使用 plusTipTracker 软件测量微管动态 Xenopus laevis 生长锥

摘要

基于 MATLAB 的开源软件包 plusTipTracker 可用于分析荧光标记的 +TIPs 图像序列，以量化微管动力学。

摘要

微管（MT）正端追踪蛋白（+TIPs）定位于微管的生长正端，并调控微管动态^1,2。在研究微管动态时，最著名且广泛应用的+TIP之一是末端结合蛋白EB1，它可结合所有正在生长的微管正端，因此可作为微管聚合的标志物¹。以往许多关于生长锥中EB1行为的研究采用耗时且存在偏倚的计算机辅助手动追踪方法来分析单个微管^1-3。我们的方法是在培养的胚胎生长锥中获取标记EB1的高分辨率活细胞图像后，利用软件包plusTipTracker⁴来量化微管动态的整体参数⁵。该软件是一个基于MATLAB的开源、用户友好的工具包，能够对荧光标记的+TIP动态影像实现自动检测、追踪、可视化和分析。本文介绍了在培养的Xenopus laevis生长锥中，使用plusTipTracker分析荧光标记的+TIP彗星状信号的实验方案。然而，该软件也可用于表征多种细胞类型中的微管动态^6-8。

引言

本方法的目的是获取有关活体生长锥中微管（MT）正端追踪蛋白（+TIP）动态的定量信息。MT +TIP 是一类定位于微管正端的蛋白质^9,10。它们具有多种功能，可调控微管动态不稳定性¹¹的相关参数，包括聚合速率、灾变频率和恢复频率。分析微管动态的一种常用方法是追踪 +TIP 蛋白 EB1 的行为，EB1 可特异性结合正在生长的微管正端^1,12。已知 EB1 能招募多种其他蛋白质至生长中的微管正端^13,14，并且最近被确认为一种微管成熟因子¹⁵，可促进微管生长并增加灾变频率^15,16。

许多关于生长锥内微管（MT）动态的研究采用手动追踪方法，随时间测量EB1-GFP动态的变化^1-3，因为EB1在微管正端的定位可作为微管聚合的标志。利用EB1-GFP彗星状信号作为微管生长的替代指标，其关键优势在于即使在微管高度重叠的区域，也能测量微管动态。尽管手动追踪EB1-GFP彗星状信号的方法已为微管行为提供了有价值的见解^1-3，但该方法耗时且可能存在偏倚。此外，由于异常的生长锥行为可能源于细胞骨架动态的微小变化，仅分析少量微管（手动追踪时通常不可避免）可能会遗漏重要信息。

因此，我们使用软件包 plusTipTracker 来测量微管全局动态参数⁴在获取培养的胚胎生长锥中标记EB1的高分辨率活体图像后⁵该软件由Danuser实验室开发，已用于多项研究，以表征不同类型细胞中微管（MT）的动力学行为。^6-8它是一个开源的、用户友好的基于 MATLAB 的软件包，可用于荧光标记的 +TIPs 电影图像的自动检测、追踪、可视化和分析。该软件可计算微管动态的一系列具体参数（详见参考文献4），但在生长锥中分析微管动态时，最有用的参数包括微管生长轨迹速度（微米/分钟）、生长轨迹寿命（秒）和生长轨迹长度（微米）。该软件可直接从 Danuser 实验室网站（在“软件”栏目下）下载。尽管 Danuser 实验室目前支持一种更新的 +TIP 追踪分析界面，该界面已整合到名为 u-track 2.0 的软件包中，但原有的独立版本软件仍将继续提供。这两个程序的核心算法相同（至少截至2014年），仅在界面和分析输出形式上存在差异。对于缺乏 MATLAB 使用经验的新手用户 和/或计算分析经验，plusTipTracker 还具备更友好的用户功能，包括自动化的统计参数输出。

本文描述了分析培养的Xenopus laevis生长锥中EB1-GFP动态图像的步骤。该方案已在近期一篇研究微管（MT）动态性的论文中使用¹⁷。有关表达EB1-GFP的生长锥培养的详细操作步骤，另请参见Lowery et al. 2012⁵。尽管本论文主要聚焦于生长锥中EB1-GFP动态性的研究，但该方案同样适用于其他细胞类型¹⁷。对于所有细胞类型，为实现最佳的+TIP追踪，帧间时间间隔应控制在0.5–2秒 之间。帧间间隔最长可达4秒，但时间间隔增加会导致更多的追踪误差。

方案

本实验方案和视频旨在作为原始论文的配套材料，该论文更详细地描述了软件包⁴，同时也作为Danuser实验室网站上软件下载所附带的技术报告的补充。如果读者对软件的使用仍有其他疑问，建议仔细查阅这些文档。

