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方法文章

一个 离体 少突胶质细胞靶向性T细胞攻击在急性脑切片中的模型

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DOI：

10.3791/52205

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2015年2月5日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, University of Münster, 2Germany and Interdisciplinary Center for Clinical Research (IZKF) Münster, 3Institute of Physiology I - Neuropathophysiology I, University of Münster

本文内容

摘要

为了研究炎性脱髓鞘疾病皮层病变中脱髓鞘和神经元凋亡的机制，需采用不同的动物模型。本文介绍一种离体（ex vivo）方法，即将少突胶质细胞特异性的CD8+ T细胞作用于脑切片，从而诱导少突胶质细胞和神经元死亡。文中还讨论了该模型的潜在应用及其局限性。

摘要

少突胶质细胞死亡伴随神经元和轴突破坏，是多发性硬化症（MS）等炎性脱髓鞘疾病中皮质及皮质下灰质病变典型的组织病理学表现。在这些疾病中，主要为CD8+ 在灰质病变中发现具有假定髓鞘和少突胶质细胞相关抗原特异性的T细胞，提示神经元凋亡可能是这些细胞的附带效应。目前已建立多种动物模型，用于研究上述病理生理过程的潜在机制。然而，尽管这些模型能够模拟多发性硬化症（MS）的某些方面，但仍无法解析“附带性”神经元死亡的精确机制和时间进程。为解决这一问题，本文展示了一种研究少突胶质细胞靶向CD8⁺ T细胞介导的神经元损伤机制及其时间响应的实验方案。+ T细胞攻击。为了仅靶向髓鞘和少突胶质细胞， 体外 活化的少突胶质细胞特异性CD8+ T细胞被转移至急性分离的脑切片中。经过特定的孵育时间后，可在不同感兴趣区域分析髓鞘和神经元损伤情况。本文将讨论该模型的潜在应用及局限性。

引言

少突胶质细胞死亡以及髓鞘破坏，伴随神经元和轴突的丧失，是多发性硬化症（MS）患者灰质病灶中典型的病理学发现1,2。皮质病灶迄今可分为三种不同亚型2：软脑膜下型、皮质内型和白质-皮质交界型病灶。与白质斑块相比，灰质病灶中的炎性浸润以CD8+ T细胞为主，提示其在灰质炎症中可能发挥关键作用3。此外，在血液、脑脊液（CSF）及炎性病灶内部，均可发现CD8+ T细胞自身的寡克隆扩增现象4-6。

与此一致，人们认为 CD8+ T 细胞可能针对不同的髓鞘蛋白具有特异性7,8。事实上，CD8+ T 细胞出现在表达 MHC I 类分子11的少突胶质细胞和髓鞘附近9,10，因此可能参与了髓鞘的丢失过程。这一过程常伴随中枢神经系统（CNS）灰质中广泛的“继发性”神经元和轴突损伤1,2。实际上，CD8+ T 细胞可通过两种不同机制直接或间接诱导少突胶质细胞和神经元死亡：（i）通过释放穿孔素和颗粒酶形成细胞毒性颗粒，导致细胞膜肿胀和破裂；（ii）与其表面的 Fas 受体结合或表达 FasL8,12,13。

为研究上述过程的潜在机制，已建立了多种动物模型。在这方面，引物化的CD8+ 可将针对中枢神经系统胶质细胞（如少突胶质细胞或星形胶质细胞）中诱导性表达的自身抗原特异性的T细胞过继转移，以分析随后在灰质中发生的“间接性”神经元和轴突死亡14,15. 为了执行此类操作 体内 实验有助于模拟多发性硬化症的某些病理生理特征，但该方法不适用于解析轴突损伤和神经元凋亡的潜在机制及动力学过程。

为了克服这些限制，已建立一种离体（ex vivo）方法，用于研究少突胶质细胞特异性CD8+ T细胞攻击后神经元细胞死亡的机制及时间进程。由于免疫细胞应仅靶向少突胶质细胞，从而影响髓鞘的形成，因此使用主要组织相容性复合体I类（MHC class-I）限制性、对卵清蛋白（ovalbumin, OVA）有反应的OT-I T细胞16。随后将这些细胞转移至从特异性在少突胶质细胞中表达OVA的转基因小鼠（ODC-OVA小鼠）获取的脑切片中17。

