利用肽阵列鉴定蛋白质-蛋白质相互作用位点

摘要

多肽阵列筛选是一种用于鉴定蛋白质-蛋白质相互作用位点的高通量检测方法。该方法可实现对目标蛋白质多种相互作用的定位，也可用于发现靶向该蛋白质的抑制剂作用位点。本文中，我们描述了一种多肽阵列筛选与分析的实验方案。

摘要

蛋白质-蛋白质相互作用介导了活细胞中的大多数过程，并调控生物体的稳态。蛋白质相互作用的异常可能导致疾病，因此蛋白质相互作用是重要的药物靶点。因此，在分子水平上理解这些相互作用具有重要意义。目前采用多种技术研究蛋白质相互作用，包括从细胞和生化检测到定量生物物理检测等方法，这些实验既可使用全长蛋白质，也可使用蛋白质结构域或肽段。由于肽段易于合成，并且能够特异性地聚焦于特定的相互作用位点，因此是研究蛋白质相互作用的理想工具。肽阵列可用于鉴定两种蛋白质之间的相互作用位点，也可用于筛选能够结合目标蛋白质并具有治疗潜力的肽段，同时还支持高通量的构效关系（SAR）研究。在结合位点鉴定中，典型的肽阵列通常包含来源于一个或多个目标蛋白互作伙伴全长序列的部分重叠的10-20个氨基酸残基的肽段。通过使用少量目标蛋白对肽阵列进行结合筛选，即可快速、简便地鉴定出能够结合的肽段，从而确定其在互作蛋白中的结合位点。

本文介绍了一种利用肽阵列筛选目标蛋白与其相互作用蛋白之间结合位点的实验方案。该肽阵列基于相互作用蛋白的序列并结合其二级结构进行设计。本方案所使用的阵列为INTAVIS Bioanalytical Instruments公司制备的Celluspots阵列。阵列经封闭以防止非特异性结合后，与待研究的蛋白孵育。通过抗体检测可鉴定出与蛋白特异性相互作用位点相对应的结合肽段。

引言

蛋白质-蛋白质相互作用介导了活细胞中的大多数过程。蛋白质相互作用的异常可能导致疾病，因此蛋白质相互作用是重要的药物靶点。因此，在分子水平上理解这些相互作用具有重要意义。目前可通过多种技术研究蛋白质相互作用，这些技术涵盖从细胞和生化检测到定量生物物理检测等方法，且既可使用全长蛋白质，也可使用蛋白质结构域或肽段。肽段是研究蛋白质相互作用的优良工具，因为肽段易于合成，一方面可聚焦于特定的相互作用位点，另一方面可通过高通量方式研究多个蛋白质靶标^1,2。肽阵列筛选是一种快速且易于操作的方法，可在短时间内获得目标蛋白质与大量相互作用伙伴之间相互作用的大量数据³。与其他用于检测和分析蛋白质-蛋白质相互作用的生化或生物物理方法相比，肽阵列筛选所需蛋白质浓度极低，并能检测到非常微弱的结合。肽阵列可用于多种肽-蛋白质相互作用相关应用，例如蛋白质-蛋白质或受体-配体相互作用位点的定位⁴、同源或异源寡聚化界面分析、抗体表位表征⁵、酶活性研究⁶以及高通量构效关系（SAR）研究⁷。有关肽阵列筛选的深入综述，请参见Katz et al. ⁴

目前存在多种类型的肽阵列。制备肽阵列主要有两种合成策略：一种是在将肽固定到固相载体之前先合成肽，另一种是在固相载体上直接合成肽，后者主要采用SPOT技术^4,8。肽通常通过9-芴甲氧羰基（Fmoc）化学法在固相载体上合成⁸。常见的合成方案包括通过肽的N端进行固定（例如，JPT pepstar阵列⁹）和通过C端进行固定（例如，PEPSCAN pepchip阵列¹⁰、JPT pepspot阵列⁹以及INTAVIS celluspot阵列¹¹）⁴。固相载体的种类可以不同，肽与载体偶联的化学方法也随之变化。C端带有半胱氨酸的肽可通过巯基连接至玻璃载片上¹²。肽的N端可通过所连接氨基酸的酯化反应，共价结合到纤维素膜上的羟基基团⁸。

本文介绍了一种利用多肽阵列筛选研究蛋白质-蛋白质相互作用的详细实验方案。我们所使用的阵列为Celluspots阵列，这是一种微阵列，其在由玻璃载片支撑的小型纤维素膜上含有大量点样（最多384个点的重复）。该方法可在单次实验中使用少量蛋白质和抗体，同时获得大量数据。该阵列具有高密度多肽点样，可检测到低亲和力的结合。本研究利用该阵列对STIL-CHFR相互作用进行了定位，该相互作用在调控正常细胞增殖过程中具有重要意义¹³。两种蛋白质之间不受控制的相互作用可能导致癌症的发生。通过定位该相互作用，我们确定了其特异性结合位点及关键结合残基¹⁴。这为设计能够抑制该蛋白质-蛋白质相互作用的理性抑制剂奠定了基础。

方案

1. 设计肽阵列

1. 将目标蛋白的序列分割为部分重叠的10-20个残基的肽段。重叠长度可根据具体实验和实验实验室的资源进行调整，但原则上重叠越长效果越好。在设计肽段时，应考虑蛋白中已知的可能介导相互作用的二级结构元件。
2. 通过商业供应商订购设计好的肽阵列。此处使用通过C端共价结合到阵列上的肽段。

