小鼠左前降支冠状动脉永久性结扎：心肌梗死后心室重构与心力衰竭模型

摘要

心力衰竭是导致住院的首要原因，也是死亡的主要原因之一。通过建立小鼠左前降支冠状动脉永久性结扎模型，用于研究心肌梗死后的心室重构和心脏功能障碍。本文介绍了在小鼠中进行有创血流动力学测量的技术。

摘要

心力衰竭是一种综合征，指心脏无法以满足静息或应激状态下细胞氧需求的速率泵血。其特征为液体潴留、呼吸困难和乏力，尤其在体力活动时更为明显。心力衰竭是一个日益严重的公共卫生问题，是住院治疗的首要原因，也是导致死亡的主要原因之一。缺血性心脏病是心力衰竭的主要病因。

心室重构是指左心室在结构、大小和形态上的改变。这种左心室的结构重构可由损伤（例如，心肌梗死）、压力超负荷（例如，全身性动脉高血压或主动脉瓣狭窄）或容量超负荷所引起。由于心室重构会影响心室壁应力，因此对心脏功能及心力衰竭的发展具有深远影响。在小鼠中，通过永久性结扎左前降支冠状动脉来建立模型，用于研究心肌梗死后的心室重构和心脏功能变化。该模型在研究目的和病理生理相关性方面，与左前降支冠状动脉短暂结扎模型有本质区别。在后者即缺血/再灌注损伤模型中，再灌注后心肌挽救的程度可能受到多种因素的调节，从而影响梗死范围的初始大小。相比之下，在永久性结扎左前降支冠状动脉后24小时，梗死区域已固定不变。在此模型中，心脏功能将受到以下两方面的影响：1）梗死区扩展、梗死愈合及瘢痕形成的过程；以及2）伴随发生的左心室扩张、心脏肥厚和心室重构的发展。

除了永久性结扎左前降支冠状动脉的模型外，本文还详细介绍了小鼠侵入性血流动力学测量的技术。

引言

心力衰竭是一种综合征，其特征是心脏无法以满足细胞在静息或应激状态下氧需求相匹配的速率泵送血液。其典型表现包括液体潴留、呼吸困难和乏力，尤其在体力活动时更为明显。心力衰竭正成为一个日益严重的公共卫生问题，是住院治疗的主要原因，也是导致死亡的重要因素。缺血性心脏病是心力衰竭的主要病因¹。

心室重构是指左心室的结构、大小和形状发生改变。换句话说，心室重构涉及左心室结构的改变。这种左心室的结构性重构可由损伤（例如心肌梗死）、压力超负荷（例如全身性动脉高血压或主动脉狭窄）或容量超负荷（例如二尖瓣关闭不全）所引起。由于心室重构会影响心室壁应力，因此对心脏功能及心力衰竭的发展具有深远影响。

急性心肌梗死后心肌组织的丧失会导致收缩期射血功能下降，以及左心室舒张末期容积和压力升高。根据Frank-Starling机制，舒张末期容积增加可导致收缩期产生更高的压力，从而有助于恢复心输出量。然而，伴随而来的室壁应力增加可能在非梗死区域诱发局部肥厚，而在梗死区域则可能发生扩张和变薄。动物实验研究表明，梗死的心室会发生肥厚，且肥厚程度与梗死灶大小相关²。

急性心肌梗死后心肌组织的丧失会导致负荷条件突然增加。由于梗死组织被拉伸和扩张，左心室容积增大，因此梗死后心室重构发生在容量超负荷的背景下。心室容积的增加不仅意味着前负荷增加（舒张末期心室壁的被动张力），也意味着后负荷增加（收缩射血期间心肌壁的总张力）。由于收缩期半径增大，后负荷随之增加。因此，心肌梗死后的心室重构具有容量超负荷和压力超负荷的混合特征。

心肌由三个相互关联的组分构成：心肌细胞、细胞外基质和毛细血管微循环。这三个 组分均参与心肌重构过程。由炎症细胞产生的基质金属蛋白酶可导致心肌细胞间胶原支柱降解和心肌细胞滑移，从而引起梗死区扩张，其特征是梗死节段出现不成比例的变薄和扩张³。在重构的后期阶段，会发生间质性纤维化，进而对心脏的舒张功能产生不利影响。

