本文介绍了一种研究排斥反应免疫学机制的实验方案。所采用的手术模型具有手术时间短、操作步骤简洁的特点。根据供体与受体小鼠品系的组合不同，移植肾脏可能出现急性细胞排斥反应或慢性移植物损伤，后者以间质纤维化和肾小管萎缩为特征。
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本文内容
摘要
摘要
人类移植肾的排斥反应仍然是导致发病和死亡的主要原因。肾移植的小鼠模型能够紧密模拟人类肾移植过程中的技术和病理过程。尽管目前已存在其他非肾脏器官的同种异体排斥小鼠模型，且技术上更具可行性，但有证据表明，不同器官引发的排斥模式和动态过程存在差异，例如在某些品系组合中，心脏和肾脏同种移植物的排斥反应时间进程显著不同。尽管该模型存在技术挑战，但由于多种原因，它仍是一种具有吸引力的研究工具。由于近交系小鼠单倍型已得到充分表征，因此可以选择特定的供体与受体组合，通过跨MHC I类和II类位点移植来模拟急性同种移植物排斥反应。相反，通过单倍型相似的品系间移植，则可诱导慢性过程，使同种移植肾出现间质纤维化和肾小管萎缩。我们已改进了手术技术，以缩短手术时间并提高操作便利性，但仍需克服一定的学习曲线，才能准确复制该模型。本研究将提供手术操作中的关键要点，有助于建立该技术。
引言
1955年，首次报道了在单卵双生双胞胎之间成功进行肾移植以治疗肾功能衰竭的案例1。自此以后，肾移植成为全球终末期肾功能衰竭患者的一种革命性治疗方法，显著延长了患者的生存时间并改善了生活质量2。然而，长期的移植物存活率受到多种病理过程的限制，这些过程可导致慢性同种移植物损伤3。
尽管免疫抑制治疗方案已取得显著改进，移植肾在人体内的排斥反应仍然是导致发病的主要原因。建立肾脏移植小鼠模型的目的在于紧密模拟人类肾脏移植过程及其病理特征4。Skoskiewicz et al. 于1973年首次描述了肾脏移植小鼠模型5。尽管该模型需要高超的显微外科技术，但由于小鼠基因组已得到充分表征，且针对小鼠研究存在大量可用的实验方法和技术，因此该模型仍是一项极为有价值的工具。
许多使用小鼠肾移植模型的研究团队将移植肾作为维持生命功能的器官，但在其他研究以及我们所描述的方法中，受体小鼠的一侧自体肾脏在实验全程中保持原位in situ保留4。这种方法的优势在于小鼠仅需接受一次麻醉和手术，从而降低了动物的发病率以及因二次操作导致死亡的风险。此外，小鼠也不会经历肾功能逐渐衰竭所带来的不良影响。
尽管在心脏和皮肤等其他器官中已存在同种异体排斥反应的模型，但这些模型并不总是与肾移植直接相关。有证据表明，这些模型引发的排斥反应模式和动态过程各不相同，例如在某些品系组合中，心脏同种移植物与肾同种移植物的排斥时间进程存在显著差异6。我们曾描述过将BALB/c品系供体的肾脏移植至非转基因FVB/nj小鼠体内所引发的急性肾同种移植物排斥模式，该模型表现为以T细胞和巨噬细胞积聚为特征的细胞介导性损伤7。此外，我们也建立了一种慢性同种移植物损伤模型，表现为间质性纤维化和肾小管萎缩，该模型通过将C57BL/6BM12品系供体的肾脏移植至C57BL/6受体小鼠体内实现，因为这些小鼠仅在一个主要组织相容性复合体II类基因位点上存在错配8。
利用小鼠肾移植模型已对移植的多个方面进行了研究，包括急性排斥反应、细胞免疫与体液免疫排斥反应、缺血-再灌注损伤以及新型治疗药物的试验。 我们改进了手术技术，以缩短手术时间并提高手术操作的便利性。特别是我们描述了供体与受体的同步准备，以及通过采用连续性主动脉片吻合技术来简化血管吻合过程。本视频与文稿将提供关键要点，以帮助建立该技术。
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方案
在开展动物实验之前，应确保具备适当的国家和地方机构伦理审批。具体而言，在英国，以下实验均依据1986年《动物（科学程序）法案》进行。当有两名显微外科医生可同时操作时，供体手术由供体外科医生执行步骤1.1至1.16，然后执行步骤3.1至3.5，而受体手术则由受体外科医生同时执行步骤2.1至2.8。对于单人操作者，可依次按顺序完成各步骤。
