为了分析斑马鱼心脏发育过程中的心脏基因表达谱，必须从分离的心脏中提取总RNA。本文介绍了一种通过快速手工解剖斑马鱼胚胎以获取功能性/跳动心脏的方案，从而获得心脏特异性的mRNA。
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本文内容
摘要
摘要
斑马鱼胚胎心脏仅由数百个细胞组成，占整个胚胎的一小部分。因此，为防止心脏转录组被整体胚胎转录组所掩盖，必须收集足够数量的心脏用于后续分析。此外，由于斑马鱼心脏发育进程迅速，心脏采集与RNA提取方法必须快速，以确保样本的均一性。本文介绍一种快速的手动解剖方案，用于从斑马鱼胚胎中收集具有功能（跳动）的心脏。这是后续进行心脏特异性RNA提取、并通过转录组分析（如定量实时聚合酶链式反应，RT-qPCR）测定心脏特异性基因表达水平的必要前提。该方法基于斑马鱼胚胎心脏与其他组织在黏附特性上的差异；通过流体剪切力破坏、逐步过滤以及手动收集转基因荧光标记的心脏，可实现心脏组织与非心脏组织的快速物理分离。
引言
斑马鱼（Danio rerio）因其快速、透明且在体外进行的胚胎发育，以及个体小和存在多种组织特异性表达荧光蛋白的转基因报告品系，被广泛应用于发育生物学中以在活体条件下研究器官发生。in vivo。这种小型脊椎动物特别适用于心脏发育的研究，因为早期斑马鱼胚胎的氧供不依赖于心跳和血流；这些特性使得大量心血管突变体得以被鉴定和表征1,2，目前斑马鱼已成为研究心脏疾病的公认模式生物3。
为了研究胚胎发育过程中的基因表达，通常通过整体原位杂交（whole-mount in situ hybridization, WISH）4、逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）5、微阵列（microarrays）6 或下一代测序技术（RNA-Seq）7 来分析转录本。虽然 WISH 能够在整个胚胎范围内实现基因表达的时空分析，但转录本水平通常通过 RT-qPCR、微阵列或 RNA-Seq 方法进行评估。然而，这些方法需要对特定基因表达谱进行组织富集。
由于斑马鱼胚胎心脏仅占整个胚胎的很小一部分，因此在心脏发育过程中进行转录组研究需要一种分离并富集心脏组织的方案。此外，为了获得具有生理相关性的数据，必须在RNA提取前始终保持心脏组织处于完全功能状态。本文描述了....
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方案
本方案遵循德国及柏林州动物护理法规；斑马鱼操作由当地动物保护机构（柏林-勃兰登堡州卫生与社会事务办公室，LaGeSo）监督。
1. 获取斑马鱼胚胎用于心脏提取
- 将心脏报告基因斑马鱼（如 Tg(myl7:EGFP)twu34 转基因品系9）进行杂交，以获得具有心脏特异性 GFP 表达的胚胎。
- 将胚胎置于卵水中，于 28.5 °C 条件下培养至所需胚胎发育阶段10,11。确保收集的胚胎群体在遗传背景和发育阶段上均具有一致性，以减少基因表达的变异。
- 手动去除胚胎的绒毛膜。
2. 斑马鱼胚胎心脏的解剖
注意：所有溶液均需保持在冰上。如果可能，建议分工合作：一人负责从胚胎中解剖心脏，另一人则在荧光体视显微镜下对心脏进行分选。这样可在数小时内处理数百个胚胎。
- 将约100个胚胎转移至1.5 ml离心管中。用三卡因（Tricaine）（E3培养基中含0.16 mg/ml）麻醉胚胎。待胚胎明显麻醉后（不再游动并沉降至管底，但心脏仍在跳动）继续操作。
- 移除三卡因/E3溶液，并用1 ml L-15/10% FBS培养基洗涤胚胎一次，随后置于冰上保存。
注....
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结果
本文描述了一项代表性的心脏解剖实验，使用斑马鱼 Tg(myl7:GFP)twu34 转基因品系9，该品系在心肌组织中特异性表达绿色荧光蛋白（GFP）（图1）。我们同时收集了分离的心脏以及来源胚胎，以评估心脏样本的纯度。简言之，将纯合的 Tg(myl7:GFP)twu34 斑马鱼9 与野生型鱼杂交，使所有胚胎心脏均带有GFP标记。将约500个胚胎（56 hpf）转移至1.5 ml离心管中（每管约100个胚胎）（图1A1、1B）。每管样品均按照方案部分（步骤2）及图1A所示方法进行处理。通过反复吹打使心脏释放（图1A2），然后将悬液转移至100 μm滤膜上（图1A3）。较大块的胚胎组织被截留在滤膜上，收集该部分组织并加入Trizol试剂用于RNA提取，以获得“无心脏胚胎”的RNA样本（图1A3）。滤过液中含有心脏，进一步转移至30 μm滤膜上（图1A4），该滤膜可截留心脏及大小相近的组织碎片。将GFP阳性的心脏从滤膜上冲洗下来，收集至经琼脂糖包被的培养皿中（图1A5、1C），在荧光体.......
