通过SPOT方法合成的多肽阵列可用于分析蛋白质赖氨酸甲基转移酶（PKMTs）的底物特异性，并确定PKMTs的底物谱，从而理解其生物学功能。本实验方案描述了如何合成多肽阵列，使用PKMTs进行甲基化反应，并对结果进行分析。
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本文内容
摘要
摘要
赖氨酸甲基化是一种新出现的翻译后修饰，已在多种组蛋白和非组蛋白上被发现，在细胞发育及多种疾病中发挥关键作用。目前已在不同蛋白质上鉴定了约5000个赖氨酸甲基化位点，这些修饰由数十种蛋白质赖氨酸甲基转移酶（PKMT）催化形成。这表明每种PKMT可甲基化多种蛋白质，但迄今为止，其中许多酶仅发现一到两个底物。为解决这一问题，我们引入了基于肽阵列的PKMT底物特异性分析方法。肽阵列是表征PKMT特异性的有力工具，因为可在同一阵列上测试多种不同序列底肽的甲基化情况。我们使用Intavis SPOT合成仪在纤维素膜上合成了肽阵列，并分析了多种PKMT的特异性。根据实验结果，我们为其中多种酶鉴定了新的底物。例如，通过肽阵列研究NSD1发现，该酶甲基化H4的K44位点，而非此前报道的H4K20位点；此外，H1.5K168是其高度优先的底物，而非先前已知的H3K36。因此，肽阵列是生化表征PKMT的有力工具。
引言
在过去的二十年中，多项研究证明了翻译后修饰（PTM）在细胞发育以及癌症等多种疾病中的重要性。近年来，蛋白质赖氨酸甲基化作为一种关键的翻译后修饰受到广泛关注。最初发现组蛋白赖氨酸甲基化是一种重要的染色质标记，后续研究进一步表明，多种非组蛋白也可发生赖氨酸甲基化1-4。甲基基团从S-腺苷甲硫氨酸逐级转移至赖氨酸残基的ε-氨基上，这一过程由一类称为蛋白质赖氨酸甲基转移酶（PKMTs）的酶催化，人类基因组中包含超过60种此类蛋白。PKMTs最初被发现是能够甲基化特定赖氨酸残基的组蛋白修饰酶，但后续研究证实它们也可甲基化多种非组蛋白5。迄今为止，已在不同蛋白质上鉴定了约5000个赖氨酸甲基化位点6，但负责这些修饰的具体酶类往往尚未明确。其中一个原因是大多数PKMTs的底物特异性尚未得到系统研究。因此，不断有新的PKMTs底物被发现。对PKMTs底物特异性的认识不足，限制了对其生物学功能和作用机制的理解。为了深入研究某种PKMT的底物特异性，需要测量并比较大量仅在一个或少数几个氨基酸上存在差异的肽段底物的甲基化速率，这一过程最适合通过肽阵列技术来实现。基于所得的特异性谱型，可进一步识别出PKMTs的潜在底物，并开展后续研究。
多肽阵列是广泛用于抗体、多肽修饰酶的生化分析以及蛋白质-蛋白质相互作用位点（抗体-抗原、受体-配体）定位的研究工具7-9。此类应用通常需要合成数百条多肽。目前已有多种多肽合成方法....
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方案
1. 肽阵列的制备
- 肽序列的编程
- 使用 MultiPep Spotter 软件设计用于合成的肽序列。以单字母代码输入肽序列。
肽 1：T A R K S T G G K A - 通过特定命令（.replace, A）生成丙氨酸或精氨酸扫描文库，以筛选识别特定底物所必需的关键氨基酸。例如，在以下示例中，第一行为野生型序列，从第二行开始，肽中的每个氨基酸依次被替换为丙氨酸。
replace, A
T-A-R-K-S-T-G
A-A-R-K-S-T-G
T-A-R-K-S-T-G
T-A-A-K-S-T-G
T-A-R-A-S-T-G
T-A-R-K-A-T-G
T-A-R-K-S-A-G
T-A-R-K-S-T-A - 使用类似的命令（.replace R, .replace N 等），如 1.1.2 所述，对所有天然存在的氨基酸残基（可选择性排除半胱氨酸、甲硫氨酸和色氨酸，因为这些残基易被氧化且有时导致合成产率降低）进行操作，以 合....