在心室重构过程中，心肌内的血管和心肌细胞区室应保持平衡，以避免组织缺氧^4,5。心肌肥厚是否会进展为心力衰竭，可能关键取决于心肌内血管区室与心肌细胞区室之间的这种平衡。

通过结扎小鼠左前降支冠状动脉的永久性模型，用于研究心肌梗死后的心室重构及心脏功能变化。该模型在研究目的和病理生理相关性方面，与左前降支冠状动脉短暂结扎模型存在根本性差异。在后者即缺血/再灌注损伤模型中，梗死范围的初始程度可能受到再灌注后影响心肌挽救因素的调节⁶。相比之下，左前降支冠状动脉永久结扎后24小时的梗死区域已固定不变。在此模型中，心脏功能将受到以下两方面的影响：1）梗死区扩展、梗死愈合及瘢痕形成的过程；以及2）左心室扩张、心脏肥厚和心室重构的同步发展。

方案

注意：本节所述所有实验程序均经鲁汶天主教大学机构动物护理与研究咨询委员会批准（项目编号：154/2013-B De Geest）。

1. 左前降支冠状动脉的永久性结扎

1. 通过腹腔注射40 mg/kg至70 mg/kg的戊巴比妥钠使小鼠麻醉。当小鼠对用力夹捏脚趾无反应时，表明其已达到适当的麻醉深度。在任何外科手术或干预操作前，均应以此方式确认麻醉效果。使用润滑性眼膏以防止角膜在麻醉期间干燥。 在手术开始前2-4小时给予术前镇痛（皮下注射布托啡诺0.05 mg/kg）。
   1. 在可存活动物手术中应始终采用无菌技术。实施尽可能最大限度抑制微生物污染的程序，以避免发生明显感染或化脓。这些程序包括使用无菌器械和无菌材料、对手术区域进行消毒，以及去除手术部位的毛发并对手术部位进行消毒。
2. 使用自制的钝头20号针头对小鼠进行气管插管。
   1. 将小鼠仰卧放置，并使头部过度伸展。
      1. 将光源聚焦于颈部区域。用钝头镊子抬起舌头，可清晰看到喉部入口。
      2. 在直视下将钝头针头经喉部插入气管。通过将小鼠连接至呼吸机来评估插管是否正确（潮气量（µl）：3 × 体重（g）+ 155；频率：每分钟120次呼吸）。
   2. 或者，可先小心暴露气管以增强经气管插管的可视性。
      1. 在颈部正中做一5 mm切口，并牵开气管上方的肌肉组织。
      2. 使用手术体视显微镜直视气管进行插管操作。抬起舌头，将自制的钝头20号针头插入气管。通过将小鼠连接至呼吸机确认插管正确（潮气量（µl）：3 × 体重（g）+ 155；频率：每分钟120次呼吸）。
3. 保持小鼠仰卧位，并用胶带固定。手术过程中将小鼠置于加热垫上，以防止低体温。
   1. 使用碘伏对皮肤进行剃毛和消毒。注意使左后肢交叉于右后肢之上，以便在手术期间更好地暴露左心室。
4. 在胸骨处做一小的横向皮肤切口，并分离皮下皮肤和肌肉。
5. 用5-0丝线将m. pectoralis minor和m. pectoralis major向两侧牵开。
6. 插入钝头镊子，在第三肋间做一切口。
7. 将镊子从外侧向内侧穿过肋间肌，直至到达胸骨。从胸腔内向外顶出镊子尖端，使其穿破皮肤。随后用小剪刀紧贴镊子上方小心剪开肋间肌，完成开胸术。采用此技术可避免刺破肺组织。
8. 将浸有0.9% NaCl的海绵放入胸腔以保护肺组织。将伤口牵开器（胸腔牵开器）置入肋间空间，以充分暴露心脏左侧。此时在体视显微镜下可清晰观察到左心房、左心室及左前降支冠状动脉。
9. 在左心耳尖端下方约1 mm处，使用单根6-0聚丙烯缝线结扎左前降支冠状动脉。该位置位于第一对角支远端。
   注：也可选用7-0（直径0.05 mm）或8-0（直径0.04 mm）缝线。缝针为C-1型，13 mm长，3/8圆弧，锥形针尖。成功结扎左前降支冠状动脉后会立即出现心肌变色，表现为受累区域心肌呈苍白色。
10. 移除伤口牵开器（胸腔牵开器）。
    1. 在肋间空间周围放置三根6-0 Ti-Cron缝线。在收紧缝线前，从胸腔中取出海绵，并通过阻断呼吸机出气口使肺复张。此操作可使肺重新贴附于壁层胸膜。
    2. 随后拉紧缝线，并通过按压胸部重复进行肺复张。使用少量生理盐水检查胸腔闭合是否成功（按压胸部时不应观察到气泡逸出）。
    3. 透过肋间肌观察肺组织是否正常扩张。将两块胸肌复位，作为预防气胸的额外屏障。
11. 使用5-0丝线缝合皮肤。
12. 将小鼠与呼吸机断开，让其在加热垫上恢复。在动物恢复足够意识以维持胸卧位之前，不得无人看管。接受手术的动物在完全恢复前不得与其他动物合笼饲养。
13. 持续提供术后镇痛（皮下注射布托啡诺0.05 mg/kg，每日两次，术后至少持续48小时）。 