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讨论
本方案可实现斑马鱼胚胎心脏组织的快速富集，用于基因表达分析。心脏特异性RNA样本的产量和质量在很大程度上取决于几个关键步骤：首先，若在方案的每一步中防止心脏组织丢失，则可显著提高样本产量，因为RNA纯化需要足够的起始材料才能成功。其次，样本纯度完全取决于实验操作者，需在培养皿中仔细分选并收集心脏组织，同时严格排除其他组织。第三，样本质量的关键在于限制RNA降解，而RNA降解可能在胚胎破坏后发生；可通过使用细胞培养基以避免细胞死亡，并将样本始终置于冰上以实现有效抑制。一旦心脏组织被转移至RNAlater或Trizol中，RNA降解即被终止。在培养皿中心脏仍保持跳动，有力地证明了分离后的心脏组织在生理状态上保持正常。
我们建议至少从 300 个心脏（i.e. 约 500 个胚胎）开始，由此可安全沉淀足量的 RNA（同时加入 5–10 µg 甘油原）。然而，我们不能排除较少数量的心脏在小规模实验中也可能足够。关键在于必须获得足够量的 RNA，以测定样品的浓度、纯度和完整性。请注意，RNA 含量可能因胚胎的发育阶段和遗传背景而异（e.g. 在具.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢 C. Burns 和 C. McRae 阐述了本纯化方案的基本原理，以及 F. Priller 在我们实验室中对该方法的初步实施。S.A.-S. 获得了德国研究基金会（DFG）海森堡教授职位的支持。本工作得到了 DFG 资助项目 SE2016/7-1 的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 养鱼及采卵设备 | 参见《斑马鱼手册》11 详情 | ||
| 荧光体视显微镜 | |||
| 冷藏型微量离心机 | |||
| 紫外-可见分光光度计 | 例如 Thermo Scientific Nanodrop 2000 | ||
| 核酸电泳槽 | |||
| 直径4厘米的培养皿 Ø，用含1%琼脂糖的E3培养基包被 | |||
| 微量移液器及吸头（P20，P100，P1000） | |||
| 1.5 ml 离心管 | |||
| 15 ml 和 50 ml 离心管 | |||
| Dumont #5 镊子一对 | |||
| ExactaCruz™ 无菌架装圆形凝胶上样吸头，1-200μl | 圣克鲁斯 | sc-201732 | |
| 100 μm 滤器（BD Falcon 100 mm 细胞筛） | BD 生物科学 | 352360 | |
| 30 μm 滤器（预分离滤器-30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| 相锁凝胶，重型，1.5 ml 离心管 | 启动 | 2302810 | |
| 卵水培养基 | 60 μg/ml Instant Ocean 海盐溶于 ddH2O，0.00001% (w/v) 亚甲蓝 | ||
| E3 培养基 | 5 mM NaCl，0.17 mM KCl，0.33 mM CaCl2，0.33 mM MgSO₄4 | ||
| 三卡因（3-氨基苯甲酸乙酯） | Sigma-Aldrich | A-5040 | 4 mg/ml 三卡因储存液，pH 7 |
| 1% 琼脂糖（溶于 E3 培养基） | |||
| 1% 琼脂糖凝胶（TBE 缓冲液配制） | |||
| 莱博维茨´L-15 培养基 | Gibco | 21083-027 | |
| FBS（胎牛血清） | Sigma | F4135 | |
| RNAlater | Ambion | AM7020 | |
| Trizol | Ambion | 1559606 | |
| 糖原 | Invitrogen | 10814-010 | 20 µ克/µl，溶于无RN酶的水中 |
| 氯仿 | |||
| 异丙醇 | |||
| 75% 乙醇（溶于 DEPC 处理的 ddH2O） | |||
| 无核酸酶水或经DEPC处理的灭菌ddH2O | |||
| 核酸上样缓冲液 | |||
| 用于电泳的TBE（Tris/硼酸/EDTA）缓冲液 |
参考文献
- Stainier, D. Y., et al. Mutations affecting the formation and function of the cardiovascular system in the zebrafish embryo. Development. 123, 285-292 (1996).
- Chen, J. N., et al. Mutations affecting the cardiovascular ....
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