本文介绍了一种研究排斥反应免疫学机制的实验方案。所采用的手术模型具有手术时间短、操作步骤简洁的特点。根据供体与受体小鼠品系的组合不同，移植肾脏可能出现急性细胞排斥反应或慢性移植物损伤，后者以间质纤维化和肾小管萎缩为特征。
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本文内容
摘要
摘要
人类移植肾的排斥反应仍然是导致发病和死亡的主要原因。肾移植的小鼠模型能够紧密模拟人类肾移植过程中的技术和病理过程。尽管目前已存在其他非肾脏器官的同种异体排斥小鼠模型，且技术上更具可行性，但有证据表明，不同器官引发的排斥模式和动态过程存在差异，例如在某些品系组合中，心脏和肾脏同种移植物的排斥反应时间进程显著不同。尽管该模型存在技术挑战，但由于多种原因，它仍是一种具有吸引力的研究工具。由于近交系小鼠单倍型已得到充分表征，因此可以选择特定的供体与受体组合，通过跨MHC I类和II类位点移植来模拟急性同种移植物排斥反应。相反，通过单倍型相似的品系间移植，则可诱导慢性过程，使同种移植肾出现间质纤维化和肾小管萎缩。我们已改进了手术技术，以缩短手术时间并提高操作便利性，但仍需克服一定的学习曲线，才能准确复制该模型。本研究将提供手术操作中的关键要点，有助于建立该技术。
引言
1955年，首次报道了在单卵双生双胞胎之间成功进行肾移植以治疗肾功能衰竭的案例1。自此以后，肾移植成为全球终末期肾功能衰竭患者的一种革命性治疗方法，显著延长了患者的生存时间并改善了生活质量2。然而，长期的移植物存活率受到多种病理过程的限制，这些过程可导致慢性同种移植物损伤3。
尽管免疫抑制治疗方案已取得显著改进，移植肾在人体内的排斥反应仍然是导致发病的主要原因。建立肾脏移植小鼠模型的目的在于紧密模拟人类肾脏移植过程及其病理特征4。Skoskiewicz et al. 于1973年首次描述了肾脏移植小鼠模型5。尽管该模型需要高超的显微外科技术，但由于小鼠基因组已得到充分表征，且针对小鼠研究存在大量可用的实验方法和技术，因此该模型仍是一项极为有价值的工具。
许多使用小鼠肾移植模型的研究团队将移植肾作为维持生命功能的器官，但在其他研究以及我们所描述的方法中，受体小鼠的一侧自体肾脏在实验全程中保持原位in situ保留4。这种方法的优势在于小鼠仅需接受一次麻醉和手术，从而降低了动物的发病率以及因二次操作导致死亡的风险。此外，小鼠也不会经历肾功能逐渐衰竭所带来的不良影响。
尽管在心脏和皮肤等其他器官中已存在同种....
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方案
在开展动物实验之前，应确保具备适当的国家和地方机构伦理审批。具体而言，在英国，以下实验均依据1986年《动物（科学程序）法案》进行。当有两名显微外科医生可同时操作时，供体手术由供体外科医生执行步骤1.1至1.16，然后执行步骤3.1至3.5，而受体手术则由受体外科医生同时执行步骤2.1至2.8。对于单人操作者，可依次按顺序完成各步骤。
1. 供体准备
注意：此处介绍的操作适用于8至16周龄、体重超过20 g的雄性供体C57BL/6BM12和受体C57BL/6小鼠。然而，该操作也可在多种小鼠品系上可靠地重复进行。代表性结果部分的数据来自C57BL/6、C57BL/6BM12和BALB/c小鼠。
- 使用无菌外科器械和耗材（经高压灭菌）进行操作，并尽可能保持手术区域无菌。若有两名外科医生，可同时进行供体和受体的准备工作。
- 通过腹腔注射（31G针头）给予小鼠美托咪啶（0.5 mg/kg）和盐酸氯胺酮（200 mg/kg）进行麻醉。该麻醉方案可维持约4小时，足以完成整个手术过程，无需追加麻醉。
- 确认小鼠已完全麻醉（对脚趾夹捏无反应）。
- 剃除小鼠腹部毛发，并用胶带清除松散的毛发。
- 将小鼠仰卧置于无菌覆盖的加热垫上，并用无菌医用胶带轻轻固定四肢。
- 在整个手术过程中监测小鼠....