1. 供体准备
注意：此处介绍的操作适用于8至16周龄、体重超过20 g的雄性供体C57BL/6BM12和受体C57BL/6小鼠。然而，该操作也可在多种小鼠品系上可靠地重复进行。代表性结果部分的数据来自C57BL/6、C57BL/6BM12和BALB/c小鼠。
- 使用无菌外科器械和耗材（经高压灭菌）进行操作，并尽可能保持手术区域无菌。若有两名外科医生，可同时进行供体和受体的准备工作。
- 通过腹腔注射（31G针头）给予小鼠美托咪啶（0.5 mg/kg）和盐酸氯胺酮（200 mg/kg）进行麻醉。该麻醉方案可维持约4小时，足以完成整个手术过程，无需追加麻醉。
- 确认小鼠已完全麻醉（对脚趾夹捏无反应）。
- 剃除小鼠腹部毛发，并用胶带清除松散的毛发。
- 将小鼠仰卧置于无菌覆盖的加热垫上，并用无菌医用胶带轻轻固定四肢。
- 在整个手术过程中监测小鼠是否发生热灼伤。如有可能，应使用非电热源。
- 涂抹眼用润滑剂，并用稀释的碘溶液对腹壁进行消毒。
- 沿腹中线做切口进入腹腔，插入3 cm Calibri腹腔牵开器。
- 使用预热的生理盐水保持肠道及手术区域湿润，避免内脏不必要的干燥。
- 用无菌手术巾覆盖小鼠，并将肠道移至操作者左侧（小鼠右侧），以暴露主动脉、下腔静脉和左肾。
- 用带锁扣的镊子夹住胃部并向上牵拉，充分暴露主要血管和左肾。将湿润的无菌纱布块（2 mm × 2 mm）填塞入腹腔，以将肝脏叶、精囊和肠管等组织从手术区域推开。
- 使用精细尖头镊子钝性分离结缔组织，将左肾从腹腔内的周围外膜、脂肪组织及左肾上腺中游离出来。将镊子闭合的尖端置于需分离的组织之间，缓慢张开镊尖以分离间隙。
- 使用9/O尼龙线结扎并切断左肾上腺静脉和左性腺静脉，从而游离左肾静脉。结扎线应靠近肾静脉放置。
- 使用7/O丝线在靠近膀胱处结扎并切断输尿管，保留较长的线尾。这些长线尾在肾脏摘取时将被使用，且为输尿管吻合所必需。
- 为充分游离肾动脉和肾静脉上下方的主动脉与下腔静脉，使用精细尖头镊子钝性分离血管前侧及两侧的淋巴管和脂肪组织。
- 找到主动脉与下腔静脉之间的组织平面，缓慢张开镊子。逐渐打开精细尖头镊的尖端，以最小创伤分离组织。
- 使用弯头精细尖镊将7/O丝线绕过血管后方，在肾动脉上下方的主动脉上各放置一根松结。在肾脏摘取前收紧这些缝线，以便逆行灌注威斯康星大学溶液（University of Wisconsin solution）。
2. 受体准备
根据供体准备，执行步骤 1.2 至 1.8。
- 将肠管移向操作者右侧（小鼠左侧），以暴露腹主动脉和下腔静脉。用无菌生理盐水浸湿的棉片覆盖肠管。
- 通过使用7/0丝线结扎右侧肾动脉和肾静脉，随后切断，完成右肾切除术。
- 使用7/0丝线结扎右侧输尿管并切断。
- 游离并完全解剖肾动脉和肾静脉下方的腹主动脉与下腔静脉，操作如步骤1.14和1.15所述。确保腹主动脉与下腔静脉之间完全分离。注意保护走行于下腔静脉和腹主动脉前方的精索内动脉及其伴随的淋巴管束。
- 辨认从下腔静脉发出、穿过后腹膜至脊柱的腰动静脉，使用9/0丝线连续结扎，无需切断这些血管。
- 确认有足够的空间放置微血管夹，并预留血管吻合所需的操作间隙。
- 通过阴茎背侧静脉给予静脉注射肝素（5单位）。
3. 供体肾脏的获取
收紧已放置在腹主动脉下端和上端的7/0丝线结扎线，以隔离肾脏的动脉血流。
- 使用针头（31G）将0.2–0.5 ml低温威斯康星大学溶液逆行灌注入主动脉。
- 在缝线范围内剪断主动脉，并在肾静脉与下腔静脉汇合处剪断肾静脉，以连同一段主动脉一并取出肾脏及肾动脉。若存在起源于主动脉的腰血管，无需结扎，直接剪断。
- 将肾脏置于培养皿中无菌棉签上的冷生理盐水中。
- 通过颈椎脱位法处死供体小鼠。
