纯化不纯：从复杂的动物相关样本中测序宏基因组和宏转录组

摘要

以囊性纤维化气道为例，该论文提出了一套综合性的实验流程，结合宏基因组学和宏转录组学方法，用于表征与动物相关的样本中的微生物和病毒群落。

摘要

高通量测序技术的普及已彻底改变了生物学的众多领域。为了更深入地理解宿主相关的病毒和微生物群落，研究人员开发了一套全面的DNA和RNA提取工作流程。该流程可从单个样本中同时生成病毒和微生物的宏基因组以及宏转录组，用于下一代测序。这些方法的结合可提供关于群落分类学特征及其编码功能的全面视图。所介绍的方法使用囊性纤维化（CF）痰液样本——一种具有挑战性的样本类型，因其极为黏稠，并含有大量黏蛋白、游离的中性粒细胞DNA以及其他未知污染物。此处描述的实验方案针对上述问题进行了优化，能够成功回收病毒和微生物DNA，同时最大限度减少人源DNA的污染。为补充宏基因组学研究，还优化了一项宏转录组学实验流程，用于回收微生物和宿主mRNA，其中核糖体RNA（rRNA）序列含量相对较少。本文提供了数据特征的概述，可作为评估方法成功与否的参考依据。此外，还收集了其他CF痰液样本，以（i）评估单个患者在连续七天内微生物组谱的稳定性，以及（ii）比较宏基因组学方法与基于16S核糖体RNA基因测序方法的一致性。结果表明，在未使用抗生素干扰的情况下，微生物谱的日间波动极小；且常见CF相关细菌的分类谱在低渗裂解（HL）来源DNA构建的16S rDNA文库与宏基因组之间高度相似。然而，由总DNA和HL来源DNA生成的16S rDNA分类谱之间的差异表明，低渗裂解及后续洗涤步骤不仅有助于去除人源DNA，还能去除可能歪曲真实微生物谱的微生物来源的胞外DNA。

引言

过去十年中，通过应用测序技术，已对与人体相关的病毒和微生物群落进行了广泛研究^1,2。这些研究结果促使人们认识到微生物在人类健康与疾病中的重要作用。其中主要推动力来自人类微生物组计划，该计划描述了存在于人体皮肤、口腔腔隙、呼吸道、泌尿生殖道以及胃肠道中的细菌（以及部分古菌）³。通过对健康人呼吸道开展的进一步微生物组研究，包括支气管肺泡灌洗（BAL）^4,5 和鼻咽拭子采样⁴，发现肺部可作为环境采样装置，导致微生物在呼吸道中短暂定植。然而，微生物在受损呼吸道表面的定植可能引发严重且慢性的肺部感染，例如囊性纤维化（CF）患者中所观察到的情况。

囊性纤维化是一种由囊性纤维化跨膜调节因子（CFTR）基因突变引起的致死性遗传病⁶。这些突变导致CFTR蛋白功能缺陷，进而影响上皮细胞顶端表面的跨上皮离子转运。该疾病累及多个器官系统，但大多数病死率和发病率归因于囊性纤维化肺病⁷。囊性纤维化肺部为微生物定植提供了独特的生态系统。离子转运缺陷导致黏液在气道内积聚，形成以静止、富含营养的黏膜表面为锚定点的好氧、微需氧和厌氧微环境。这种环境促进了包括病毒、细菌和真菌在内的微生物定植与增殖。急性和慢性肺部微生物感染引发持续但无效的免疫反应，导致广泛的气道重塑、肺功能下降，最终发展为呼吸衰竭。

囊性纤维化（CF）肺部相关的细菌群落已通过依赖培养和不依赖培养的方法得到了充分描述，这些方法包括16S核糖体RNA（rRNA）基因测序⁸和宏基因组鸟枪法测序^9,10。基于16S rRNA的方法能够表征多种微生物物种，并捕捉群落多样性的广泛变化。然而，该方法在解析群落结构方面的分辨率有限（详见Claesson et al. 2010¹¹的总结），且对代谢潜能的预测仅限于所鉴定分类单元已知的一般功能。因此，16S rRNA基因测序方法在分析CF肺部复杂微生物群落所需的分类学和功能分析精度方面存在不足。本文所述的宏基因组学方法可补充基于16S rRNA的分析，克服其局限性，并提供一种相对高效的方法，用于同时分析CF肺部微生物群落的分类组成和基因内容。

从与动物相关的样本中分离出的微生物DNA通常含有大量宿主DNA。囊性纤维化（CF）痰液或肺组织样本通常含有大量由免疫反应中性粒细胞释放的人源DNA，常占总DNA的99%以上^12–14。尽管可能存在一些完整的宿主细胞，但大部分DNA以游离状态存在于溶液中，或吸附在微生物表面。此外，高度黏稠的黏液栓、细胞碎片以及其他未知污染物的存在，进一步增加了微生物细胞分离的难度。已有多种方法被尝试用于去除样本中的人源DNA，包括使用Percoll梯度离心分离人细胞与微生物细胞¹⁵、DNase I处理、溴化乙锭单叠氮化物选择性降解人源DNA¹⁶，以及MolYsis试剂盒，但效果均有限。迄今为止，针对CF痰液样本最有效的微生物DNA纯化方法是Breitenstein et al.（1995）¹⁷所描述方法的改进版本。该方法在此称为低渗裂解法（hypotonic lysis, HL），结合使用β-巯基乙醇断裂黏蛋白中的二硫键、低渗条件裂解真核细胞，以及DNase I降解游离DNA⁹。尽管尚无更优替代方案，HL方法仍引发了一些担忧：（i）可能因微生物非预期裂解而引入偏差；（ii）观察到的菌群组成波动^9,10是否为样本处理过程中技术变异所导致的人工假象。除构建宏基因组测序文库外，本研究还通过分析同一患者连续七天采集的痰液样本，比较HL法提取的总DNA与微生物DNA的16S rRNA基因谱，以探讨上述问题。

与微生物群落相比，与动物相关的病毒群落特征研究仍较为有限^18,19。囊性纤维化（CF）气道中的病毒群落仅得到初步表征^20–22。首项针对CF气道病毒群落DNA的宏基因组学研究显示，与CF肺部相关的大多数病毒为噬菌体²⁰。CF个体与非CF个体中噬菌体的代谢潜能存在显著差异。具体而言，CF个体中的噬菌体群落携带反映细菌宿主对CF气道生理环境适应性以及细菌毒力相关特征的基因²⁰。后续针对CF肺组织中病毒的宏基因组学研究进一步揭示了不同解剖区域之间病毒群落在空间分布上的显著异质性²²。此外，CF肺组织中病毒多样性为迄今在任何生态系统中观察到的最低水平²²。所鉴定出的大多数病毒为噬菌体，具有感染CF致病菌的潜力。然而，也检测到真核病毒，如疱疹病毒、腺病毒和人乳头瘤病毒（HPV）。在一次解剖过程中观察到肺组织中存在囊肿时，即使该患者从未被诊断患有肺乳头瘤或癌，仍成功回收了超过99%的人乳头瘤病毒基因组。这表明，存在的病毒多样性不仅反映了组织损伤的严重程度，还可能揭示并解释一种尚未被认知的潜在疾病。本文所述方案提供了一种简单而有效的方法，用于从含有大量黏稠黏液、宿主与微生物细胞、游离DNA以及细胞碎片的样本中分离病毒样颗粒（VLPs）。