2. 封闭非特异性结合

1. 配制含有0.05% Tween 20的50 mM Tris或磷酸盐缓冲液（TBST/PBST），用定量的HCl或NaOH调节至所需pH值（以确定精确的离子强度），并用NaCl调节至所需离子强度。此处使用pH 7.5和150 mM的离子强度。
2. 在TBST/PBST中配制2.5%（w/v）的脱脂奶粉封闭液。
3. 为防止非特异性结合，将芯片浸入5 ml封闭液中，在摇床中室温孵育2–4小时，或4 ºC过夜。

3. 与蛋白质孵育

1. 首先在室温下，将芯片在摇床上用 5 ml 封闭液洗涤 30 秒，随后再用 5 ml TBST/PBST 洗涤两次，每次 5 分钟。
2. 将洗涤后的芯片与 5 ml 含 2.5% (w/v) 脱脂奶粉的 His 标签蛋白溶液共同孵育，以防止非特异性结合。此处使用 4.5 µM 的蛋白溶液（STIL 500-650），溶于上述封闭液中。
   注意：通常筛选时使用 5–10 µM 的蛋白浓度，但根据蛋白的结合亲和力以及芯片上肽段的局部浓度（合成效率），蛋白浓度可低至 2–3 µM。蛋白所用缓冲液可有所不同，但通常建议使用上述相同的封闭液进行稀释。
3. 将芯片在蛋白溶液中于室温孵育 3–8 小时，或在 4 ºC 下过夜孵育。

4. 抗体孵育

1. 用 5 ml TBST/PBST 洗涤芯片三次。第一次洗涤 30 秒，随后在室温下于摇床上洗涤两次，每次 5 分钟。
2. 将洗涤后的芯片置于孵育缓冲液中，加入5 ml稀释的HRP标记抗体（1:1,500），在室温下于摇床上孵育1小时。该孵育缓冲液的成分及浓度与封闭液相同。抗体可结合目标蛋白或标签。
3. 进行对照实验，检测抗体与芯片上多肽的相互作用，特别是当芯片包含靶蛋白来源的多肽时例如，用于寡聚化研究）可重复相同方案但省略步骤3，即不与蛋白质孵育。
4. 用 5 ml TBST/PBST 洗涤芯片三次。第一次洗涤 30 秒，随后在室温下于摇床上进行两次各 5 分钟的洗涤。

5. 读取芯片阵列

1. 使用ECL化学发光Western印迹底物试剂盒进行化学发光显影。
2. 利用化学发光图像分析仪进行检测。
3. 分析结果。确保阵列上的两个重复样本显示出相同的信号，以保证结果的可靠性。如果已知蛋白互作伙伴的结构，可在其结构中搜索结合肽段并定位结合位点。即使在序列上相距较远的肽段，也可能在蛋白质的三级结构中彼此靠近，从而形成结合位点。

结果

STIL 是一种极为重要的中心体蛋白，它调控正常的细胞分裂和细胞增殖^13,15–19。STIL 与多种蛋白相互作用^18,20,21，其中大多数相互作用通过其位于中部的内在无序区（IDR）介导¹⁴。我们设计了一种由STIL结合蛋白CHFR衍生的多肽组成的阵列。CHFR是一种肿瘤抑制因子，可在有丝分裂应激时被诱导表达²²。由于当时尚不清楚CHFR中STIL结合域的结构，我们按照方案中第1.1步所述，将该蛋白区域划分为长度为15个残基、相互重叠7个残基的多肽片段。我们采用多肽阵列筛选方法鉴定CHFR与STIL之间的结合位点，具体操作如上述方案所述，并在图1中进行了图示。实验使用INTAVIS Celluspot多肽阵列，共包含384个多肽，每个多肽设置两个重复，可提供大量信息，如图2所示。通过该多肽阵列，我们确定了STIL在其结合蛋白CHFR上的结合位点（图3）。阵列中每个黑色斑点代表一个来源于CHFR并能与ST...

讨论

多肽阵列筛选是鉴定靶蛋白在其相互作用伙伴中结合位点的优良工具。该检测方法快速且易于操作，结果可在一至两个工作日内获得。多肽阵列筛选具有高度通用性，可用于多种目的。例如，可用于表征翻译后修饰（如磷酸化）以及鉴定激酶的底物。举例而言：与急性髓系白血病相关的FLT3激酶，可通过多肽阵列筛选发现其磷酸化含酪氨酸（Tyr）的底物多肽⁶。酪氨酸激酶抑制剂帕唑帕尼（pazopanib）和拉帕替尼（lapatinib）的抑制特性也已通过多肽阵列筛选进行测试²³。多肽阵列还可用于鉴定介导蛋白质-蛋白质相互作用的位点。本实验室已利用该方法研究了多个蛋白质实例：例如，利用多肽阵列鉴定了HIV-1 Vif蛋白与细胞A3G蛋白之间的相互作用²⁴；多肽阵列筛选被用于研究抗凋亡BCL-2家族蛋白与促凋亡蛋白ASPP2之间的相互作用²⁵，以及BCL-2家族成员tBID与线粒体蛋白MTCH2的结合²⁶；肌球蛋白IIC结构域间的分子内相互作用也通过多肽阵列筛选进行了分析²⁷。本文中，我们展示了一个利用多肽阵列筛选鉴定STIL-CHFR相互作用...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
肽阵列	INTAVIS 生物分析仪器
His-probe 抗体 (H-3) HRP	Santa Cruz Biotechnology	sc-8036 HRP
EZ-ECL 试剂盒	生物产业	20-500-120
脱脂牛奶	Becton, Dickinson and Company	232100
LAS-3000 相机	富士胶片