4. 肾脏移植——肾脏准备
- 在肾动脉正对侧纵向切开主动脉壁，制备主动脉补片。辨认补片中需要结扎或在进行动脉吻合时需避开的任何血管管腔。
- 从外向内穿过肾静脉管腔上方置入一根10/O缝线，下方另置入第二根独立的缝线。用于分离肾上腺静脉和生殖腺静脉的缝线可用于确定血管的方向。
- 将肾脏置于受体右侧腹侧（图1.1），并确保缝线位置恰当，以便顺利完成血管吻合，同时避免缝线与纱布或其他器械缠绕。
5. 肾脏移植——血管吻合
先在下侧，再在上侧应用微血管夹，夹闭下腔静脉和主动脉。
- 使用针头（31G）穿刺下腔静脉前壁制作静脉切口，然后注入约 50 μl 的 0.9% NaCl 溶液冲洗下腔静脉内的血液。
- 用精细尖头镊子在静脉切口内张开，扩大切口，使其长度等于供体肾静脉的直径。
- 将已置于肾静脉腔内的 10/O 上方缝线首先固定在静脉切口的顶端（图 1.2），然后以连续缝合方式缝合吻合口的后壁，直至到达下端顶点（图 1.3）。
- 放置 10/O 下方缝线，先打一个单结（图 1.4），然后与后壁的连续缝线打结连接。
- 使用下方缝线以连续缝合方式构建吻合口的前壁（图 1.5），并在上方顶点处与上方缝线末端打结（图 1.6）。
- 用镊子夹起主动脉壁，用剪刀剪出一个椭圆形补片，形成主动脉切口（主动脉切口的长度应约为主动脉周长的五分之一，且为肾动脉管腔长度的三倍）。
- 从外向内将一根 10/O 缝线置于主动脉补片的上端点（图 1.7），穿过主动脉，并在主动脉切口的上端顶点外侧打结。
- 从上方开始，以连续缝合方式完成动脉吻合，将供体补片与受体主动脉吻合（图 1.8），注意缝合时不可过紧，以免造成吻合口狭窄（图 1.9）。
- 先移除下方血管夹，再移除上方血管夹，以恢复肾脏血流灌注（图 1.10 和 图 1.11）。若输尿管血供充足，可能观察到输尿管明显的蠕动。
6. 肾脏移植——输尿管吻合
- 分离膀胱与腹壁之间的所有粘连组织。
- 用一根针头（21G）从左至右穿过膀胱双侧壁。
- 将直血管钳的钳尖插入针的内腔，并将血管钳再次穿过膀胱壁，使血管钳从膀胱左侧穿出，方向由右向左。
- 将供体输尿管上的缝线牵拉通过膀胱，使输尿管经膀胱左侧缺损处进入，再从右侧穿出。
- 使用带圆体针的9/O尼龙缝线，在输尿管进入点周围以三个单独的间断缝合将输尿管外膜与膀胱外膜缝合固定。
- 在结扎线近端切断输尿管，从而开放输尿管以允许尿液流出，并使输尿管末端回缩至膀胱腔内。此时可观察到尿液生成，同时可能伴有输尿管周围血管的出血。
- 使用单个间断的9/O丝线缝合关闭膀胱右侧的缺损。
7. 恢复与术后护理
将胃肠道脏器按原有解剖位置还纳至腹腔，并使用6/0可吸收缝线缝合腹直肌以关闭腹壁。
- 使用金属皮夹闭合皮肤。
- 皮下注射盐酸阿替帕唑（10 μl/g）部分逆转麻醉。
- 皮下注射盐酸布托啡诺（0.05 mg/kg）进行镇痛，并皮下注射0.9% NaCl溶液1 ml以提供液体支持。
- 将小鼠置于28 °C的保温柜中恢复24至48小时。在整个实验期间观察小鼠是否出现疾病症状。
- 术后7–10天拆除金属皮夹。
- 实验结束后，采用颈椎脱位法处死小鼠。
- 取下并对侧肾脏及异体移植物进行收集，用于组织学分析。
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结果
通过组织学分析经甲醇-乙酸-乙醇（methacarn）固定并包埋于石蜡中的移植肾组织切片，可评估肾同种异体移植物排斥反应（图2）。在遗传背景相同的同系小鼠之间进行同基因型肾移植（isograft transplantation），会导致肾脏缺血-再灌注损伤，但在术后4周时，肾小管已基本恢复，组织学表现与正常肾脏相似。将C57BL/6小鼠的肾脏移植至BALB/c受体小鼠体内，可建立急性排斥反应模型；术后1周内，单核细胞广泛浸润肾实质，累及间质、肾小球及肾小管。将C57BL/6BM12小鼠的肾脏移植至C57BL/6受体小鼠体内，则可模拟慢性同种异体移植物损伤模型，其病理特征与人类慢性移植肾病相似，表现为间质纤维化及肾小管进行性丢失。通过高倍视野（×200放大）下的宏观肾小管计数，可定量评估功能性肾单位的质量（图3），肾小管数量减少反映了排斥反应所致的小管损伤。间质纤维化可通过广谱胶原染色剂苦味酸天狼星红（picrosirius red）进行识别（图4）。正常内源性胶原可见，但在慢性损伤过程中，新生胶原沉积，导致纤维化逐...