宏转录组学可补充宏基因组学，用于监测微生物群落及宿主中基因表达的动态变化^9,23。在此情况下，需要优先富集微生物和宿主的mRNA。由于细菌mRNA不具有多聚腺苷酸化结构，因此无法采用基于寡核苷酸-dT的mRNA富集方法。如果已知宿主相关样本中含有大量真核生物mRNA，则也不能使用依赖多聚腺苷酸化的RNA扩增技术。许多与动物相关的样本（包括囊性纤维化痰液）除了含有高浓度的细胞外，还含有大量细胞碎片以及包括RNase在内的核酸酶。因此，另一项具有挑战性的任务是在宏转录组处理过程中防止RNA严重降解。在大多数情况下，从囊性纤维化痰液中提取的总RNA已发生部分降解，限制了后续应用及所获得RNA的利用价值。近年来，已有多种核糖体RNA（rRNA）去除方法被开发并整合到商业试剂盒中。然而，这些方法的效果有限，尤其是在处理部分降解的rRNA时效果更差^9,24。本文所采用的方法能够获得部分降解但仍适用于高效去除总rRNA的总RNA。Lim et al.（2012）通过直接比较两种不同试剂盒在去除部分降解总RNA中的rRNA效率，对此进行了说明⁹。

总体而言，本论文的目标是提供一套完整的实验方案（图1），以诱导痰液样本为例，从单一的宿主相关样本中同时构建病毒和微生物的鸟枪法宏基因组以及宏转录组。分子生物学实验流程应设有独立的扩增前和扩增后操作区域，以最大限度减少交叉污染。本方法可轻松适用于其他类型的样本，如组织²²、鼻咽和口咽拭子²⁵、支气管肺泡灌洗液（BAL）以及珊瑚样本（未发表数据）。尤其在需要开展微生物宏基因组学和宏转录组学研究时，样本应在采集后立即处理。若样本经过冷冻，可能破坏微生物细胞的完整性，从而限制完整微生物细胞的分离，影响微生物宏基因组的构建。然而，冷冻并不完全排除开展宏转录组学研究或病毒分离的可能性，但冻融过程可能影响RNA的质量以及回收病毒颗粒的数量。值得注意的是，在多项与成年囊性纤维化（CF）患者及其他慢性肺部疾病相关的研究中，诱导痰液一直是主要的样本来源^26,27，因为支气管肺泡灌洗可能具有较强侵入性。在我们的研究中，痰液样本采用谨慎且一致的采样方法收集，即，在采集前使用无菌生理盐水漱口并冲洗口腔，以将口腔微生物对痰液样本的污染降至最低。

方案

注意：诱导痰样本由加州大学圣地亚哥分校（UCSD）成人囊性纤维化诊所的研究协调员根据加州大学机构审查委员会（HRPP 081500）和圣地亚哥州立大学机构审查委员会（SDSU IRB#2121）的规定采集。

1. 样本采集与预处理（采集后30分钟内进行样本预处理）

1. 在采集样本前，标记四个15 ml离心管，分别标注为：(i) 病毒宏基因组，(ii) 微生物宏基因组，(iii) 宏转录组，以及 (iv) 额外痰液。每个样本均需重复此步骤。向标记为“宏转录组”的管中加入2 ml 0.1 mm二氧化硅珠，随后加入6 ml基于硫氰酸胍的RNA裂解缓冲液（GITC-裂解缓冲液）。
2. 在样本采集过程中，使用无菌生理盐水（60 ml）进行漱口，以最大限度减少口腔微生物的污染。通过雾化器吸入4 ml 7%高渗盐水后，在30分钟内收集痰液样本。样本需立即处理，具体步骤如下所述。
3. 将样本稀释至总体积8 ml。
   1. 通过在采集样本前后称量空痰杯的重量，估算样本体积。
   2. 若样本体积小于8 ml，加入适量经0.02 μm滤膜过滤的1×PBS，使样本总体积至少达到8 ml。
   3. 立即使用3 ml注射器充分混匀样本，直至痰液中无可见团块。
   4. 使用同一注射器吸取2 ml痰液，并立即进入步骤1.4。
4. 痰液样本中总RNA的保存
   1. 将步骤1.3.4中获得的2 ml痰液样本注入含有二氧化硅珠和GITC-裂解缓冲液的“宏转录组”管中。
   2. 盖紧管盖，并用Parafilm密封，防止泄漏。
   3. 立即以中等速度涡旋震荡10分钟以充分均质化痰液。根据所用涡旋仪的情况，必要时将离心管水平放置并用胶带固定。
   4. 将离心管置于4 °C或冰盒中，必要时运送至实验室。
5. 使用同一注射器，分别将2 ml痰液分装至标记为“病毒宏基因组”和“微生物宏基因组”的离心管中，并将痰杯中剩余的痰液转移至标记为“额外痰液”的离心管中。
6. 将所有离心管置于4 °C或冰盒中，必要时运送至实验室。