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方案

所有使用小鼠的实验均应遵循相应机构动物护理与使用委员会的指导原则。

1. 小鼠实验的一般注意事项

  1. 将小鼠饲养于无病原体环境中，并可自由获取食物和水。
    注意：实验组中应使用年龄和性别相匹配的小鼠，因为免疫学特征可能随年龄和性别而变化。

2. OVA特异性CD8+ T细胞（OT-I）的制备与激活

  1. 在制备脑切片前5天，按照下述方法对OT-I T细胞进行刺激。
    注：每片脑切片需要5 × 105个活化的效应性CD8+ OT-I T细胞（该细胞来源于转基因小鼠，其CD8+ T细胞仅在MHC-I分子背景下识别OVA257-264肽段）。该浓度5 × 105是通过实验确定的最佳值，既能促进细胞迁移入切片后形成良好的细胞间相互作用，又可避免细胞数量过高引发过度反应，从而有利于单细胞计数8,18。
  2. 准备用于培养OT-I T细胞的培养基。向500 ml DMEM中添加5%胎牛血清（FCS）、10 mM HEPES、2 mM L-谷氨酰胺、50 µM 2-巯基乙醇、1%非必需氨基酸和25 µg/ml庆大霉素。将培养基在4 °C下保存，直至使用。
  3. 按照参考文献16所述方法取出OT-I转基因小鼠的脾脏，并将其转移至已准备好的培养基中。
  4. 通过70 µm细胞筛研磨脾脏以制备单细胞悬液，并在4 °C下以300 × g离心5分钟。
  5. 将细胞悬液与5 ml氯化铵-氯化钾（ACK）缓冲液（150 mM NH4Cl，10 mM KHCO3，0.1 mM EDTA，pH 7.3）孵育5分钟，以裂解红细胞。
  6. 加入10 ml培养基终止孵育，并按上述条件再次离心。
  7. 用培养基稀释细胞悬液并进行计数。以每孔3 × 107个细胞的密度将细胞接种于12孔板中，并通过与OVA257–264（SIINFEKL；1 nM）和白细胞介素2（IL-2）（500 IU/ml）共同孵育5天进行初始激活。
  8. 在第4天后，再次加入IL-2至终浓度为500 IU/ml。
  9. 刺激完成后，使用基于小鼠CD8+ T细胞阴性筛选的分离试剂盒，按照制造商说明书从细胞悬液中纯化OT-I T细胞。该纯化过程利用针对CD4、CD11b、CD11c、CD19、CD45R（B220）、CD49b（DX5）、CD105、MHC II类分子、Ter-119和TCRγ/δ的抗体混合物，去除所有非CD8+细胞，随后通过磁性柱分离获得纯化的CD8+ T细胞。
    注：制造商指出该流程中的关键步骤：反应体系中必须仅为单细胞，因为细胞团块 可能在洗脱过程中堵塞柱子；在加入生物素标记抗体混合物前对细胞进行计数，对于样品的纯度至关重要；整个操作应在冰上进行，以最大限度减少非特异性抗体结合。

3. 急性脑切片的制备及其与OT-I T细胞的共培养

  1. 在制备急性脑切片之前19，使用200 mM蔗糖、20 mM PIPES、2.5 mM KCl、1.25 mM NaH₂PO₄的冰冻生理盐水溶液配制放置2PO4，10 mM MgSO₄4，0.5 CaCl2 以及10 mM葡萄糖和人工脑脊液（ACSF），其中ACSF包含125 mM NaCl、2.5 mM KCl、1.25 mM NaH₂PO₄2PO4，24 mM NaHCO₃3，2 mM MgSO₄4，2 mM CaCl2，10 mM 葡萄糖。使用 NaOH 将每种溶液的 pH 值调节至 7.35。在调节 ACSF 的 pH 值之前，必须先用 95% O₂2 和5% CO₂2.
  2. 预冷溶液。
  3. 麻醉8至10周龄小鼠（例如， C57Bl/6 作为对照或转基因 ODC-OVA 小鼠17 使用5.0%异氟烷或5.0%氟烷吸入，或腹腔注射100 mg/kg氯胺酮和10 mg/kg体重的赛拉嗪。等待麻醉生效后，通过脚趾夹捏法评估麻醉深度，随即断头处死。依照机构动物护理与使用委员会的安乐死标准对小鼠实施安乐死。
  4. 将小鼠置于腹侧位。消毒后沿矢状方向切开头皮。沿矢状方向打开颅骨，借助铲子迅速取出脑组织，并用胶水将其固定在振动切片机的样品板上。
  5. 用预冷的生理盐水溶液填充培养板。
  6. 使用振动切片机切割300 µm厚的冠状切片。
    注意：已知该操作步骤可在至少8小时内获得可用于功能性细胞研究的存活完整组织标本19-21事实上，超过这一时间后，从6小时开始，制备的组织质量即出现下降，表现为基本功能特性和动作电位产生与传导等功能特性的改变。
  7. 切片后，立即将每一片转移至盛有ACSF的12孔板的各个孔中。
  8. 小心加入 5 x 105 每片 OT-I T 细胞数
  9. 将切片在培养箱中孵育最多 8 小时（37 °C，5% CO₂）2).
  10. 孵育结束后，收集切片，使用OCT包埋剂（Tissue-Tek）包埋，并在液氮中速冻，随后于-20 °C保存，以备后续组织学研究。 例如， 评估神经元结构例如， 使用抗MAPII或抗突触素抗体）或细胞凋亡（例如， 使用抗Caspase-3抗体和抗NeuN抗体，按照标准操作步骤进行。