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讨论
目前描述最为详尽的动脉吻合方法是将供体的远端主动脉（保留肾动脉连续性）以端侧吻合的方式连接至受体主动脉。我们介绍一种主动脉补片技术，类似于人类肾移植中所采用的“卡雷尔补片”（Carrell patch）技术，我们认为该方法更为便捷。尽管文献中关于供体和受体手术时间的报道较少，但我们认为，采用供体主动脉补片与受体主动脉吻合，相较于传统的供体远端主动脉与受体主动脉端侧吻合更具优势。使用补片技术可避免逐一游离供体腰动脉分支，也省去了逐个结扎这些分支所需的时间，因为补片吻合本身自然排除了这些分支的干扰。
实现该模型的关键步骤包括：需特别注意确保动脉补片吻合处除肾动脉外无其他动脉管腔，否则在移除微血管夹后会发生渗漏。构建吻合口的缝线可扎紧，但需注意 purse-string 效应，该效应可能导致吻合口狭窄，引起缺血或阻碍血流。实际操作中我们发现，只要椭圆形主动脉切口足够大，通常不会出现 purse-string 效应。静脉切口先用针头刺破，再用镊子牵拉扩大；我们认为这种方法优于直接剪开，因为镊子牵拉可形成一圈清晰可见的静脉组织，便于缝合，有助于建立稳定的吻合口。输尿管与膀胱的吻合是需要重点考...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究获得了英国肾脏研究基金会、爱丁堡皇家外科学院以及欧洲器官移植学会的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 手术器械 | |||
| 钝头解剖剪 | Fine Science Tools | 14072-10 | 用于皮肤切割 |
| 弯曲卡斯托维霍剪刀 | Fine Science Tools | 15017-10 | 用于组织切片 |
| 弹簧剪 – 直的 | 精细科学工具 | 15000-08 | 用于缝线剪断 |
| 1×2 齿有齿镊 | Fine Science Tools | 11021-12 | |
| 2 把精细尖头镊子（Dumont No.5） | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Dumont 5/45 角形精细尖头镊子 | Fine Science Tools | 11253-25 | 用于钝性解剖 |
| 弯曲精细尖头镊（Dumont No.7） | Fine Science Tools | 11273-22 | 便于传递容器 |
| 弯型克里尔止血钳 | Fine Science Tools | 1300-04 | |
| 带锁微型夹钳施夹器 | Fine Science Tools | 18056-14 | |
| 2个微型持针器，弹簧宽度2 mm，钳口长度4 mm | Fine Science Tools | 18055-04 | 微型血管夹 |
| 2 个 Colibri 3 cm 金属拉钩 | Fine Science Tools | 17000-03 | |
| 带锁的卡斯特罗维耶霍持针器 | Fine Science Tools | 120660-01 | |
| 伤口缝合器 | Fine Science Tools | 12031-07 | |
| 7 mm 伤口夹 | Fine Science Tools | 12032-07 | 术后7至10天拆除 |