2. 病毒宏基因组的生成

1. 缓冲液和溶液的制备
   1. 提前配制 50 mM 二硫苏糖醇（DTT），4 °C 保存。该溶液可稳定保存 2 周。
   2. 配制盐水镁（SM）缓冲液（250 ml）：1 M NaCl、10 mM MgSO₄、50 mM Tris-HCl；调节 pH 至 7.4。经 0.02 µm 滤膜过滤除菌，室温保存。
   3. 根据牛胰脱氧核糖核酸酶 I（DNase I）冻干粉的活性（以 Dornase 单位/mg 干重定义），用分子级水将其配制成 100 U/µl 的酶液。
   4. 配制 10x DNase I 缓冲液（50 ml）：100 mM MgCl₂、20 mM CaCl₂；调节 pH 至 6.5。经 0.02 µm 滤膜过滤除菌，室温保存。
   5. 配制 4% 多聚甲醛溶液。
   6. 配制 200x TE 缓冲液：2 M Tris-HCl（pH 8.5）、0.2 M EDTA。经 0.02 µm 滤膜过滤除菌，室温保存。
   7. 用分子级水配制 10 ml 10% 十二烷基硫酸钠（SDS）溶液。
   8. 用分子级水配制 50 ml CTAB/NaCl 溶液（10% CTAB，700 mM NaCl）。CTAB 需溶解过夜。若仍有沉淀，可在 65 °C 加热溶液。该溶液在室温下黏度较高。
      注：使用 0.02 μm 滤膜过滤缓冲液可去除溶液中的病毒样颗粒，但无法去除游离核酸污染。
2. 样品预处理
   1. 配制适量新鲜的 6.5 mM 二硫苏糖醇（DTT）。
   2. 加入经 0.02 µm 滤膜过滤的 SM 缓冲液，将匀浆液稀释至总体积为 6 ml。
   3. 为促进黏液溶解，向样品中加入等体积（6 ml）的 6.5 mM 二硫苏糖醇（DTT），剧烈涡旋混匀，37 °C 孵育 1 小时。
   4. 剧烈涡旋处理后的样品，于 10 °C、3,056 x g 离心 15–20 分钟。
   5. 将上清液转移至新的 15 ml 离心管中。
   6. 对下一个样品重复步骤 2.2.3 和 2.2.5。
   7. 使用装在注射器上的 0.45 µm 滤膜将上清液转移并过滤至新的 15 ml 管中。
      注：若滤膜堵塞，可从注射器中回收样品，并跳过过滤步骤。
   8. 取 100 µl 经 0.45 µm 滤膜过滤的样品，进行氯仿和 DNase I 处理（见步骤 2.3.12–2.3.15），并加入等体积的 4% 多聚甲醛以固定样品，用于落射荧光显微镜观察（图 2A）。
   9. 若采用“全捕获”病毒颗粒富集方法（见讨论部分），则跳至步骤 2.3.12，省略基于氯化铯梯度超速离心的病毒颗粒筛选步骤。但此方法可能导致氯仿抗性细菌污染，以及病毒裂解液中宿主 DNA 含量较高。
3. 病毒样颗粒（VLPs）的富集与纯化
   1. 通过将适量氯化铯（CsCl）溶解于未过滤的 SM 缓冲液中，分别配制所需密度的 CsCl 溶液（1.7 g/ml、1.5 g/ml、1.35 g/ml 和 1.2 g/ml）。使用前经 0.02 µm 滤膜过滤各溶液。
   2. 按 图 2B 所示设置 CsCl 梯度。
   3. 向每根离心管中依次加入 1 ml 1.7 g/ml 溶液、1 ml 1.5 g/ml 溶液、1 ml 1.35 g/ml 溶液、1.2 g/ml 溶液（可选），最后加入 6–8 ml 样品。标记各层以标识每部分的位置。
   4. 将每对相对的离心管配平至相差不超过 1 mg。
   5. 小心将每根离心管放入转子吊桶中。即使吊桶为空，也需全部装入。将吊桶安装到转子上。
   6. 于 4 °C、82,844 x g 条件下离心 2 小时。
   7. 离心结束后，小心从转子架中取出离心管，避免破坏密度梯度。
   8. 使用带 18 G 针头的 3 ml 注射器，在 1.5 g/ml 密度层下方刺穿离心管（图 2，红色箭头），抽取约 1.5 ml 液体至注射器中。
   9. 缓慢拔出针头，让管中剩余液体通过穿刺孔滴入新的 15 ml 管中，收集上层组分。标记为“上层废液”。
   10. 将注射器中的 1.5 g/ml 组分（含 VLPs）推出，分别收集至两个新的微量离心管中。
   11. 对所有样品重复步骤 2.3.8–2.3.10。
   12. 向病毒浓缩液中加入 0.2 体积的氯仿，剧烈振荡，室温孵育 10 分钟，最大转速离心 5 分钟，收集水相。
   13. 向经氯仿处理的病毒浓缩液中加入 10x DNase 缓冲液和 DNase I（终浓度 = 2.5 U/µl），37 °C 孵育 1.5–2 小时。
   14. 于 65 °C 孵育 15 分钟以灭活 DNase 活性。
   15. 取 15 µl 经氯仿和 DNase I 处理的病毒组分至新管中，加入 15 µl 4% 多聚甲醛，固定样品用于落射荧光显微镜观察。
4. DNA 提取
   1. 将各样品的病毒浓缩液汇集至一个洁净并经高压灭菌的 50 ml Oak Ridge 高速离心管中。
   2. 加入以下成分：0.1 体积 200x TE 缓冲液、每毫升样品加 10 μl 0.5 M EDTA、1 体积甲酰胺和 10 μl 甘油。充分混匀，室温孵育 30 分钟。
   3. 根据新体积，加入 2 体积室温的 100% 乙醇。充分混匀，4 °C 孵育至少 30 分钟。
   4. 使用 SS-34 转子，在 4 °C、17,226 x g 条件下离心 20 分钟，沉淀 DNA。
   5. 用移液管小心弃去上清液。用冰冻的 70% 乙醇洗涤沉淀两次。
   6. 尽可能去除液体，室温下晾干沉淀 15 分钟。
   7. 用 567 μl 1x TE 缓冲液（pH 8.0）重悬 DNA 沉淀。
      注：室温下至少静置 15 分钟以确保完全重悬。将重悬的 DNA 于 4 °C 保存过夜，待后续处理。
   8. 将全部 567 μl 重悬的 DNA 溶液转移至新的 1.5 ml 微量离心管中。加入 30 μl 预热的 10% SDS 和 3 μl 蛋白酶 K（20 μg/ml），充分混匀，56 °C 孵育 1 小时。将 CTAB/NaCl 预热至 65 °C。
   9. 加入 100 μl 5 M NaCl，充分混匀。加入 80 μl 预热的 CTAB/NaCl 溶液，涡旋混匀，65 °C 孵育 10 分钟。
   10. 加入等体积氯仿，涡旋混匀，16,100 x g 离心 5 分钟。
   11. 将上清液转移至新的 1.5 ml 微量离心管中。加入等体积酚/氯仿，涡旋混匀，16,100 x g 离心 5 分钟。
   12. 将上清液转移至新的 1.5 ml 微量离心管中。加入等体积氯仿，涡旋混匀，16,100 x g 离心 5 分钟。
   13. 将上清液转移至新的 1.5 ml 微量离心管中。加入等体积异丙醇，混匀，-20 °C 孵育至少 30 分钟。
   14. 沉淀 DNA，4 °C、16,100 x g 离心 15 分钟。小心吸弃上清液，用冰冻的 70% 乙醇洗涤沉淀两次。
   15. 短暂离心，去除管中残留乙醇。室温下晾干沉淀 15 分钟。
   16. 用 50 μl 洗脱缓冲液（5 mM Tris，pH 8.5）重悬 DNA 沉淀。室温下静置至少 5 分钟以充分水合。
   17. 使用高灵敏度荧光定量法测定 DNA 浓度。
5. 使用 Phi29 聚合酶进行扩增（可选）
   1. 配制 2x 退火缓冲液：80 mM Tris-HCl（pH 8.0）、20 mM MgCl₂。
   2. 将 Phi29 DNA 聚合酶稀释至 5 U/μl。
   3. 预先混合样品缓冲液，包含 50 μl 随机六聚体引物（100 μM）、125 μl 2x 退火缓冲液和 25 μl 水。分装后于 -20 °C 保存。
   4. 预先混合反应缓冲液，包含 100 μl Phi29 10x 缓冲液、40 μl 10 mM dNTPs 和 560 μl 水。分装后于 -20 °C 保存。
   5. 将 1 μl 模板 DNA 加入 4 μl 样品缓冲液中。
   6. 95 °C 孵育 3 分钟，然后置于冰上冷却。
   7. 向步骤 2.4.4 的混合物中加入 14 μl 反应缓冲液，通过反复吹打混匀。
   8. 加入 1 μl Phi29 DNA 聚合酶，通过反复吹打混匀，30 °C 孵育 18 小时，随后 65 °C 孵育 10 分钟。
   9. 使用基因组 DNA 纯化柱或酚/氯仿抽提结合乙醇沉淀法纯化反应产物。
6. 落射荧光显微镜观察（参见 Haas et al. 2014²⁸ 中的过滤系统设置）
   注：分离与纯化后，可使用核酸染料结合落射荧光显微镜验证样品中病毒颗粒的存在及其纯度（图 2A 和 图 2C）。样品中的游离 DNA 可能导致背景荧光过高。因此，在固定和染色前应对样品进行 DNase I 处理。
   1. 配制封片液（0.1% 抗坏血酸，50% 甘油）。将 100 μl 10% 抗坏血酸加入 4.9 ml 1x 磷酸盐缓冲液（PBS）中，充分混匀。再加入 5 ml 100% 甘油，充分混匀，标记为“封片液”。
   2. 使用 0.02 μm 氧化铝基质一次性注射器滤膜过滤封片液，分装至微量离心管中，-20 °C 保存。
   3. 取 100 μl 样品至新微量离心管中，加入等体积 4% 多聚甲醛以固定 VLPs。室温孵育至少 10 分钟。
   4. 加入 800 μl 经 0.02 μm 滤膜过滤的水，使总体积达 1 ml。向管中加入 1 μl SYBR Gold 染料，室温孵育 10 分钟。
   5. 启动真空泵，调节压力至 -9 至 -10 psi（-62.1 至 -68.9 kPa），设置过滤系统。
   6. 用水清洗滤座，将带环形聚丙烯支撑环的 0.02 µm 氧化铝基质滤膜放入滤座中。
   7. 将滤塔置于滤座上方的滤膜上，并用夹具固定。
   8. 将 1.5 ml 微量离心管中的内容物移入滤塔中，静置数分钟使样品滤过。
   9. 在载玻片上标记并加入 10 µl 封片试剂。
   10. 保持真空开启状态，取下滤塔和夹具。
   11. 小心从滤座上取下滤膜，用 Kimwipe 擦拭滤膜底部，然后将滤膜直接放置在载玻片的封片液上。
   12. 再加入 10 µl 封片试剂至滤膜上，盖上盖玻片。