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结果
通过组织学分析经甲醇-乙酸-乙醇（methacarn）固定并包埋于石蜡中的移植肾组织切片，可评估肾同种异体移植物排斥反应（图2）。在遗传背景相同的同系小鼠之间进行同基因型肾移植（isograft transplantation），会导致肾脏缺血-再灌注损伤，但在术后4周时，肾小管已基本恢复，组织学表现与正常肾脏相似。将C57BL/6小鼠的肾脏移植至BALB/c受体小鼠体内，可建立急性排斥反应模型；术后1周内，单核细胞广泛浸润肾实质，累及间质、肾小球及肾小管。将C57BL/6BM12小鼠的肾脏移植至C57BL/6受体小鼠体内，则可模拟慢性同种异体移植物损伤模型，其病理特征与人类慢性移植肾病相似，表现为间质纤维化及肾小管进行性丢失。通过高倍视野（×200放大）下的宏观肾小管计数，可定量评估功能性肾单位的质量（图3），肾小管数量减少反映了排斥反应所致的小管损伤。间质纤维化可通过广谱胶原染色剂苦味酸天狼星红（picrosirius red）进行识别（图4）。正常内源性胶原可见，但在慢性损伤过程中，新生胶原沉积，导致纤维化逐.......
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讨论
目前描述最为详尽的动脉吻合方法是将供体的远端主动脉（保留肾动脉连续性）以端侧吻合的方式连接至受体主动脉。我们介绍一种主动脉补片技术，类似于人类肾移植中所采用的“卡雷尔补片”（Carrell patch）技术，我们认为该方法更为便捷。尽管文献中关于供体和受体手术时间的报道较少，但我们认为，采用供体主动脉补片与受体主动脉吻合，相较于传统的供体远端主动脉与受体主动脉端侧吻合更具优势。使用补片技术可避免逐一游离供体腰动脉分支，也省去了逐个结扎这些分支所需的时间，因为补片吻合本身自然排除了这些分支的干扰。
实现该模型的关键步骤包括：需特别注意确保动脉补片吻合处除肾动脉外无其他动脉管腔，否则在移除微血管夹后会发生渗漏。构建吻合口的缝线可扎紧，但需注意 purse-string 效应，该效应可能导致吻合口狭窄，引起缺血或阻碍血流。实际操作中我们发现，只要椭圆形主动脉切口足够大，通常不会出现 purse-string 效应。静脉切口先用针头刺破，再用镊子牵拉扩大；我们认为这种方法优于直接剪开，因为镊子牵拉可形成一圈清晰可见的静脉组织，便于缝合，有助于建立稳定的吻合口。输尿管与膀胱的吻合是需要重点考.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究获得了英国肾脏研究基金会、爱丁堡皇家外科学院以及欧洲器官移植学会的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 手术器械 | |||
| 钝头解剖剪 | Fine Science Tools | 14072-10 | 用于皮肤切割 |
| 弯曲卡斯托维霍剪刀 | Fine Science Tools | 15017-10 | 用于组织切片 |
| 弹簧剪 – 直的 | 精细科学工具 | 15000-08 | 用于缝线剪断 |
| 1×2 齿有齿镊 | Fine Science Tools | 11021-12 | |
| 2 把精细尖头镊子（Dumont No.5） | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Dumont 5/45 角形精细尖头镊子 | Fine Science Tools | 11253-25 | 用于钝性解剖 |
| 弯曲精细尖头镊（Dumont No.7） | Fine Science Tools | 11273-22 | 便于传递容器 |
| 弯型克里尔止血钳 | Fine Science Tools | 1300-04 | |
| 带锁微型夹钳施夹器 | Fine Science Tools | 18056-14 | |
| 2个微型持针器，弹簧宽度2 mm，钳口长度4 mm | Fine Science Tools | 18055-04 | 微型血管夹 |