1. 图像分析前的准备

1. 将每个延时电影转换为一系列 TIFF（标签图像文件格式）图像文件。如果某个电影中包含多个生长锥/细胞，首先裁剪每个生长锥/细胞，以创建各自独立的图像序列。
   注意：此步骤并非必需，因为在 plusTipTracker 中可以选择单独的兴趣区域（ROI）。然而，使用较小的图像尺寸可提高计算处理速度，因此如果图像中存在大量空白区域，建议执行此步骤。
2. 将每个 TIFF 序列保存在其各自的文件夹中，该文件夹命名为“images”，并位于 MATLAB 可访问的路径下（注意“images”区分大小写）。要添加新路径，请在“当前文件夹”窗口中导航至相关文件目录，右键单击目录图标，然后选择“添加到路径 – 所选文件夹及其子文件夹”。同样重要的是，必须将 plusTipTracker 软件文件夹也添加到路径中。

2. plusTipGetTracks

注意：图像分析的第一步是检测 EB1-GFP 斑点，将斑点连接成轨迹，并确定微管动力学的参数。此步骤通过命令“plusTipGetTracks”⁴ 实现。

1. 开始分析时，打开 MATLAB 应用程序，并在命令窗口中输入“plusTipGetTracks”。这将弹出一个新的对话框。
2. 点击“Set Up New Projects”，然后选择一个（或多个）先前的 TIFF 图像序列，方法是选择相应的“images”文件夹（或包含“images”文件夹的目录）。完成此步骤后，将在存放“images”文件夹的同一目录下创建一个文件目录（roi_1），用于存储后续的数据文件。注意：“Set Up New Projects”步骤可提前在另一个会话中完成。
3. 将出现一个新窗口：“Select a polygon, right-click on last point, and click on ‘Create Mask’”。点击“OK”。随后将显示所选图像序列的第一幅图像。使用鼠标点击并绘制一个多边形，使其完全覆盖整个生长锥。双击鼠标以闭合多边形。
4. 多边形闭合后，将弹出一个对话框：“Do you want to select another ROI?” 如果图像中还有其他需要分析的生长锥，请选择“是”；否则选择“否”。
5. 选择将立即进行分析的项目。点击“Select Projects”，然后选择要分析的文件夹（roi_X）。
6. 将出现一个 listSelectGUI 界面。从屏幕左侧选择项目，并将其移至屏幕右侧。点击“OK”。选择一个位置以保存项目列表，然后点击“Save”。
7. 选择“Detection”（检测）、“Tracking”（追踪）和“Post-Processing”（后处理）。完成这些选择后，对话框的右侧将变为可配置状态。请配置每一项选项。
   1. 这些参数用于将检测到的彗星状信号连接成微管（MT）轨迹。有关选择追踪控制参数的详细说明，请参见随软件包下载附带的技术报告 PDF 第 9–10 页；若遇到问题，请仔细阅读该报告。针对在 Xenopus laevis 生长锥中追踪 EB1-GFP 彗星状信号的目的，建议使用以下追踪设置：搜索半径范围（像素）5–12，最小子轨迹长度（帧数）3，最大间隙长度（帧数）8，最大收缩因子 0.8，最大前向角度 50，最大后向角度 10，波动半径 2.5。这些设置如图 1所示。
   
   注意：最大收缩因子被设定为减少检测到的“向后间隙”数量，因为在生长锥的分析背景下，“向后间隙”并无实际意义，且在拥挤条件下很可能导致轨迹连接错误。此外，最大前向角度和波动半径均设置得相对较高，因为生长锥中的微管除了生长和收缩外，还会发生频繁的小幅位移；提高这些控制参数可在连接步骤中更好地适应此类运动。
   1. 根据所需的特定图像采集条件填写后处理设置。
8. 设置配置完成后，点击“Start”（开始）。软件将运行所选的设置。所需时间可能从几分钟到数小时不等，具体取决于所选项目的数量及其大小。命令窗口将显示每个功能的预计剩余时间。当 plusTipGetTracks 步骤完成后，命令窗口将显示“Finished!”（完成！）
   注意：该软件现已计算出一系列关于微管动态的详细参数（详见参考文献 4），但在分析生长锥中微管动态时，最有用的参数包括微管生长轨迹速度（微米/分钟）、生长轨迹寿命（秒）和生长轨迹长度（微米）。

3. plusTipSeeTracks

注意：现在微管轨迹已定义完毕，可使用“plustipSeeTracks”函数进行轨迹可视化⁴。该函数可提供多种可视化输出结果，包括空间微管动态图谱和速度视频，但此处仅聚焦于使用“Track Movies”（轨迹电影）功能，将微管轨迹叠加显示在生长锥图像上。虽然plusTipGetTracks可同时分析多个视频，plusTipSeeTracks一次只能分析一个视频。