3. 生成微生物宏基因组

1. 缓冲液与溶液的制备
   1. 配制 50 ml 的 1× DNase 缓冲液：50 mM NaAc、10 mM MgCl₂、2 mM CaCl₂；调节 pH 至 6.5。经滤膜（0.22 µm）除菌，室温保存。
   2. 根据牛胰脱氧核糖核酸酶 I（DNase I）的 Dornase 单位/毫克干重所定义的活性，将冻干的 DNase I 酶溶解于分子级水中，配制成 1000 U/µl 的溶液。
   3. 配制 100 ml 的 SE 缓冲液：75 mM NaCl、25 mM EDTA；调节 pH 至 7.5。经滤膜（0.22 µm）除菌，室温保存。
2. DNA 提取前的样品预处理
   1. 向匀浆液中加入 5 倍体积的 0.22 µm 滤膜过滤的 1× PBS 进行稀释。例如，向 2 ml 样品中加入 10 ml 的 1× PBS。
   2. 加入 β-巯基乙醇至终浓度为 2%（v/v）。在化学通风橱中，室温下轻轻摇动混合物 2 小时。
   3. 在 10 °C 下以 3,056 × g 离心 15 分钟，弃去上清液。
   4. 将沉淀物重悬于 10 ml 分子级水（或 0.22 µm 过滤水）中，室温孵育 15 分钟。
   5. 重复步骤 3.2.3 和 3.2.4 一次。
   6. 在 10 °C 下以 3,056 × g 离心 15 分钟，弃去上清液。
   7. 将沉淀物重悬于 5 ml 的 1× DNase 缓冲液中，并按每毫升样品加入 15 µl DNase I（1,000 U/µl）。
   8. 在 37 °C 下孵育 2 小时，期间反复混匀。
   9. 在 65 °C 下孵育 15 分钟以灭活 DNase 活性。
   10. 在 10 °C 下以 3,056 × g 离心 15 分钟，弃去上清液。将沉淀物重悬于 10 ml SE 缓冲液中。
   11. 重复步骤 3.2.10。
   12. 在 10 °C 下以 3,056 × g 离心 15 分钟，弃去上清液。
   13. 将沉淀物重悬于 2 ml SE 缓冲液中，并转移至两个微量离心管中。
   14. 在微量离心管中沉淀细胞。室温下以 16,100 × g 离心 15 分钟。
   15. 移除上清液，并使用基因组 DNA 提取试剂盒的革兰氏阳性菌变体方案从沉淀的细胞中提取 DNA。

4. 生成宏转录组

1. 样品预处理
   1. 在样品采集和均质化后，立即在GITC裂解缓冲液中通过珠击法进行细胞机械裂解。参见步骤1.4。
   2. 在4 °C、600 × g条件下离心混合物5分钟，使二氧化硅珠沉淀。
   3. 将上清液转移至新管中。
   4. 每使用750 μl GITC裂解缓冲液，加入200 μl氯仿，手动剧烈振荡15秒，室温孵育10分钟，然后在4 °C、3,056 × g条件下离心15分钟。在此次15分钟离心过程中，准备步骤4.2的操作。
   5. 离心15分钟后（此时会形成清晰的水相-中间相-有机相分层），将水相（避免扰动中间相）转移至新的无RNase的管中。
      注意：水相中含有RNA。在进行下一步前，将管子置于冰上保存。
2. 使用市售的基于柱法的RNA纯化试剂盒或传统的异丙醇沉淀法进行总RNA提取与纯化。
   1. 基于二氧化硅柱的RNA纯化
      1. 测定所获得水相部分的总体积。
      2. 向样品中加入适量的RNA结合缓冲液，并充分混匀。
      3. 根据制造商说明书调整混合物至适当的结合条件。充分混匀后进行短暂离心。
      4. 将混合物加载至RNA柱中。对于体积较大的样品，可分多次上样，每次柱子最多上样4次；否则，建议每个样品使用多个柱子。
      5. 根据制造商说明书对柱子进行适当洗涤。
      6. 用至少30 µl无RNase的水洗脱RNA。进行两次洗脱可略微提高RNA得率，但会导致RNA浓度被稀释。
      7. 测定RNA浓度，并直接进行DNase I处理。建议使用Bioanalyzer检测RNA质量。
   2. RNA沉淀法
      1. 向样品中加入等体积的异丙醇（例如，向500 µl水相部分中加入500 µl异丙醇）以及2 µl浓度为10 µg/µl的无RNase糖原。
      2. 室温孵育混合物10分钟。
      3. 在12,000 × g、4 °C条件下离心15分钟。
      4. 小心移除上清液，加入1 ml无RNase的75%乙醇。在7,500 × g、4 °C条件下离心5分钟，以确保沉淀完整。
      5. 小心移除乙醇。
      6. 重复步骤4.2.2.4和4.2.2.5一次。
      7. 将沉淀在空气中干燥10分钟。
      8. 用50 µl无RNase的水重悬沉淀，55 °C孵育5分钟，随后直接进行DNase处理。建议使用Bioanalyzer检测RNA质量。
      9. 将RNA分装后于-20 °C保存，或于-80 °C长期保存。

