使用荧光染料进行 体内 成像效果可能因调理作用、快速清除、检测灵敏度低以及对宿主的细胞毒性效应而受到显著限制。通过薄膜水化与挤出法将荧光染料封装于脂质体中，可实现荧光淬灭与保护，从而提高成像性能 体内 具有高检测灵敏度的成像
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方法文章
一种近红外荧光染料的脂质体包封型荧光淬灭技术作为工具 体内 光学成像
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摘要
摘要
光学成像提供了多种诊断方式，作为生物医学成像工具已引起广泛关注。尽管目前已有大量成像技术且仪器设备不断进步，但仍需要高灵敏度的探针用于体内成像。现有临床前荧光探针的一个典型问题是其在体内快速被清除，从而降低了成像灵敏度。为克服快速清除问题，增加靶部位的染料分子数量，并由此降低背景自发荧光，本研究将近红外荧光染料DY-676-COOH封装于脂质体中，并验证其用于体内炎症成像的潜力。已知DY-676在高浓度下具有自猝灭特性。我们首先确定了适合自猝灭的浓度，然后将该猝灭浓度的染料封装到聚乙二醇化（PEGylated）脂质体的水相内腔中。为了验证脂质体的猝灭与激活潜力，我们采用一种强烈的冷冻方法，该方法可破坏脂质体膜结构而不影响所封装的染料。具有高度荧光猝灭特性的脂质体被命名为Lip-Q。通过多种细胞系的实验，我们证明Lip-Q主要通过吞噬作用被细胞摄取，这一机制进而支持其作为工具用于小鼠模型中体内炎症成像的潜力。此外，我们采用酵母多糖诱导的小鼠水肿模型，进一步验证Lip-Q在体内光学炎症成像中的应用潜力。考虑到炎症引起的增强渗透性和滞留效应（EPR）可能导致探针摄取，我们在动物实验中将一种始终发光的脂质体配方（含低浓度、非猝灭型DY-676-COOH，称为Lip-dQ）以及游离的DY-676-COOH与Lip-Q进行了比较。
引言
脂质体已被广泛研究，是临床应用中最具有生物相容性的生物医学药物递送系统之一1,2它们主要由磷脂和胆固醇组成，这两种成分均为生物相容性化合物，可模拟天然细胞膜的部分结构。亲水性物质可被包封在脂质体的水相内部，而疏水性物质则可嵌入脂质体的磷脂双分子层中。3将物质包封于脂质体的水相内腔中可使其免受降解 体内 同时可防止治疗疾病所用的细胞毒性药物（如旨在破坏肿瘤细胞的化疗药物）对宿主系统产生毒性作用。通过聚乙二醇（PEGylation）等聚合物修饰脂质体表面，可进一步延长脂质体在血液中的循环时间 体内 由于空间位阻稳定作用4此外，脂质体能够包封高浓度的多种物质，例如蛋白质5,6，亲水性物质7,8 和酶9因此，它们可作为可靠的临床治疗和诊断工具，值得被批准用于递送阿霉素等细胞毒性药物以进行癌症治疗4由于其具有良好的柔韧性，脂质体还可负载荧光染料，用于诊断及影像引导手术。
荧光成像提供了一种经济且非侵入性的体内诊断工具，但其应用需满足一些基本要求。研究表明，最适合用于体内成像的荧光染料，其特征吸收和发射峰值应位于光散射和组织自体荧光（主要来源于水和血红蛋白）较低的波长范围内。因此，这类探针的吸收/发射最大值通常处于650至900 nm之间10。....
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方案
注意：所有操作均经地区动物伦理委员会批准，并符合国际关于动物伦理使用的指南。
1. 材料与仪器的准备
- 自组装囊泡分散液（SFV）的制备
- 将以下磷脂溶解并配制成氯仿中的储备液：214 mg/ml 卵磷脂酰胆碱（EPC）、134 mg/ml 胆固醇、122 mg/ml 1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基（聚乙二醇）-2000]（铵盐）（mPEG2000-DSPE）和 2 mg/ml 1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-(7-硝基-2-1,3-苯并噁二唑-4-基)（铵盐）（NBD-DOPE），储存于玻璃小瓶中。
- 在圆底烧瓶中加入约 3 ml 氯仿，然后转移适量的磷脂储备液至该烧瓶中，以制备摩尔比为 EPC:Chol:mPEG2000-DSPE = 6.5:3:0.5 的脂质体。如需对脂质体进行双荧光标记，则在脂质溶液中加入 0.3 mol% 的 NBD-DOPE。
- 使用旋转蒸发仪在减压（300 mbar）和 55 °C 条件下蒸发除去有机磷脂溶液中的氯仿。
- 待形成均匀的磷脂薄膜后，进一步将压力降至 10 mbar，持续 1–2 小时，以去除残留的氯仿沉积物。
- 在氯仿蒸发过程中，将 DY-67....