2. 在体 小鼠的侵入性血流动力学测量

1. 在操作前，将1.0 French Millar压力导管浸入37 °C的无菌水中至少30分钟，以尽量减少信号漂移。在0 mm Hg和100 mm Hg下对压力传感器进行电子校准，并以2,000 Hz的频率记录数据。
2. 通过腹腔注射1.4 g/kg的乌拉坦实施麻醉。当小鼠对用力夹捏脚趾无反应时，确认其已达到适当的麻醉深度。
3. 将麻醉后的小鼠置于仰卧位，用胶带固定四肢。使用加热垫维持体温，并通过直肠探头进行监测。剃除颈部区域的毛发，沿颈部正中做切口以暴露甲状腺。
4. 使用弯针固定颈部。
5. 拨开唾液腺，暴露右侧颈总动脉。迷走神经呈白色细线状，沿动脉走行。使用弯头镊子小心地将颈总动脉与迷走神经分离。
6. 将弯头镊子从右侧颈总动脉下方穿过，将其与其他组织分离。清除动脉周围的结缔组织。
7. 在右侧颈总动脉下方穿过两根6-0丝线。将靠近头部的上方丝线打紧结，靠近近端并用Kocher钳夹闭固定（远端阻断性结扎）。将近端丝线从左至右绕两圈，并用两个Kocher钳固定（近端非阻断性丝线）。
8. 通过滴加无菌0.9% NaCl保持颈总动脉湿润。用棉签吸去多余液体。
9. 在远端结扎线与近端非阻断性丝线之间的位置，使用26号针头在右侧颈总动脉上做切口。
10. 将压力传感器插入动脉。确认无血液渗漏。轻柔推进1.0 French Millar压力导管，并调整近端非阻断性丝线，使导管可小心地从锁骨下方穿过丝线。
    1. 调整近端非阻断性丝线时应尽量减少血液流失。推进过程中避免过度压迫压力传感器，因其极为脆弱。由于近端丝线不得阻断动脉，血管应始终保持充血状态。
11. 开始记录压力信号。在健康小鼠中，动脉压力信号在舒张压60–70 mm Hg与收缩压100–120 mm Hg之间波动。
12. 引导导管经无名动脉和主动脉进入左心室。心室压力在0 mm Hg与100–120 mm Hg之间波动。让导管在左心室内稳定。根据实验需求，记录信号30至60分钟。
13. 实验结束后，将导管浸泡于1% Alconox溶液中30分钟。用Milli-Q水清洗导管，并将其存放在泡沫块中。
14. 从记录软件中提取数据以进行进一步分析。
    1. 进行数据分析时，选择压力信号稳定的时段。选取至少10个连续的心动周期作为感兴趣的数据段。
    2. 使用LabChart软件8.0版本或类似软件分析心率、左心室最大收缩压、左心室最小舒张压、等容收缩期左心室压力上升最大速率（dP/dt_max）、等容舒张期左心室压力下降最大速率（dP/dt_min）、左心室舒张末期压力以及等容左心室压力下降的时间常数（tau）⁷。
       注：舒张末期压力对应于等容收缩引起压力骤升前的即时压力值。tau的计算基于将左心室压力拟合为单指数衰减曲线，表达式为P_(t)=P₀e^-t/tau + b。在此公式中，P_(t)表示达到dP/dt最大负值后时间t时的左心室压力。参数b对应理论渐近线，在简化处理中可假设为零。等容舒张功能增强时，tau值减小。