结果

病毒宏基因组

囊性纤维化（CF）痰液极为黏稠，含有大量的黏蛋白和游离DNA（图2A）；密度梯度超速离心有助于去除宿主来源的DNA（图2B）。此处总结了先前一项研究⁹的结果，该研究利用所述实验流程获得了八个病毒组（表1）。其中七个样本（CF1-D、CF1-E、CF1-F、CF4-B、CF4-C、CF5-A 和 CF5-B；表1）按第2节所述方法进行处理。所获得的病毒组中，除一个样本外（70%），人源序列含量均很低（0.02%–3.7%）。样本CF4-A未经过密度梯度超速离心步骤，由此样本生成的病毒组中人源序列占比>97%（表1）。图2展示了典型CF痰液样本在密度梯度超速离心前（图2A）和后（图2C）的荧光显微镜图像示例。密度梯度分离后的显微图像中可见清晰的病毒样颗粒（VLPs），且无大颗粒存在。在提取VLPs DNA后，通常在对VLPs DNA进行测序前，通过16S rDNA扩增检测是否存在细菌污染。

微生物宏基因组

本研究中提供的七份痰液样本来自一名囊性纤维化（CF）患者，采集时间为连续七天。该患者在第3天采集痰液样本后开始口服抗生素（环丙沙星和多西环素）。该患者在7天内每天采集的痰液样本体积均为15 ml，因此未向样本中添加PBS。本次采样的目的是通过以下两个方面评估本工作流程中所述方案的有效性：（i）评估微生物群落结构的每日波动情况；（ii）比较宏基因组测序与16S rDNA测序在微生物群落结构及其分辨率上的差异。因此，从每份样本中均提取了总DNA和HL-DNA。

各痰液样本在DNA提取后的HL-DNA浓度见表2。HL-DNA的总得率范围为210 ng至>5 μg。每个样本以1 ng总起始量构建Illumina测序文库（图3）。宏基因组数据的特征见表2。除一个文库外，其余所有文库均获得超过100万条序列，并在使用PRINSEQ²⁹软件进行数据预处理后保留了超过85%的高质量序列。所有数据集首先经过预处理，以去除重复序列和低质量序列（最低质量值为25），随后使用DeconSeq³⁰进一步筛选并去除人源序列。人源序列污染程度高度依赖于样本特性。本研究中，人源序列总量范围为14%-46%（表2）。预处理后的序列随后使用Metaphlan³¹分析流程及MG-RAST³²服务器进行注释。

除了宏基因组外，还使用引物从总DNA和HL-DNA扩增16S rDNA文库，引物靶向16S rRNA基因V1-V2可变区约300 bp的片段^33,34。来自各个样品的PCR产物经标准化后混合，并在MiSeq平台上使用Illumina 500循环双端测序进行测序。双端16S rDNA扩增子序列通过条形码使用Python脚本按样品分类，并利用phrap^35,36对成对读段进行拼接。采用5 nt滑动窗口，对拼接后的序列末端进行修剪，直至平均质量值≥20。随后使用Uchime³⁷比对SILVA³⁸参考序列中无嵌合体的子集，去除潜在的嵌合序列。使用SINA³⁹（版本1.2.11）比对SILVA³⁸数据库中的418,497条细菌序列，对高质量读段进行分类学注释。具有相同分类学注释的序列被聚类为操作分类单元（OTUs）。该过程共生成16个样品的1,655,278条序列（平均每样品103,455条序列；最小值：72,603；最大值：127,113）。测序完整性的评估指标Goods覆盖度中位数≥99.9%。分析及图表生成使用软件包Explicet⁴⁰（v2.9.4，www.explicet.org）。在Explicet中，以72,603条序列为稀疏化标准，进行100次bootstrap重采样，计算α多样性（样品内多样性）和β多样性（样品间多样性）。

本研究首先针对的问题是低渗裂解是否优先选择性地富集（即，优先保留或裂解特定类群的微生物。第一次低渗裂解后，从前两个样品（CF1-1A* 和 CF1-2A*）中重新悬浮的沉淀细胞被分出部分，用于与第二次低渗裂解后的相同样品（CF1-1 和 CF1-2）进行比较。所有样品均经过相同处理， 即，DNA提取前先用DNase I处理，随后进行DNA提取及测序流程。如图所示 图 4，经过两次低渗裂解处理后，各亚样品的微生物谱与样品的微生物谱高度相似。此外，第二次低渗裂解使宏基因组中非人源序列的比例增加了6–17%表 2).

为了检测基于宏基因组学和16S rDNA分析的微生物组成差异，以及在低渗裂解前后可能解释我们先前研究与其他研究之间差异的变化，分别从总DNA和低渗裂解（HL）获得的DNA制备了细菌16S rDNA测序文库（图4B）。在属水平上，常见囊性纤维化相关细菌（如Pseudomonas、Stenotrophomonas、Prevotella、Veillonella和Streptococcus）的分类谱在基于HL-DNA构建的16S rDNA文库与宏基因组之间高度相似。然而，Rothia在16S rDNA文库中的检出丰度低于宏基因组文库。当比较由总DNA和HL-DNA生成的16S rDNA分类谱时，自第3天起，Pseudomonas在总DNA中的代表性与HL-DNA中存在差异。

宏转录组

通常，从囊性纤维化（CF）痰液中提取的总RNA部分降解，其片段大小范围为25-4,000 bp（图5A 和 图5C）。此处展示的代表性结果此前已发表于Lim et al. 2012⁹。在未去除rRNA的宏转录组中，rRNA所占比例范围为27-83%，且不同样本间rRNA的相对丰度存在差异（表3；数据来源于Lim et al.⁹）。然而，使用Ribo-Zero试剂盒进行去除后，除样本CF1-F外，rRNA的相对丰度均降至1-5%。rRNA去除效果的差异可能反映了提取RNA的质量，或样本中微生物群落组成的差异，从而影响rRNA与探针杂交的可及性⁹。使用Ribo-Zero rRNA去除试剂盒时，成功（图5B）与失败（图5D）的电泳图谱存在明显差异，其中去除失败的图谱中可见明显的rRNA峰。