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结果
高浓度荧光染料（如本文所用的近红外荧光染料 DY676-COOH）包封于脂质体的水相内腔时，会导致强烈的荧光淬灭。荧光淬灭是多种荧光团在高浓度条件下常见的现象，该特性可在多个方面加以利用 体内 成像应用中，当需要高灵敏度和对目标区域的可靠检测时，脂质体的使用还可保护染料，这对于 体内 应用。对脂质体进行充分表征十分必要，包括多个因素，如包封染料的水平、脂质体的稳定性与粒径、荧光猝灭以及包封染料的活性。 体外 以及适用性 体内 成像目的。因此，游离染料 DY-676-COOH、淬灭脂质体（Lip-Q）以及包封染料浓度极低的非淬灭脂质体（Lip-dQ）之间的比较尤为关键，特别是对于 在体内 表征
采用薄膜水化与挤出法制备脂质体，并在挤出前进行多次冻融循环，此类脂质体中仍含有未结合的游离染料分子。由于游离染料在凝胶过滤介质中的保留时间较长，而脂质体洗脱较快，因此可通过凝胶过滤有效分离游离染料与脂质体（图1B）。根据凝胶过滤后的稀释程度，可选择性地进行超速离心步骤，以.......
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讨论
由于脂质体也可作为荧光染料的递送系统，因此可用于靶向疾病的成像。将高浓度的荧光染料（如本研究中使用的近红外荧光染料 DY676-COOH）包封于脂质体内，会导致所包埋染料的荧光发生强烈淬灭。荧光淬灭是多种荧光团在高浓度条件下常见的现象，该特性可在多个方面加以利用 体内 成像应用，其中要求对目标区域具有高灵敏度和可靠的检测能力。使用脂质体还可保护染料，这对于 体内 应用
薄膜水化与挤出技术是一种广泛应用的方法，可根据需要成功制备不同粒径范围的脂质体，并可实现多种修饰，例如包载多种不同的物质25。因此，该方法适用于制备包载近红外荧光染料DY-676-COOH用于成像的脂质体。该方法所得脂质体的囊内染料浓度为600–840 µM，处于该染料的荧光淬灭浓度范围内。用于均质化自组装囊泡分散液的LiposoFast-Basic手动挤出器，由于其装置兼容最大1 ml体积的注射器，适合在小规模实验室中制备脂质体。对于大规模制备，建议使用更大的高压均质器，其可处理每小时高达1,000 L的囊泡分散液。凝胶过滤（尺寸排阻）色谱是一个关键步骤，可.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由以下机构资助： 德国研究基金会资助项目 HI-698/10-1 和 RU-1652/1-1。感谢 Doreen May 提供出色的技术协助，以及感谢德国耶拿 DYOMICS GmbH 公司的大力支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 制备脂质体的材料与设备 | |||
| 卵磷脂酰胆碱 | Avanti Polar Lipids | 840051P | 溶于氯仿中，储存于玻璃小瓶中（214 mg/ml） |
| 胆固醇 | Sigma | C8667 | 溶于氯仿中，储存于玻璃小瓶中（134 mg/ml） |
| 1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]（铵盐） | Avanti Polar Lipids | 880120P | 溶于氯仿中，储存于玻璃小瓶中（122 mg/ml） |
| 1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-(7-硝基-2-1,3-苯并噁二唑-4-基)（铵盐） | Avanti Polar Lipids | 810145P | 溶于氯仿中，储存于玻璃小瓶中（2 mg/ml） |
| Sartorius MC1（d = 0.01 mg） | Sartorius AG | Research RC 210 P | 用于称量磷脂 |
| 旋转蒸发仪 | Büchi Labortechnik AG | R-114 | 用于磷脂膜的水合 |
| 水浴锅 | Büchi Labortechnik AG | R-481 | 用于磷脂膜的水合 |
| 真空控制器 | Büchi Labortechnik AG | B-720 | 用于磷脂膜的水合 |
| 真空箱 | Büchi Labortechnik AG | B-177 | 用于磷脂膜的水合 |
| 循环冷却器 | LAUDA DR. R. WOBSER GMBH & CO. KG | WKL 230 | 用于磷脂膜的水合 |
| DY-676-COOH | Dyomics GmbH | 676-00 | 溶于10 mM Tris中，储备液保存于-20°C |
| 三(羟甲基)氨基甲烷 | Applichem | A1086 | 10 mM缓冲液，pH 7.4 |
| 三氯甲烷 | Carl Roth GmbH + Co. KG | Y015.2 | 用于脂质体制备 |