| 2 个 Colibri 3 cm 金属拉钩 | Fine Science Tools | 17000-03 | |
| 带锁的卡斯特罗维耶霍持针器 | Fine Science Tools | 120660-01 | |
| 伤口缝合器 | Fine Science Tools | 12031-07 | |
| 7 mm 伤口夹 | Fine Science Tools | 12032-07 | 术后7至10天拆除 |
| 仪器设备 | |||
| OPMI pico 显微镜 | 卡尔·蔡司 | S100 | |
| 带精细尖端的热灼器装置 | 盖格 | 150A | |
| 加热电子垫 | 库兹 舒适 | n/a | |
| Euroklav 23-S | Melag | n/a | 高压灭菌 |
| 一次性设备 | |||
| 7/0 丝线编织缝合线 | Pearsall | 30514 | |
| 10/0 Dafilon（聚酰胺）缝合线 | B-Braun | G1118099 | |
| 6/0 Vicryl（聚乳酸-羟基乙酸） | Ethicon | W9537 | |
| 常规斜面针头，1 英寸，21G | 贝克顿·迪金森公司 | 305175 | 用于输尿管吻合 |
| 常规斜面针，5/8英寸，25G | 贝克顿·迪金森公司 | 305122 | |
| 常规斜面针头，1/2英寸，30G | 贝克顿·迪金森公司 | 304000 | |
| 胰岛素注射针 1ml，29G | 贝克顿·迪金森公司 | 324827 | |
| 胰岛素注射针 0.3 ml，30G | 贝克顿·迪金森公司 | 324826 | |
| 1 ml 注射器滑动接头 | 贝克顿·迪金森公司 | 300184 | |
| 5 ml 注射器滑动接头 | 贝克顿·迪金森公司 | 302187 | |
| Wypall 纸质棉签 | Kimberly-Clark | L40 | 经高压灭菌器灭菌 |
| 棉签 | 强生公司 | n/a | 经高压灭菌器灭菌 |
| 普通铺巾 | 守护者 | CB03 | 经高压灭菌器灭菌 |
| 细胞培养皿 60 mm × 15 mm | 康宁公司 | 430166 | |
| 点样针 | B-Braun | DP3500L / 413501 | 与0.9%氯化钠溶液合用 |
| 试剂和药物 | |||
| （Lacri-Lube）白色软石蜡 57.3%，矿物油 42.5%，羊毛脂醇 0.2% | 艾尔建有限公司 | 21956GB10X | |
| （Videne）聚维酮碘 10% | Ecolab Ltd | PL 04509/0041 | |
| （Vetalar V）盐酸氯胺酮 | 辉瑞动物保健 | Vm 42058/4165 | 100 mg/ml 溶液（剂量 200 mg/kg） |
| （Domitor）盐酸右美托咪定 | Orion Pharma | Vm 06043/4003 | 1 mg/ml（剂量 0.5 mg/kg） |
| （Vetergesic）盐酸布托啡诺 | Alsto 动物健康 | Vm 00063/4002 | 0.3 mg/ml（剂量 0.05 mg/kg） |
| （抗镇静剂）盐酸阿替美唑 | Orion Pharma | Vm 06043/4004 | 5 mg/ml（剂量 2 mg/kg） |
| 威斯康星大学溶液 | Belzer 生命之桥 | n/a | 每只小鼠给予约500微升 |
| NaCl 0.9% | Baxter | FKE1323 | |
| 硫酸乙酰肝素 | 非专有 | n/a | 5000单位/毫升（剂量为每只小鼠5单位） |
参考文献
- Guild, W. R., Harrison, J. H., Merrill, J. P., Murray, J. Successful homotransplantation of the kidney in an identical twin. Trans. Am. Clin. Climatol Assoc. 67, 167-173 (1955).
- Wolfe, R. A., et al.
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