1. 在命令窗口中输入“plusTipSeeTracks”。
2. 对话框加载完成后，点击“Select Project”。选择包含待可视化项目的父目录，然后点击“Select Folder”。新窗口将出现：“Select the project you want to visualize”。选择要可视化的文件，然后点击“OK”。
3. 接着点击“Select Saved ROI”。导航至与上一步所选相同的 roi_X 文件夹，并选择名为“roiYX”的文件。
4. 点击“Select Output Directory”以指定 MATLAB 保存轨迹可视化文件的路径。注意：建议使用包含其余数据的同一文件夹。
5. 选择“Make Track Movie”，屏幕将显示由 +TIP comets 计算出的所有轨迹。此步骤会将追踪的时间序列以电影格式保存在文件“allTracks_X_X_X”中。可选择将电影保存为 AVI 格式，否则默认格式为 Quicktime .mov 文件。

4. plusTipGroupAnalysis

注意：此最终函数用于创建电影组，以分析和比较其微管轨迹参数。

1. 在命令窗口中输入“plusTipGroupAnalysis”。若要手动选择需比较的组，请先取消勾选“从层级结构自动分组”。然后点击“选择项目”。浏览至包含所有待分析 roi_X 文件夹的父目录。
2. 将出现一个 listSelectGUI 界面。在屏幕左侧选择所有要包含在分组中的项目，并将其移至屏幕右侧。点击“确定”。选择保存项目列表的位置，然后点击“保存”。
3. 将弹出一个窗口：“请从列表中选择第一组”。点击“确定”。listSelectGUI 窗口将再次显示。此次仅选择对应于第一个需合并组的文件。点击“确定”。
4. 然后输入组名称，点击“确定”。将弹出窗口：“是否选择另一组？”根据需要回答并继续选择组。随后将出现窗口：“请选择保存组列表的位置”。导航至目标位置并点击“保存”。
5. 点击“选择输出目录”，以指定输出文件夹的存储位置。
6. 选择要执行的分组分析类型——是将各组的微管（MT）轨迹合并分析，还是按单个细胞进行分析。推荐的统计检验方法已预先设定。若要在分析中包含所有轨迹，请取消勾选“移除视频开头/结尾的轨迹”；否则，勾选此项将删除在视频开始或结束时正在进行的任何微管生长轨迹。
7. 完成分组分析选择后，点击“比较组”。

结果

按照本文所述使用该软件，将获得多个文件，其中包含在活细胞中定量分析 +TIP 动态的信息。

函数 plusTipGetTracks 可识别轨迹（使用 图1 中所示的示例设置），并提供有关 +TIP 轨迹的参数。要查看软件获取的信息，请进入在步骤 2.2 中创建的 roi_X 目录。“feat” 文件夹包含 “overlayImages”，这是一系列显示已检测到的彗星状信号的图像。使用图像分析软件检查这些图像可以验证彗星状信号检测的准确性。“meta” 文件夹还包含有关 +TIP 彗星的详细统计信息，包括 “projData” 文件和 “Stats” 文件。要查看 “Stats” 文件，可将其拖入电子表格应用程序的打开工作表中。该文件包含针对每段视频计算出的微管参数（图2）。如上所述，该软件可计算大量微管动态特异性参数（详见参考文献4），包括微管生长轨迹速度（微米/分钟）、生长轨迹寿命（秒）以及生长轨迹长度（微米）。

函数 plusTipSeeTracks 可保...

讨论

PlusTipTracker 提供了一个简单直观的图形用户界面，能够快速自动检测细胞或生长锥中几乎所有可见的 EB1-GFP 斑点，将这些斑点连接成轨迹，并计算微管参数。其他文献已报道过类似软件的设计（例如，Marx et al. 也利用了对生长锥中标记 EB1 动态的定量分析¹⁸）。然而，该软件在易获取性方面具有独特优势，因为它可从专注于为细胞生物学领域开发开源、即用型软件的 Danuser 实验室网站免费下载。尽管使用该软件需要具备 MATLAB 的访问权限，但用户无需完全熟悉该应用程序即可使用。不过，为了便于使用，仍有几点需要注意。

首先，初次使用该软件和计算机应用程序时，最常见的问题之一与文件路径有关。如果出现此错误（提示信息为“Error using cd – Argument must contain a string. Error in formatPath…”），最简单的解决方法是确保 plusTipTracker 软件以及包含所有“images”子目录的文件夹均位于同一“MATLAB”文件路径下。建议不要将这些文件...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
plusTipTracker 软件	Danuser Lab	http://lccb.hms.harvard.edu/software.html	该软件未来可能会由其他网站托管。  如果所列网站不存在，请在网页搜索引擎中搜索 "Danuser Lab Software" 以找到该网站。
MATLAB 软件	Mathworks	http://www.mathworks.com/products/matlab/