所构建的cDNA文库的片段大小范围通常反映了起始RNA样本的大小范围。本文中展示的cDNA文库是在去除rRNA后，使用全转录组扩增试剂盒（WTA2）进行扩增，随后进行Roche-454测序文库制备⁹。所获得的cDNA片段长度范围为50–4,000 bp（图5E和图5F），且在不同样本之间具有高度一致性（Lim et al. 2012）⁹。目前已有多种针对不同测序平台的RNA-Seq文库制备试剂盒，为研究者提供了更多选择，可在最优条件下将cDNA合成与测序文库制备步骤相结合。截至目前，一种推荐的方案是ScriptSeq Complete Gold试剂盒，该试剂盒结合了上述推荐的rRNA去除试剂与RNA-Seq文库制备试剂盒。

图1：用于病毒组、微生物组和宏转录组测序的宿主相关样本（如痰液样本）制备工作流程。

图 2：氯化铯密度梯度超速离心可有效去除细胞外DNA和大颗粒物质(A)，并实现从囊性纤维化（CF）痰液中最佳分离病毒样颗粒。在上样预处理样品之前，将每种梯度溶液各1毫升逐层叠加(B)。在完成颗粒的分离与纯化后，采用核酸染料（如SYBR Gold）进行落射荧光显微镜检测，以确认样品中病毒颗粒的存在及其纯度。经密度梯度分离后的CF痰液样本中可观察到清晰的病毒样颗粒(C)（白色箭头所示）。

图3：由1 ng HL-DNA生成的Nextera XT文库的片段大小分布示例，该样本来源于囊性纤维化患者痰液微生物组。 文库的标准化、混合及上样量均严格按照试剂盒制造商提供的操作手册进行，未作任何修改。

图 4：一名囊性纤维化患者纵向采集的九个样本中微生物群落的分类学分析。 (A) 基于低渗裂解法提取 DNA 构建的宏基因组文库所得的微生物谱。物种分类依据 Metaphlan 分析流程，在数据预处理中已去除重复序列、低质量序列以及与人类序列同源的序列。为了验证两步低渗裂解法并未选择性富集特定微生物类群，图中包含了第一步低渗裂解后获得的子样本（*）。(B) 基于总 DNA（T）和低渗裂解法提取 DNA（HL）的 16S rRNA 基因 V1V2 区域测序所得的微生物谱。这些数据此前尚未发表。

图 5： 使用Agilent 2100 Bioanalyzer对宏转录组文库生成的RNA（A-D）和cDNA（E-F）电泳图谱示例，分别采用RNA pico芯片和高灵敏度dsDNA芯片。（A） 和 （C） 显示了rRNA去除前的电泳图谱示例。（B） 和 （D） 分别为使用总rRNA去除试剂盒成功和失败的rRNA去除过程的电泳图谱，其中在去除失败的样本中可见rRNA峰。使用全转录组扩增试剂盒（Sigma-Aldrich）生成的cDNA （E-F） 片段大小范围与起始的rRNA去除后RNA的大小范围相似，并且在两个不同样本之间高度一致。请点击此处查看该图的放大版本。

	CF1-D	CF1-E	CF1-F	CF4-A	CF4-B	CF4-C	CF5-A	CF5-B
总读数	224,859	87,891	106,189	93,301	140,020	1,558	272,552	217,438
预处理后读数a	109,389	73,624	67,070	82,011	68,617	1,137	215,808	158,432
	49%	84%	63%	88%	49%	73%	79%	73%
碱基数	47,239,573	33,351,525	28,922,479	27,667,695	29,386,841	243,986	95,205,805	69,581,811
平均读长	432	453	431	337	428	215	441	439
宿主序列b	240	526	28	79,774	13	797	585	5,859
	0.21%	0.71%	0.04%	97.27%	0.02%	70.10%	0.27%	3.70%
病毒比对结果c	7,214	23,550	4,070	737	4,642	22	6,466	5,981
	6.59%	31.99%	6.07%	0.90%	6.77%	1.93%	3.00%	3.78%
未分配读数d	103,888	60,490	32,780	1,935	68,440	311	105,612	119,551
	94.97%	82.16%	48.87%	2.36%	99.74%	27.35%	48.94%	75.46%
a 经PRINSEQ29数据预处理后的读数。
b 通过DeconSeq30鉴定的人源序列，以及在BLASTn比对（NCBI核苷酸数据库）中最佳比对结果属于脊索动物门的读数。
c 与内部病毒基因组数据库进行tBLASTx比对的结果。百分比基于预处理后读数总数计算。
d 在NCBI核苷酸数据库中无BLASTn比对结果的读数。百分比基于预处理后读数总数计算。部分在NCBI核苷酸数据库中无BLASTn比对结果的读数，在tBLASTx分析中于蛋白水平被鉴定为病毒序列。

表1：采用本实验流程从痰液样本中获得的八个病毒组文库特征。 该表格摘自Lim 等（2012）⁹。七个样本（CF1-D、CF1-E、CF1-F、CF4-B、CF4-C、CF5-A 和 CF5-B）按第2节所述方法处理，所得病毒组中除一个样本含70%人类来源序列外，其余均仅含少量（0.02%–3.7%）人类来源序列。CF4-A 样本在密度梯度超速离心步骤中被省略（CF4-A），所得病毒组中含 > 97% 的人类来源序列。

样品	浓度	总得量	总读段数	总读段数（处理后b）	非人源序列
	(ng/μl)	(ng)	（原始a）		(%)
CF1-1A*	2.3	230	1,098,454	937,688	691,541
					74%
CF1-1	13	1,300	2,212,756	1,958,910	1,574,520
					80%
CF1-2A*	2.1	210	672,878	588,106	407,530
					69%
CF1-2	5.2	520	1,944,012	1,697,010	1,455,174
					86%
CF1-3	28.8	2,880	1,048,304	896,756	560,852
					63%
CF1-4	24.1	2,410	1,154,922	984,702	621,098
					63%
CF1-5	33.6	3,360	1,029,622	888,630	481,548
					54%
CF1-6	43.2	4,320	1,434,016	1,256,504	725,858
					58%
CF1-7	57.8	5,780	1,000,174	872,036	565,376
					65%
* 在第二次低渗裂解步骤（步骤 3.1.5）之前，从 CF1-1 和 CF1-2 中取 1 ml 样品进行分样。细胞按 3.1.7 所述离心沉淀，并按剩余实验流程进行，无需任何修改。
a 来自 2 × 300 bp MiSeq 测序运行的未处理 Illumina 读段。
b 读段根据质量与长度进行评估、截短和剔除，具体方法见讨论部分。

表2： 使用本方案从痰液样本生成的微生物组特征。 显示了各样本在100 μl洗脱缓冲液（5 mM Tris/HCl，pH 8.5）中的DNA浓度以及测序数据的特征。每个样本使用1 ng DNA，采用Nextera XT文库构建试剂盒制备个体文库。

