小鼠骨骼肌中DNA损伤的检测与分析 原位 使用TUNEL法

摘要

本视频介绍了小鼠骨骼肌的解剖、组织处理、切片以及基于荧光的TUNEL标记方法。同时介绍了一种TUNEL标记的半自动化分析方法。

摘要

末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）脱氧尿苷三磷酸（dUTP）缺口末端标记（TUNEL）是一种利用TdT酶将标记的dUTP共价连接到细胞中双链和单链DNA断裂的3’末端的方法。该方法是一种可靠且有用的原位检测DNA损伤和细胞死亡的技术。in situ。本视频介绍了小鼠骨骼肌的解剖、组织处理、切片以及基于荧光的TUNEL标记方法，同时还介绍了一种半自动化的TUNEL信号定量方法。组织固有的正常结构特征及组织处理条件会影响TdT酶对DNA进行高效标记的能力；组织处理过程还可能引入非特异性自发荧光，干扰TUNEL信号的检测。因此，必须通过实验确定合适的组织处理和TUNEL标记方法，以获得最佳的信噪比，便于后续定量分析。本文所述的基于荧光的检测方法可通过数字通道减除法排除自发荧光信号。若配合恰当的组织处理技术和对照设置，TUNEL检测是一种相对快速、可重复且定量的组织中凋亡检测方法。该方法可用于确认DNA损伤和细胞凋亡作为病理机制的存在，识别受影响的细胞类型，并评估体内治疗干预的效果。in vivo。

引言

末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）dUTP缺口末端标记（TUNEL）是一种利用TdT酶将dUTP连接到双链和单链DNA断裂的3’末端的技术^12,23。Gavrieli 等人et al.^1,12,24在20多年前首次报道了用于检测细胞凋亡和DNA损伤的TUNEL方法。此后，该方法已在不同组织样本制备中得到评估和优化^7,23,27,40。TUNEL已被用于研究缺血诱导的神经元^6,14,29和心肌细胞^43,44死亡、兴奋性毒性神经元死亡^30,31，以及作为关节炎治疗中的生物标志物³⁹。此外，TUNEL还被用作多种人类癌症中的预后因子和肿瘤细胞标志物^{2,3,15,32,37,38,42}。

检测DNA损伤和细胞死亡的替代方法虽然存在，但均存在技术挑战和局限性。Southern印迹法可用于定量整体组织裂解液中的DNA损伤^7,9-11，但该方法无法提供细胞水平的分辨率，且难以实现准确定量。彗星实验是一种基于细胞的替代方法，需从细胞中提取保存完好的细胞核^4,20,28,36。尽管彗星实验在培养的分离细胞中效果良好，但从骨骼肌组织中制备完整细胞核则困难得多^8,21。与Southern印迹法类似，彗星实验也无法从整体肌肉组织匀浆中提供特定细胞类....

方案

注意：本方案中所述的所有动物实验操作均按照相关指南中的建议进行 实验动物护理和使用的指南 美国国立卫生研究院²⁶该方案（MO13M391）已获约翰斯·霍普金斯大学动物护理与使用委员会批准。

1. 新生小鼠的处死、解剖与固定

1. 通过吸入 CO₂ 处死一只新生小鼠。
2. 立即在膝关节上方切断后肢。出生后约 7 天内，腿骨足够柔软，可使用大型实验剪刀或锋利刀片切断，并随后在冷冻切片机上进行切片。
3. 将后肢放入含有 10 ml 冰冷的 4% 多聚甲醛磷酸盐缓冲液（PBS）的 15 ml 管中。
4. 在 4 °C 条件下，将后肢浸入多聚甲醛中固定 4–24 小时。胚胎组织仅需数小时固定即可。
   1. 避免固定时间超过 24 小时，因为这可能会降低 TUNEL 检测效率。
5. 通过将后肢浸入蔗糖溶液中进行冷冻保护。
   1. 在同一个 15 ml 管中，将多聚甲醛更换为 PBS 配制的 10% 蔗糖溶液，4 °C 过夜孵育。
   2. 更换为 PBS 配制的 30% 蔗糖溶液，4 °C 过夜孵育，或直至后肢沉降至管底。若蔗糖溶液已通过无菌滤膜过滤，组织可在 30% 蔗糖溶液中保存更长时间。

结果

染色成功时，TUNEL阳性信号应足够明亮，可通过设定强度阈值将其与自发荧光区分开来。在低倍镜下，骨骼肌中的TUNEL阳性信号可能呈现为明亮而不规则的碎片（图1A）。然而，若涉及的细胞死亡类型为凋亡，则在高倍镜下应观察到部分具有典型凋亡形态的TUNEL阳性结构（图1B）。阳性对照（添加DNase）应显示丰富的TUNEL阳性信号，且在切片的所有组织中均匀分布（图1C）。阴性对照（反应中省略TdT酶）应仅显示低强度背景信号和自发荧光信号（图1D）。在整条腿的切片中，皮肤可作为内部阳性对照，因为该组织具有较高的正常凋亡率（图1A）。