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结果

脑切片与靶向少突胶质细胞的CD8+ T细胞共孵育后，少突胶质细胞和神经元均发生凋亡（分别为图2A和图1C）。凋亡的组织学标志物（例如，Caspase-3、Tunel）最早可在孵育3小时后检测到。为保证制备样本的良好质量和结果的可重复性，孵育时间不应超过8小时。凋亡细胞在整个切片中均可观察到，但在有髓鞘区域更为集中。切片结构完整性和凋亡神经元的代表性组织学染色见图1A-C。

在孵育过程中，有多个不同的时间点对于评估结果参数具有重要意义。我们实验室通常进行的时间过程分析包括：在相互作用开始时（0小时）以及开始后3、4和6小时（观察到最大相互作用）进行细胞间相互作用的参数分析。以下简要描述一些除组织学分析外常可应用的典型检测方法：

T细胞恢复与分析

经过最长8小时的孵育后，可从组织切片中回收T细胞，并用于分析细胞内效应分子相关参数，如细胞因子产生或增殖情况。为回收T细胞，...

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讨论

近几十年来，已报道了多种动物模型，用于研究多发性硬化症（MS）等炎性脱髓鞘疾病的病理特征。体内小鼠和大鼠模型被广泛用于模拟该疾病的病理生理特征，即分析脱髓鞘与再髓鞘化过程以及伴随发生的炎症与神经退行性变事件的后果。然而，只有离体研究方法才能解析其确切的潜在机制。

急性脑切片的制备也是一种广泛应用的模型，具有较高的可靠性和可重复性。结合少突胶质细胞特异性免疫细胞的分离与孵育，该方法可用于回答特定的实验问题，尤其是在研究免疫细胞攻击的机制与动力学以及细胞间相互作用方面。其他ex vivo方法也已被认知并广泛使用22，而本实验方案的新颖之处在于其靶标的特异性，可通过进行不同的“排除性”共染色加以验证，即检测野生型（WT）在暴露或未暴露于OT-I T细胞条件下Caspase3的免疫反应性（见图2C）。

在制备过程中应考虑若干关键点，特别是实验设置，以确保实验在方法学上正确实施；为保证内部有效性，所用免疫细胞的分离与刺激应定期通...

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披露

作者声明不存在相互竞争的经济利益。

致谢

本工作由明斯特大学跨学科临床研究中⼼（IZKF）（SEED 03/12，SB）、德国研究基金会（SFB TR128，项目B6资助SGM，ME3283/2-1资助SGM）以及明斯特大学创新医学研究基金（I-BI111316，SB和SGM）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
12孔板Corning3513
2-巯基乙醇Gibco31350-010
2-甲基丁烷Roth3927.1
70 µm 细胞筛Falcon352350
CaCl2Merck1.02382.0500氯化钙
CD8+-分离试剂盒Miltenyi Biotech130-090-859
D(+)-葡萄糖Merck1.08337.1000
DMEMGibco31966-021使用前于37 °C 水浴中预热
EDTASigmaE5134
FCSPAA LaboratoriesA15-151胎牛血清
庆大霉素Gibco15750-060
HEPES 1 MGibco15630-050
IL-2Peprotech212-12
异氟烷Abbott05260-05
KClMerck1.04933.0500氯化钾
KHCO3SigmaP9144碳酸氢钾
L-谷氨酰胺Gibco35050-038
MgSO4Merck1.05886.0500硫酸镁
NaClSigma31434氯化钠
NaH2PO4 * H2OMerck1.06346.0500磷酸二氢钠
NaHCO3Merck1.06329.0500碳酸氢钠
NaOHMerck1.09137.1000氢氧化钠
NH4ClSigma213330氯化铵
非必需氨基酸Gibco11140-050
OVA (257-264)GenscriptRP10611卵清蛋白
PIPESSigmaP6757
蔗糖Merck1.07687.1000
组织固定剂 OCTSakura4583

参考文献

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