结果

心肌梗死范围可通过伊文思蓝/2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）双染法进行评估。TTC 是一种氧化还原指示剂，在NADH⁸存在的情况下，由于活组织中多种脱氢酶的作用，可被转化为深红色的1,3,5-三苯基甲臜。图1显示了左冠状动脉前降支结扎后24小时心脏的代表性切片。蓝色染色区域表示非缺血/正常区域。风险区域心肌定义为左冠状动脉前降支结扎远端灌注区域内心肌组织。深红色染色区域表示缺血但仍有活力的区域（风险区域中未梗死部分），而未着色区域（淡红色）则表示梗死区域。在此模型中，风险区域中未梗死的部分极小，在本图像中不可见，这反映了左冠状动脉前降支结扎的永久性特征。梗死区域通常占左心室壁总面积的50–60%^9,10。在梗死区演变过程中应区分两个组成部分：1）由于梗死区扩张，梗死的三维几何形态可能发生改变，导致心肌梗死变薄但范围更广；2）梗死总体积可能缩小，这反映了伤口收缩和瘢痕形成所伴随的愈合过程。

梗死扩张可通过评估梗死长度和梗死厚度的时间进程进行量化¹⁰左前降支冠状动脉永久性结扎术后2...

讨论

可通过多种小鼠模型研究心肌结构和功能的慢性改变、左心室功能障碍的发生以及向心力衰竭的进展¹²。心脏重构和功能障碍可由心肌损伤引起，也可由横主动脉缩窄所致的压力超负荷引发，或可在扩张型心肌病的遗传模型中进行研究¹²。显然，小鼠模型最显著的优势在于拥有大量转基因和基因敲除品系，包括细胞类型特异性和可诱导型转基因模型。超高清二维和三维超声心动图、微型磁共振成像、采用微型测压法进行血流动力学评估，以及用于压力-容积环分析的微型测压导纳技术等技术的发展，极大地方便了在这些模型中对心脏重构的评估。在本报告中，我们重点研究了由永久性结扎左前降支冠状动脉引起的心肌损伤模型，并通过左心室微型测压法评估左心室功能。

首个小鼠心肌梗死模型由 Zolotareva et al¹³ 于 1978 年描述。该永久性闭塞模型应与 Michael et al¹⁴ 首次描述的左前降支冠状动脉短暂闭塞小鼠模型明确区分。后者用于研究缺血-再灌注损伤及心肌挽救，而永久性结扎则用于研究心肌梗死后心脏重...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
丁丙诺啡（Buprenex）	Bedford Laboratories
戊巴比妥钠（Nembutal）	Ceva
聚维酮碘（Betadine）	VWR internationals	200065-400
5-0 丝线缝合线	Ethicon, Johnson & Johnson Medical	K890H
6-0 Prolene 缝合线	Ethicon, Johnson & Johnson Medical	F1832
6-0 Ti-Cron 缝合线	Ethicon, Johnson & Johnson Medical	F1823
尿烷	Sigma	94300
Alconox	Alconox Inc.
呼吸机，MiniVent 型号 845	Hugo Sachs	73-0043
胸腔牵开器或胸廓牵开器	Kent Scientific corporation	INS600240	ALM 自持式、带锯齿、7 cm 长、4 x 4 "L" 形爪，3 mm x 3 mm
1.0 French Millar 压力导管	Millar Instruments	SPR - 1000/NR
Powerlab	ADInstruments Pty Ltd.
LabChart® 软件	ADInstruments Pty Ltd.
直肠探针	ADInstruments Pty Ltd.