| 仪器设备 | |||
| OPMI pico 显微镜 | 卡尔·蔡司 | S100 | |
| 带精细尖端的热灼器装置 | 盖格 | 150A | |
| 加热电子垫 | 库兹 舒适 | n/a | |
| Euroklav 23-S | Melag | n/a | 高压灭菌 |
| 一次性设备 | |||
| 7/0 丝线编织缝合线 | Pearsall | 30514 | |
| 10/0 Dafilon（聚酰胺）缝合线 | B-Braun | G1118099 | |
| 6/0 Vicryl（聚乳酸-羟基乙酸） | Ethicon | W9537 | |
| 常规斜面针头，1 英寸，21G | 贝克顿·迪金森公司 | 305175 | 用于输尿管吻合 |
| 常规斜面针，5/8英寸，25G | 贝克顿·迪金森公司 | 305122 | |
| 常规斜面针头，1/2英寸，30G | 贝克顿·迪金森公司 | 304000 | |
| 胰岛素注射针 1ml，29G | 贝克顿·迪金森公司 | 324827 | |
| 胰岛素注射针 0.3 ml，30G | 贝克顿·迪金森公司 | 324826 | |
| 1 ml 注射器滑动接头 | 贝克顿·迪金森公司 | 300184 | |
| 5 ml 注射器滑动接头 | 贝克顿·迪金森公司 | 302187 | |
| Wypall 纸质棉签 | Kimberly-Clark | L40 | 经高压灭菌器灭菌 |
| 棉签 | 强生公司 | n/a | 经高压灭菌器灭菌 |
| 普通铺巾 | 守护者 | CB03 | 经高压灭菌器灭菌 |
| 细胞培养皿 60 mm × 15 mm | 康宁公司 | 430166 | |
| 点样针 | B-Braun | DP3500L / 413501 | 与0.9%氯化钠溶液合用 |
| 试剂和药物 | |||
| （Lacri-Lube）白色软石蜡 57.3%，矿物油 42.5%，羊毛脂醇 0.2% | 艾尔建有限公司 | 21956GB10X | |
| （Videne）聚维酮碘 10% | Ecolab Ltd | PL 04509/0041 | |
| （Vetalar V）盐酸氯胺酮 | 辉瑞动物保健 | Vm 42058/4165 | 100 mg/ml 溶液（剂量 200 mg/kg） |
| （Domitor）盐酸右美托咪定 | Orion Pharma | Vm 06043/4003 | 1 mg/ml（剂量 0.5 mg/kg） |
| （Vetergesic）盐酸布托啡诺 | Alsto 动物健康 | Vm 00063/4002 | 0.3 mg/ml（剂量 0.05 mg/kg） |
| （抗镇静剂）盐酸阿替美唑 | Orion Pharma | Vm 06043/4004 | 5 mg/ml（剂量 2 mg/kg） |
| 威斯康星大学溶液 | Belzer 生命之桥 | n/a | 每只小鼠给予约500微升 |
| NaCl 0.9% | Baxter | FKE1323 | |
| 硫酸乙酰肝素 | 非专有 | n/a | 5000单位/毫升（剂量为每只小鼠5单位） |
参考文献
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- Zhang, Z., et al. Pattern of liver, kidney, heart, and intestine allograft rejection in different mouse strain combinations. Transplantation. 62, 1267-1272 (1996).
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