样品	CF1-D		CF1-F		CF4-B		CF4-C
处理方式	无	Ribo-Zero	无	Ribo-Zero	无	Ribo-Zero	无	Ribo-Zero
预处理后读段数	2,088	1,991	40,876	25,238	19,728	32,737	31,791	36,172
平均读段长度	275	245	262	270	233	259	240	267
rRNA 总读段数	1,737	91	29,499	17,267	5,285	291	16,371	1,761
	83.20%	4.60%	72.20%	68.40%	26.80%	0.90%	51.50%	4.90%
微生物 rRNA	1,414	32	19,978	12,035	23	227	6,916	1,076
	67.70%	1.60%	48.90%	47.70%	0.10%	0.70%	21.80%	3.00%
真核生物 rRNA	323	59	9,520	5,232	5,262	64	9,455	683
	15.50%	3.00%	23.30%	20.70%	26.70%	0.20%	29.70%	1.90%
% rRNA 去除率*	0%	95%	0%	5%	0%	97%	0%	91%
非 rRNA 读段数	351 (16.8%)	1,900 (95.4%)	11,377 (27.8%)	7,971 (31.6%)	14,443 (73.2%)	32,446 (99.1%)	15,420 (48.5%)	34,411 (95.1%)
NR 总比对数	102 (4.9%)	691 (34.7%)	3,327 (8.1%)	2,857 (11.3%)	4,938 (25.0%)	10,751 (32.8%)	5,905 (18.6%)	15,766 (43.6%)
真核生物	74	407	2,790	2,524	4,614	10,227	4,553	8,274
细菌	26	283	520	312	287	471	1,326	7,442
未分类读段数	249 (11.9%)	1,209 (60.7%)	8,050 (19.7%)	5,114 (20.3%)	9,505 (48.2%)	21,695 (66.3%)	9,515 (29.9%)	18,645 (51.5%)
*rRNA 去除率以未去除非等分试样中 rRNA 含量的百分比表示。

表3：有无rRNA去除的宏转录组文库特征。 数据来源于Lim et al. (2012)⁹，该研究还额外比较了其他rRNA去除试剂盒以及测序文库构建前cDNA雾化处理的效果。

讨论

病毒宏基因组学

使用聚乙二醇（PEG）沉淀法或小体积浓缩装置对病毒颗粒进行浓缩。在某些情况下可能无需浓缩，但需进行预过滤或低速离心以去除真核细胞和微生物细胞。病毒裂解物将进一步通过密度梯度超速离心^9,41或小孔径滤膜（例如，0.45 μm）进行富集和纯化，以去除真核细胞及较大的微生物细胞²⁵。密度梯度超速离心通常采用高密度但惰性的溶液（如蔗糖或氯化铯）来分离和浓缩病毒颗粒⁴¹。该物理分离方法基于病毒颗粒的大小和浮力密度。因此，正确选择滤膜孔径以及精确制备梯度对于分离特定的病毒群落至关重要，因为病毒样颗粒（VLPs）的物理回收效率直接决定了最终获得的病毒群落组成⁴¹ （即，无法通过滤膜或不在提取密度范围内的病毒颗粒将不会在宏基因组中被检测到）。在完成病毒的分离与浓缩后，样品中仍可能存在非病毒来源的基因组污染物，包括游离的核酸以及微生物和真核细胞。因此，验证样品中病毒颗粒的纯度极为关键（图1A和 图1B）。通常采用氯仿处理以裂解残留的细胞，随后进行核酸酶处理，以在核酸提取前降解游离的核酸。

本方案的一个局限性在于使用密度梯度离心法分离病毒颗粒，该方法可能排除因浮力过大而无法进入CsCl梯度的包膜病毒颗粒。一种可替代的“全捕获”方法是省略密度梯度离心步骤，直接从经氯仿和DNase I处理的0.45 μm滤液中提取群落DNA。该方法也适用于处理拭子或血浆等体积较小的样本。然而，这种方法可能导致耐氯仿的细菌污染以及较多的耐DNase I的细胞外DNA。

目前的测序方案在文库构建过程中需要1 ng至1 μg的核酸，其中较高的DNA得率可提供更广泛的测序选择。所获得病毒组（viromes）的DNA浓度通常介于检测限以下至超过200 ng/μl之间。回收的病毒核酸量可能不足以直接进行测序文库构建。在此类情况下，核酸扩增至关重要。连接子扩增鸟枪法文库（linker amplification shotgun libraries, LASLs）^2,42,43 和基于多重置换扩增（multiple displacement amplification, MDA）的全基因组扩增是两种最常用于生成足够测序用DNA的方法。以Phi29 DNA聚合酶为基础的MDA方法已知存在扩增偏好性，可能优先扩增单链DNA（ssDNA）和环状DNA，从而导致分类学和功能特征的非定量分析^44,45。LASLs方法的优化版本已被证明仅引入极低程度的偏差，具有更高的灵敏度（适用于起始材料量较少的情况），并可轻松适配于不同的测序平台⁴³。然而，该方法步骤较多，需要专用设备以最大限度减少DNA损失，且仅适用于双链DNA（dsDNA）模板。在本实验室中，该方法已成功应用于扩增从支气管肺泡灌洗液、珊瑚及海水来源的病毒样颗粒（VLPs）中提取的可检测及不可检测量级的DNA（未发表数据及Hurwitz et al.⁴⁶）。

由于病毒群落具有高度多样性和很大程度上未知的特性，开发数据分析流程一直是病毒宏基因组学分析中最具有挑战性的方面之一。尽管据估计生物圈中存在约10⁸种病毒基因型，但迄今为止，现有的病毒数据库仅包含约4,000个病毒基因组，大约仅为该估计总病毒多样性的一万分之一。因此，基于相似性的搜索方法（如BLAST⁴⁷）在病毒宏基因组中进行分类学和功能注释时面临固有的困难。许多序列无法在数据库中找到具有显著相似性的基因组，因而被归类为未知序列。尽管基于同源性的搜索仍是为序列数据分配分类和功能的最重要手段，但已发展出若干不依赖数据库的替代分析方法^48-50。Fancello et al.⁵¹ 对病毒宏基因组学中使用的计算工具和算法进行了全面综述。

微生物宏基因组学

通常，从低渗裂解处理的微生物群落（HL-DNA）中提取的总DNA量范围为20 ng至5 μg。产量高度依赖于患者的健康状况以及采集的痰液样本量，这解释了本研究中提取的HL-DNA总产量存在差异的原因（表2）。获得高质量测序数据的关键步骤取决于所构建测序文库的质量。图2展示了利用基于酶切的DNA片段化方法，从囊性纤维化（CF）痰液来源的微生物DNA构建的测序文库的典型片段大小范围。最佳文库片段大小取决于所选用的测序平台和应用目的，因此如有需要，可通过超声处理或雾化等替代方法优化片段化步骤。除本部分展示的代表性结果外，该方法在多个时间点采集的多位囊性纤维化患者痰液样本中的成功应用，还见于Lim et al. (2012)⁹ 和 Lim et al. (2014)¹⁰。