- 使用 MultiPep Spotter 软件设计用于合成的肽序列。以单字母代码输入肽序列。
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结果
多肽阵列已成功用于生化表征蛋白质赖氨酸甲基转移酶（PKMT）的特异性，并通过该方法鉴定出多个新的组蛋白及非组蛋白底物5,16-19。确定一种PKMT（或任何酶）正确的底物谱是理解其分子机制和细胞功能的关键步骤。
作为肽段SPOT阵列甲基化方法应用的一个示例，我们描述了NSD1 PKMT特异性分析的结果19。在本研究之前，该酶被报道可甲基化多个底物，包括组蛋白H3的K36位点和组蛋白H4的K20位点，以及NF-κB家族转录因子p65的K218和K221位点。图4A展示了一个使用NSD1进行肽阵列甲基化反应的示例。在该实验中，基于H3（31-49）序列合成了一个大型肽阵列，其中包含了原始序列中每个氨基酸位置所有可能的单个氨基酸替换，以检测每个氨基酸对NSD1结合和甲基化的重要性。总共合成了380种肽段（20种可能的氨基酸 × 18个残基，加上每行中的一个原始H3序列）。横轴表示肽段的序列，纵轴表示在相应肽段中被替换的氨基酸。例如，第17行第4列的斑点在其第三位含有苏氨酸，取代了野生型序列中存在的甘氨酸（
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讨论
本文所述的SPOT合成是一种用于绘制蛋白质-蛋白质相互作用位点以及研究肽修饰酶底物识别的有力方法。然而，SPOT合成仍存在某些局限性，因为尽管已有报道表明通过SPOT方法合成的肽纯度超过90%21，但在每次实验中都难以确认其实际纯度。因此，必须通过其他方法对结果进行验证，例如使用蛋白质结构域或采用标准方法合成的纯化肽。此外，SPOT芯片的另一主要缺点是大多数情况下无法重复使用同一张芯片进行多个实验。
为了提高使用稳定性较低的氨基酸（如受保护的精氨酸）进行合成的效率，建议每进行5个循环就重新制备一次。在酶促反应或蛋白质结合研究中，常常观察到肽点的边缘信号强度高于中心区域（“环状斑点效应”）。这种效应可能是由于肽点中心区域肽的密度较高所致，可通过降低肽合成规模来解决22。如遇其他肽合成问题，应参考仪器操作手册或联系厂商技术服务。若未观察到甲基化现象，应在膜上添加阳性对照肽（即已知可被所研究酶甲基化的肽）。
除了SPOT芯片外，还可使用高密度肽微阵列23
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致谢
本工作得到了 DFG 资助项目 JE 252/7 的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 乙醇 abs 梯度级 HPLC | 霍尼韦尔 | 10299901 | 易燃 |
| N,N二甲基甲酰胺 肽合成 | Biosolve | 4193302 | 易燃，有毒 |
| 哌啶 ≥99% 用于多肽合成 | Roth | A122.1 | 易燃、有毒、腐蚀性 |
| Oxyma Pure（乙基（羟基亚氨基）氰基乙酸酯） | Novabiochem | 8510860100 | |
| N,N’二异丙基碳二亚胺 purum ≥98% GC | Fluka | 38370 | 易燃、有毒、腐蚀性 |
| 乙酸酐 | Roth | CP28.1 | 易燃、有毒、腐蚀性 |
| 三异丙基硅烷 99% | Aldrich | 233781 | 易燃，有毒 |
| 二氯甲烷 ≥99.9% | Roth | P089.1 | 致癌的 |
| NN-甲基-2-吡咯烷酮 | Roth | 4306.2 | 有毒的 |
| 衍生化纤维素膜 | Intavis AG Köln | 32.1 | |
| 三氟乙酸 | Roth | P088.2 | 有毒，腐蚀性 |
| 溴酚蓝 | AppliChem | A3640.0010 | |
| 碳酸氢铵 | Roth | T871.2 | 有毒的 |
| 十二烷基硫酸钠颗粒 | Roth | CN30.3 | 有毒，易燃 |
| MultiPep 合成仪 | Intavis AG Köln | 未提供 | |
| HyperfilmTM 高性能胶片 | GE Healthcare | 28906837 | |
| Phoretix 软件 | TotalLab | 无 |
参考文献
- Margueron, R., Reinberg, D. Chromatin structure and the inheritance of epigenetic information. Nat. Rev. Genet. 11, 285-296 (2010).
- Dawson, M. A., Kouzarides, T. Cancer epigenetics: from mechanism to therapy. Cell. 150, 12-27 (2012).
- Helin, K., Dhanak, D.
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重印与许可
