1、1B）。每管样品均按照方案部分（步骤2）及图1A所示方法进行处理。通过反复吹打使心脏释放（图1A2），然后将悬液转移至100 μm滤膜上（图1A3）。较大块的胚胎组织被截留在滤膜上，收集该部分组织并加入Trizol试剂用于RNA提取，以获得“无心脏胚胎”的RNA样本（图1A3）。滤过液中含有心脏，进一步转移至30 μm滤膜上（图1A4），该滤膜可截留心脏及大小相近的组织碎片。将GFP阳性的心脏从滤膜上冲洗下来，收集至经琼脂糖包被的培养皿中（图1A5、1C），在荧光体...
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讨论
本方案可实现斑马鱼胚胎心脏组织的快速富集，用于基因表达分析。心脏特异性RNA样本的产量和质量在很大程度上取决于几个关键步骤：首先，若在方案的每一步中防止心脏组织丢失，则可显著提高样本产量，因为RNA纯化需要足够的起始材料才能成功。其次，样本纯度完全取决于实验操作者，需在培养皿中仔细分选并收集心脏组织，同时严格排除其他组织。第三，样本质量的关键在于限制RNA降解，而RNA降解可能在胚胎破坏后发生；可通过使用细胞培养基以避免细胞死亡，并将样本始终置于冰上以实现有效抑制。一旦心脏组织被转移至RNAlater或Trizol中，RNA降解即被终止。在培养皿中心脏仍保持跳动，有力地证明了分离后的心脏组织在生理状态上保持正常。
我们建议至少从 300 个心脏（i.e. 约 500 个胚胎）开始，由此可安全沉淀足量的 RNA（同时加入 5–10 µg 甘油原）。然而，我们不能排除较少数量的心脏在小规模实验中也可能足够。关键在于必须获得足够量的 RNA，以测定样品的浓度、纯度和完整性。请注意，RNA 含量可能因胚胎的发育阶段和遗传背景而异（e.g. 在具...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢 C. Burns 和 C. McRae 阐述了本纯化方案的基本原理，以及 F. Priller 在我们实验室中对该方法的初步实施。S.A.-S. 获得了德国研究基金会（DFG）海森堡教授职位的支持。本工作得到了 DFG 资助项目 SE2016/7-1 的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 养鱼及采卵设备 | 参见《斑马鱼手册》11 详情 | ||
| 荧光体视显微镜 | |||
| 冷藏型微量离心机 | |||
| 紫外-可见分光光度计 | 例如 Thermo Scientific Nanodrop 2000 | ||
| 核酸电泳槽 | |||
| 直径4厘米的培养皿 Ø，用含1%琼脂糖的E3培养基包被 | |||
| 微量移液器及吸头（P20，P100，P1000） | |||
| 1.5 ml 离心管 | |||
| 15 ml 和 50 ml 离心管 | |||
| Dumont #5 镊子一对 | |||
| ExactaCruz™ 无菌架装圆形凝胶上样吸头，1-200μl | 圣克鲁斯 | sc-201732 | |
| 100 μm 滤器（BD Falcon 100 mm 细胞筛） | BD 生物科学 | 352360 | |
| 30 μm 滤器（预分离滤器-30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| 相锁凝胶，重型，1.5 ml 离心管 | 启动 | 2302810 | |
| 卵水培养基 | 60 μg/ml Instant Ocean 海盐溶于 ddH2O，0.00001% (w/v) 亚甲蓝 | ||
| E3 培养基 | 5 mM NaCl，0.17 mM KCl，0.33 mM CaCl2，0.33 mM MgSO₄4 | ||
| 三卡因（3-氨基苯甲酸乙酯） | Sigma-Aldrich | A-5040 | 4 mg/ml 三卡因储存液，pH 7 |
| 1% 琼脂糖（溶于 E3 培养基） | |||
| 1% 琼脂糖凝胶（TBE 缓冲液配制） | |||
| 莱博维茨´L-15 培养基 | Gibco | 21083-027 | |
| FBS（胎牛血清） | Sigma | F4135 | |
| RNAlater | Ambion | AM7020 | |
| Trizol | Ambion | 1559606 | |
| 糖原 | Invitrogen | 10814-010 | 20 µ克/µl，溶于无RN酶的水中 |
| 氯仿 | |||
| 异丙醇 | |||
| 75% 乙醇（溶于 DEPC 处理的 ddH2O） | |||
| 无核酸酶水或经DEPC处理的灭菌ddH2O | |||
| 核酸上样缓冲液 | |||
| 用于电泳的TBE（Tris/硼酸/EDTA）缓冲液 |
参考文献
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