既往研究^9,10表明，每位患者均携带一组独特的微生物群落，该群落随时间发生动态变化，从而反映出群落中主要菌群的持续存在，而波动可能由抗生素治疗等干扰因素引起。这些波动是否在无外界干扰或采样及样本处理过程影响下仍每日发生，目前尚不明确。基于HL-DNA宏基因组和16S rDNA扩增子分析，为期7天的纵向采样显示，在未使用抗生素干扰的情况下（第1、2、3天），微生物谱的每日波动极小（图3A和 3B）。在第3天采样后立即开始口服抗生素治疗后，第4天微生物群落结构的变化变得明显。尽管抗生素环丙沙星可靶向多种已知细菌病原体，如P. aeruginosa、Staphylococcus aureus和Streptococcus pneumoniae，但治疗后P. aeruginosa的相对丰度增加，而Streptococcus spp.和P. melaninogenica的丰度则下降。至第6天，微生物群落逐渐恢复至初始状态的群落结构。结果提示，单个患者体内微生物谱的波动更可能源于呼吸道内微生物群落的扰动。

鉴于16S rDNA文库与HL提取DNA的宏基因组在微生物谱型上的一致性，我们排除了本研究中所用16S rRNA引物可能引入的偏差。从总DNA与HL提取DNA获得的16S rDNA分类谱型之间存在差异（图3B）的一个可能解释是，抗生素处理后环境中存在大量Pseudomonas spp.的胞外DNA。这一推论得到了以下发现的支持：这些差异在抗生素处理后的第7天最为显著，即治疗结束3天后，而该治疗方案除其他病原体外，也靶向Pseudomonas spp.。环丙沙星通常作为囊性纤维化（CF）患者合并慢性P. aeruginosa感染的一线治疗药物，尽管其抗菌谱覆盖了大多数与CF相关的病原体。我们推测，抗生素治疗清除了包括Streptococcus spp.在内的敏感菌群，从而为耐药性P. aeruginosa创造了生态位。Pseudomonas aeruginosa可能通过增强其生物膜群落获得耐药性，而研究表明其胞外DNA是生物膜结构的主要支撑成分⁵²。即使微生物群落结构已开始恢复，胞外DNA仍可能残留在CF患者的痰液中。因此，这些数据表明，本实验流程中所采用的低渗裂解及洗涤步骤，不仅有助于去除人源DNA，还可能有效去除可能歪曲真实微生物谱型的微生物来源的胞外DNA。

宏转录组学

高质量的宏转录组应包含相对较少的核糖体RNA（rRNA）序列，并能够无偏地代表群落的转录本（mRNA）。由于mRNA的半衰期较短且含量有限，因此本方案的关键在于尽量减少样品操作步骤，以最大限度地回收转录本。

近年来，已开发出多种核糖体RNA（rRNA）去除方法，并被整合到商业试剂盒中。这些方法包括基于寡核苷酸杂交的 MICROBEnrich、Ribo-Zero 和样本特异性减法杂交技术⁵³，以及基于外切酶酶活性、靶向含有5’单磷酸的RNA的 mRNA-ONLY 试剂盒。此外，还可使用若干mRNA富集方法，例如优先对线性RNA进行多聚腺苷酸化并扩增的 MessageAmp II-Bacteria 试剂盒。其中一些方法（例如，mRNA-ONLY、MICROBExpress 和 MessageAmp）可联合使用以达到最佳效率。然而，所有这些方法的效果均存在局限性，尤其是在处理部分降解的rRNA时——这在从囊性纤维化（CF）样本提取的总RNA中常有观察。依赖多聚腺苷酸化的RNA扩增技术无法用于生成同时包含真核和原核mRNA的宏转录组。此外，序列上添加的poly(A)尾可能会减少可用序列数据的量。含有同聚物重复序列的区域通常质量评分较低，导致测序及测序后分析软件过滤掉大量reads，且在切除poly(A)尾后，有效read长度将显著缩短⁵⁴。

针对复杂的囊性纤维化（CF）微生物群落和部分降解的RNA（图4A和图4C），我们之前的研究表明，与使用其他试剂盒的联合处理方法相比，Ribo-Zero Gold试剂盒的杂交捕获法在去除人源和微生物核糖体RNA（rRNA）方面更为有效⁹（表3）。由此获得的数据可同时用于分析人宿主和微生物的转录本。根据RNA的得率和质量，以及最终选择的测序平台，许多实验步骤（包括cDNA合成）可与文库构建流程整合优化。例如，经Ribo-Zero处理的RNA可使用ScriptSeq RNA-Seq文库构建试剂盒制备宏转录组测序文库。

动物相关群落的宏基因组分析能够全面表征包含宿主及其相关群落的整体功能实体。本文所述的工作流程适用于多种复杂的动物相关样本，尤其适用于除目标病毒和微生物颗粒外，还含有较厚黏液、大量细胞碎片、胞外DNA、蛋白质和糖蛋白复合物以及宿主细胞的样本。尽管在每一步骤中都可能损失部分病毒和微生物颗粒，但颗粒的分离与纯化对于最大限度减少宿主DNA的干扰至关重要。宏基因组数据可提供所研究群落的代谢潜能信息，而宏转录组学则通过揭示编码功能的差异表达对其进行补充⁹。对基因组和转录组数据的综合评估，为群落相互作用的动态机制提供了新的见解，并有助于推动更优疗法的开发^9,10,55。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
基于异硫氰酸胍的RNA裂解缓冲液	Life Technologies	10296-028	本研究使用了TRIzol LS试剂
二氧化硅珠；0.1至0.15 mm	Cole-Parmer	YO-36270-62	本研究使用了硅酸锆珠
二硫苏糖醇，分子生物学级（干粉）	Promega	V3155	可从其他任意公司购买
无菌注射器滤器；0.45 µm孔径，亲水性PVDF膜	Millipore	SLHV033RS
DNase I酶	Calbiochem	260913
无菌注射器滤器；0.02 µm孔径	FisherScientific	09-926-13	直径：25 mm
超透明离心管	Beckman	344059	9/16 x 3 ½ 英寸（14 x 90 mm），适用于SW41 Ti转子及VLPs密度梯度超速离心
SW41 Ti转子	Beckman	333790
SS-34固定角转子	Thermo Scientific	28020
Phi29 DNA聚合酶	Monserate Biotech	4001	10 U/µl
Phi29随机六聚体	Thermo Scientific	S0181	此前购自Fidelity Systems
带环形聚丙烯支撑环的氧化铝基质滤膜；0.02 µm孔径	FisherScientific	09-926-34	本研究使用了Whatman Anodisc滤膜；直径25 mm
SYBR Gold核酸凝胶染料	Life Technologies	S-11494
2-巯基乙醇	Sigma-Aldrich	M6250-100ML
无RNase的DNase I	NEB	M0303S	可从其他任意公司购买
糖原，RNA级	FisherScientific	FERR0551	可从其他任意公司购买
橡树岭高速离心管	FisherScientific	05-562-16B	用于大体积DNA提取程序，适用于SS-34固定角转子
总rRNA去除试剂盒	Epicentre	MRZE724	ScriptSeq Complete Gold试剂盒（流行病学）可用于将rRNA去除与测序文库制备相结合
氯化铯	FisherScientific	BP1595-500
十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）	Sigma-Aldrich	H5882-100G