使用 plusTipTracker 软件测量微管动态 Xenopus laevis 生长锥

摘要

基于 MATLAB 的开源软件包 plusTipTracker 可用于分析荧光标记的 +TIPs 图像序列，以量化微管动力学。

摘要

微管（MT）正端追踪蛋白（+TIPs）定位于微管的生长正端，并调控微管动态^1,2。在研究微管动态时，最著名且广泛应用的+TIP之一是末端结合蛋白EB1，它可结合所有正在生长的微管正端，因此可作为微管聚合的标志物¹。以往许多关于生长锥中EB1行为的研究采用耗时且存在偏倚的计算机辅助手动追踪方法来分析单个微管^1-3。我们的方法是在培养的胚胎生长锥中获取标记EB1的高分辨率活细胞图像后，利用软件包plusTipTracker⁴来量化微管动态的整体参数⁵。该软件是一个基于MATLAB的开源、用户友好的工具包，能够对荧光标记的+TIP动态影像实现自动检测、追踪、可视化和分析。本文介绍了在培养的Xenopus laevis生长锥中，使用plusTipTracker分析荧光标记的+TIP彗星状信号的实验方案。然而，该软件也可用于表征多种细胞类型中的微管动态^6-8。

引言

本方法的目的是获取有关活体生长锥中微管（MT）正端追踪蛋白（+TIP）动态的定量信息。MT +TIP 是一类定位于微管正端的蛋白质^9,10。它们具有多种功能，可调控微管动态不稳定性¹¹的相关参数，包括聚合速率、灾变频率和恢复频率。分析微管动态的一种常用方法是追踪 +TIP 蛋白 EB1 的行为，EB1 可特异性结合正在生长的微管正端^1,12。已知 EB1 能招募多种其他蛋白质至生长中的微管正端^13,14，并且最近被确认为一种微管成熟因子¹⁵，可促进微管生长并增加灾变频率^15,16。

许多关于生长锥内微管（MT）动态的研究采用手动追踪方法，随时间测量EB1-GFP动态的变化^1-3，因为EB1在微管正端的定位可作为微管聚合的标志。利用EB1-GFP彗星状信号作为微管生长的替代指标，其关键优势在于即使在微管高度重叠的区域，也能测量微管动态。尽管手动追踪EB1-GFP彗星状信号的方法已为微管行为提供了有价值的见解^1-3，但该方法耗时且可能存在偏倚。此外，由于异常的生长锥行为可能源于细胞骨架动态的微小变化，仅分析少量微管（手动追踪时通常不可避免）可能会遗漏重要信息。

因此，我们使用软件包 plusTipTracker 来测量微管全局动态参数⁴

方案

本实验方案和视频旨在作为原始论文的配套材料，该论文更详细地描述了软件包⁴，同时也作为Danuser实验室网站上软件下载所附带的技术报告的补充。如果读者对软件的使用仍有其他疑问，建议仔细查阅这些文档。

1. 图像分析前的准备

1. 将每个延时电影转换为一系列 TIFF（标签图像文件格式）图像文件。如果某个电影中包含多个生长锥/细胞，首先裁剪每个生长锥/细胞，以创建各自独立的图像序列。
   注意：此步骤并非必需，因为在 plusTipTracker 中可以选择单独的兴趣区域（ROI）。然而，使用较小的图像尺寸可提高计算处理速度，因此如果图像中存在大量空白区域，建议执行此步骤。
2. 将每个 TIFF 序列保存在其各自的文件夹中，该文件夹命名为“images”，并位于 MATLAB 可访问的路径下（注意“images”区分大小写）。要添加新路径，请在“当前文件夹”窗口中导航至相关文件目录，右键单击目录图标，然后选择“添加到路径 – 所选文件夹及其子文件夹”。同样重要的是，必须将 plusTipTracker 软件文件夹也添加到路径中。

2. plusTipGetTracks

注意：图像分析的第一步是检测 EB1-GFP 斑点，将斑点连接成轨迹，并确定微管动力学的参数。此步骤通过命令“plu....

结果

按照本文所述使用该软件，将获得多个文件，其中包含在活细胞中定量分析 +TIP 动态的信息。

函数 plusTipGetTracks 可识别轨迹（使用 图1 中所示的示例设置），并提供有关 +TIP 轨迹的参数。要查看软件获取的信息，请进入在步骤 2.2 中创建的 roi_X 目录。“feat” 文件夹包含 “overlayImages”，这是一系列显示已检测到的彗星状信号的图像。使用图像分析软件检查这些图像可以验证彗星状信号检测的准确性。“meta” 文件夹还包含有关 +TIP 彗星的详细统计信息，包括 “projData” 文件和 “Stats” 文件。要查看 “Stats” 文件，可将其拖入电子表格应用程序的打开工作表中。该文件包含针对每段视频计算出的微管参数（图2）。如上所述，该软件可计算大量微管动态特异性参数（详见参考文献4），包括微管生长轨迹速度（微米/分钟）、生长轨迹寿命（秒）以及生长轨迹长度（微米）。

函数 plusTipSeeTracks 可保.......

讨论

PlusTipTracker 提供了一个简单直观的图形用户界面，能够快速自动检测细胞或生长锥中几乎所有可见的 EB1-GFP 斑点，将这些斑点连接成轨迹，并计算微管参数。其他文献已报道过类似软件的设计（例如，Marx et al. 也利用了对生长锥中标记 EB1 动态的定量分析¹⁸）。然而，该软件在易获取性方面具有独特优势，因为它可从专注于为细胞生物学领域开发开源、即用型软件的 Danuser 实验室网站免费下载。尽管使用该软件需要具备 MATLAB 的访问权限，但用户无需完全熟悉该应用程序即可使用。不过，为了便于使用，仍有几点需要注意。

首先，初次使用该软件和计算机应用程序时，最常见的问题之一与文件路径有关。如果出现此错误（提示信息为“Error using cd – Argument must contain a string. Error in formatPath…”），最简单的解决方法是确保 plusTipTracker 软件以及包含所有“images”子目录的文件夹均位于同一“MATLAB”文件路径下。建议不要将这些文件.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
plusTipTracker 软件	Danuser Lab	http://lccb.hms.harvard.edu/software.html	该软件未来可能会由其他网站托管。  如果所列网站不存在，请在网页搜索引擎中搜索 "Danuser Lab Software" 以找到该网站。
MATLAB 软件	Mathworks	http://www.mathworks.com/products/matlab/