| 超声波破碎仪 | Merck Eurolab GmbH | USR 170 H | 用于脂质体制备 |
| Vortex Genie 2（Pop-off Cup，编号146-3011-00） | Scientific Industries Inc. | SI-0256 | 用于脂质体制备 |
| Sephadex G25 medium | GE Healthcare Europe GmbH | 17-0033-01 | 用于脂质体纯化 |
| 曲拉通X100 | Ferak Berlin GmbH | 505002 | 用于破坏脂质体以进行染料定量 |
| LiposoFast-Basic | Avestin Inc. | 用于脂质体挤出 | |
| 聚碳酸酯滤膜，100 nm（Whatman Nucleopore Trans Etch Membrane，NUCLEPR PC 19 MM，0.1 U） | VWR | 用于通过LiposoFast-Basic进行脂质体挤出 | |
| Fluostar Optima | BMG Labtech | 用于染料定量 | |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | 用于测定脂质体粒径和Zeta电位 | |
| 超速离心机 | Beckmann Coulter GmbH | XL 80 | 用于样品浓缩 |
| 转子 | Beckmann Coulter GmbH | SW 55 TI | 用于样品浓缩 |
| 脂质体评估与光学成像的材料与设备 | |||
| 酿酒酵母来源的Zymosan-A | Sigma | Z4250-250MG | 用于诱导炎症 |
| 等渗盐水（0.9%） | Fresenius GmbH | PZN-2159621 | 用于稀释Zymosan-A |
| 异氟烷蒸发器 | Ohmeda Isotec 4 | 用于动物麻醉 | |
| 异氟烷 | Actavis GmbH | PZN-7253744 | 麻醉剂 |
| Thermo Mat Pro 20 W | Lucky Reptile | 61202-HTP-20 | 用于在麻醉期间保持动物体温 |
| Omnican-F（1 ml注射器） | Braun | PZN-3115465 | 用于探针的皮下和静脉给药 |
| 泛醇眼霜 | Jenapharm | PZN-3524531 | 用于防止动物在麻醉期间眼睛干燥 |
| Hanks平衡盐溶液 | PAA Laboratories /Biochrom AG | L2045 | 不含Mg²⁺、Ca²⁺和酚红，用于探针稀释和细胞洗涤 |
| 8孔细胞培养板 | BD Biosciences | 354108 | 用于细胞培养后显微镜观察 |
| 细胞培养瓶 | Greiner BioOne | ||
| 细胞培养基 | Gibco (life technologies GmbH) | ||
| 胎牛血清 | Invitrogen | ||
| 聚-L-赖氨酸溶液（0.01%，50 ml） | Sigma | P4832 | 用于包被细胞培养板 |
| 封片剂Permafluor | ThermoScientific | S21022-3 | 显微镜封片液 |
| Hoechst-33258 | AppliChem | 显微镜DNA染色剂 | |
| Hera-Safe | Heraeus Instruments | 用于细胞培养的无菌操作台 | |
| HERA cell | Heraeus Instruments | 用于细胞培养的培养箱 | |
| LSM510-Meta | Zeiss | 用于共聚焦显微镜成像 | |
| Maestro-TM活体荧光成像系统 | CRi, Woburn | 用于小型动物全身荧光成像 | |
| 分光光度计（Ultrospec 4300 pro UV） | GE Healthcare | 用于吸光度测定 | |
| 荧光分光光度计（Jasco FP-6200） | Jasco | 用于荧光发射测定 | |
| 动物 | |||
| NMRI小鼠（8-12周龄，雄性） | Elevage Janvier, 法国 | 用于炎症实验 |
参考文献
- Buse, J., El-Aneed, A. Properties, engineering and applications of lipid-based nanoparticle drug-delivery systems: current research and advances. Nanomedicine (Lond). 5, 1237-1260 (2010).
- Lim, S. B., Banerjee, A., Onyuksel, H.
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