红细胞、骨组织和内皮细胞可能会产生显著的自发荧光信号（图2）。建议在未进行荧光标记的情况下，分别在独立通道中对每个切片成像，以确保不会将自发荧光误判为TUNEL阳性信号。真正的TUNEL阳性信号强度应远高于自发荧光，因此可通过设定图像强度阈值将其分离（

讨论

本文介绍了一种检测和定量分析小鼠骨骼肌中与DNA损伤相关的细胞凋亡的方法。该操作流程包括组织采集、TUNEL染色、数字图像获取以及图像分析。实验需要常规组织学耗材和工具，并需使用特定的商用TUNEL试剂盒。所需的主要大型设备包括冷冻切片机、配备数字成像功能的落射荧光显微镜，以及用于图像分析的计算机系统。

实验人员应注意潜在的陷阱。组织自发荧光是荧光成像中的一个主要问题。在未灌注的动物中，残留的红细胞会产生较强的自发荧光信号。内皮细胞也可能具有显著的自发荧光。因此，必须确认未将自发荧光误判为TUNEL阳性信号。这一评估可通过在无荧光染料的通道中采集图像来实现，用于与TUNEL阳性通道进行比较，必要时进行背景扣除。通过这种方式，基于荧光的TUNEL方法优于基于比色法的明场显微技术，后者无法提供背景染色的内部对照。

组织固定对TUNEL标记的成功具有显著影响。最好将多聚甲醛固定时间缩短至最低限度，不超过24 hr。胚胎和新生组织所需的固定时间应明显短于24 hr。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
磷酸盐缓冲液中的4%多聚甲醛	Electron Microscopy Sciences	19202	本实验所述步骤中，4%溶液由粉末新鲜配制。可使用任意供应商提供的多聚甲醛。配制好的甲醛溶液应保存在4 °C，且不可在过期后使用（有效期最长数月）。多聚甲醛为致癌物，经吸入或皮肤接触具有毒性。操作多聚甲醛时，请遵循材料安全数据表（MSDS）中规定的防护措施。
蔗糖	Sigma	S0389	用于组织冷冻前的冷冻保护。可使用任意供应商提供的蔗糖。
O.C.T. 包埋剂	Tissue-Tek	4583	冷冻切片的包埋介质。
冷冻切片机	Leica	CM 3050S	本实验所用为Leica CM3050S冷冻切片机。任何能够切割10 μm切片的冷冻切片机均可使用。
载玻片，25 × 75 × 1 mm	Fisher	12-552-3	可使用任意供应商提供的载玻片。
明胶	Sigma	G-9391	明胶用于促进组织切片在载玻片上的附着。明胶包被载玻片的制备方法：将2.75 g明胶和0.275 g铬矾溶于500 ml蒸馏水中，加热至60 °C，将载玻片浸入数秒后取出晾干。可使用任意供应商提供的明胶。也可直接购买预包被明胶的载玻片。
十二水合硫酸铬钾（铬矾）	Sigma	243361	铬矾添加至明胶溶液中以增强组织在载玻片上的附着能力。其为可能的致癌物，经吸入或皮肤接触具有毒性。操作铬矾时，请遵循材料安全数据表（MSDS）中规定的防护措施。
Vectabond组织粘附试剂	Vector Labs	SP-1800	可选底物，用于增强组织在载玻片上的附着；也可使用明胶包被的载玻片替代。
Tween20	Sigma	P9416	用于组织通透的去垢剂。可使用任意供应商提供的Tween20。
Triton X100	Sigma	T8787	用于组织通透的去垢剂。可使用任意供应商提供的Triton X100。
TACS 2 TdT 荧光 原位 凋亡检测试剂盒	Trevigen	4812-30-K	基于荧光的TUNEL标记商用试剂盒。
DNase/核酸酶	Trevigen	4812-30-K	（随试剂盒提供）
DNase/核酸酶缓冲液	Trevigen	4812-30-K	（随试剂盒提供）
10×磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.4	Amresco	780	配制1× PBS用于洗涤和稀释。可使用任意供应商提供的PBS。
无DNase水	Quality Biologicals	351-029-131	可使用任意供应商提供的水。
Hoechst 33258	Sigma	94403	细胞核染料。可使用任意蓝色荧光细胞核染料。Hoechst为DNA结合染料，疑似致癌物，操作时应佩戴防护装备以减少皮肤接触。
Parafilm M封口膜	multiple	807	可使用其他疏水性膜或盖玻片。可从多个供应商处获得。
配备数字相机的荧光显微镜	--	--	任何能够分别在红、绿、蓝通道中数字采集荧光信号的荧光显微镜均可使用。
Vectashield抗荧光淬灭封片剂	Vector Labs	H-1000	可使用任意供应商提供的抗荧光淬灭封片剂。
盖玻片，1号厚度	Brain Research Labs	2222-1	可使用任意供应商提供的盖玻片。22 × 22 mm的最小尺寸足以覆盖新生小鼠腿部切片。
指甲油	Ted Pella	114-8	用于密封盖玻片。可使用任意供应商（包括普通零售商）提供的指甲油。避免使用带有颜色或添加剂的指甲油，以免在荧光成像过程中产生光反射。