小鼠骨骼肌中DNA损伤的检测与分析 原位 使用TUNEL法

摘要

本视频介绍了小鼠骨骼肌的解剖、组织处理、切片以及基于荧光的TUNEL标记方法。同时介绍了一种TUNEL标记的半自动化分析方法。

摘要

末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）脱氧尿苷三磷酸（dUTP）缺口末端标记（TUNEL）是一种利用TdT酶将标记的dUTP共价连接到细胞中双链和单链DNA断裂的3’末端的方法。该方法是一种可靠且有用的原位检测DNA损伤和细胞死亡的技术。in situ。本视频介绍了小鼠骨骼肌的解剖、组织处理、切片以及基于荧光的TUNEL标记方法，同时还介绍了一种半自动化的TUNEL信号定量方法。组织固有的正常结构特征及组织处理条件会影响TdT酶对DNA进行高效标记的能力；组织处理过程还可能引入非特异性自发荧光，干扰TUNEL信号的检测。因此，必须通过实验确定合适的组织处理和TUNEL标记方法，以获得最佳的信噪比，便于后续定量分析。本文所述的基于荧光的检测方法可通过数字通道减除法排除自发荧光信号。若配合恰当的组织处理技术和对照设置，TUNEL检测是一种相对快速、可重复且定量的组织中凋亡检测方法。该方法可用于确认DNA损伤和细胞凋亡作为病理机制的存在，识别受影响的细胞类型，并评估体内治疗干预的效果。in vivo。

引言

末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）dUTP缺口末端标记（TUNEL）是一种利用TdT酶将dUTP连接到双链和单链DNA断裂的3’末端的技术^12,23。Gavrieli 等人et al.^1,12,24在20多年前首次报道了用于检测细胞凋亡和DNA损伤的TUNEL方法。此后，该方法已在不同组织样本制备中得到评估和优化^7,23,27,40。TUNEL已被用于研究缺血诱导的神经元^6,14,29和心肌细胞^43,44死亡、兴奋性毒性神经元死亡^30,31，以及作为关节炎治疗中的生物标志物³⁹。此外，TUNEL还被用作多种人类癌症中的预后因子和肿瘤细胞标志物^{2,3,15,32,37,38,42}。

检测DNA损伤和细胞死亡的替代方法虽然存在，但均存在技术挑战和局限性。Southern印迹法可用于定量整体组织裂解液中的DNA损伤^7,9-11，但该方法无法提供细胞水平的分辨率，且难以实现准确定量。彗星实验是一种基于细胞的替代方法，需从细胞中提取保存完好的细胞核^4,20,28,36。尽管彗星实验在培养的分离细胞中效果良好，但从骨骼肌组织中制备完整细胞核则困难得多^8,21。与Southern印迹法类似，彗星实验也无法从整体肌肉组织匀浆中提供特定细胞类型的信息。TUNEL法的另一种替代方案是使用针对单链DNA的抗体进行免疫组织化学检测^25,33,41，或使用针对参与DNA损伤应答和细胞死亡通路的蛋白（例如 p53、H2AX和caspases）的抗体^13,17,22,40。这类基于抗体的方法需要对抗体进行充分表征，并具备优异的抗体特异性，才能获得较高的信噪比。即使存在特异性抗体，也可能需要通过抗原修复程序对靶蛋白进行变性处理^34,35。正如本文所述，在肌肉组织中进行抗原修复会导致自发荧光过高，无法接受。与这些替代方法不同，TUNEL法能够实现高信号、低背景的DNA损伤检测，具有优异的特异性，可通过简单的阳性和阴性对照进行验证，组织穿透性良好，无需抗原修复，且具备细胞水平的分辨率。此外，TUNEL法完成实验约需4小时，而替代方法通常需要过夜孵育。

我们在脊髓性肌萎缩症（SMA）小鼠模型中研究骨骼肌细胞死亡¹⁰ 由 Hsieh-Li 及同事生成¹⁶为了定量肌肉中的凋亡细胞，我们建立了一种组织制备、染色和定量方法，该方法在不同发育时间点的小鼠不同骨骼肌群中均表现出良好的稳定性和适用性。我们采用市售的TUNEL标记试剂盒和市售图像分析软件。此外，我们还成功地将TUNEL检测与脊髓组织的免疫荧光染色相结合使用。¹⁰.

本文所述方法适用于希望评估骨骼肌组织病理学、疾病机制、衰老机制以及发育过程（产前和产后）中细胞死亡的研究人员。 机制 的、机制 的TUNEL技术特别适用于研究DNA损伤与修复以及细胞死亡，尤其在仅部分细胞受影响且需要细胞水平分辨率的模型系统中。

本视频介绍了小鼠骨骼肌的解剖、组织处理、切片以及基于荧光的TUNEL标记方法。同时介绍了一种半自动化的TUNEL信号定量分析方法。

方案

注意：本方案中所述的所有动物实验操作均按照相关指南中的建议进行 实验动物护理和使用的指南 美国国立卫生研究院²⁶该方案（MO13M391）已获约翰斯·霍普金斯大学动物护理与使用委员会批准。

1. 新生小鼠的处死、解剖与固定

1. 通过吸入 CO₂ 处死一只新生小鼠。
2. 立即在膝关节上方切断后肢。出生后约 7 天内，腿骨足够柔软，可使用大型实验剪刀或锋利刀片切断，并随后在冷冻切片机上进行切片。
3. 将后肢放入含有 10 ml 冰冷的 4% 多聚甲醛磷酸盐缓冲液（PBS）的 15 ml 管中。
4. 在 4 °C 条件下，将后肢浸入多聚甲醛中固定 4–24 小时。胚胎组织仅需数小时固定即可。
   1. 避免固定时间超过 24 小时，因为这可能会降低 TUNEL 检测效率。
5. 通过将后肢浸入蔗糖溶液中进行冷冻保护。
   1. 在同一个 15 ml 管中，将多聚甲醛更换为 PBS 配制的 10% 蔗糖溶液，4 °C 过夜孵育。
   2. 更换为 PBS 配制的 30% 蔗糖溶液，4 °C 过夜孵育，或直至后肢沉降至管底。若蔗糖溶液已通过无菌滤膜过滤，组织可在 30% 蔗糖溶液中保存更长时间。

2. 组织包埋

1. 将包埋模具用包埋剂填充至一半高度。
2. 将后肢置于包埋剂上方，切面尽可能靠近模具的一侧壁。在模具外壁标记后肢的方向。
   1. 可将多个后肢包埋在同一块包埋剂中并进行切片。但重要的是确保所有后肢在包埋块中彼此平行定向，以便沿肢体轴向获得相同水平的切片。
3. 用包埋剂覆盖后肢。若在倾倒包埋剂过程中后肢发生移位，可用钝头镊子或牙签重新调整其方向。
4. 在室温下让包埋剂充分渗透组织，至少 15 min。
5. 将模具直接置于干冰上，或置于盛有异戊烷的干冰中，以冻结包埋剂。务必始终保持模具水平，避免包埋组织发生位移。
6. 将冷冻的模具在 -80 °C 下保存，直至准备切片，可保存数月。

3. 包埋肢体的冷冻切片

1. 将冷冻切片机腔室温度设置为 -20 °C，样品温度设置为 -18 °C；根据需要适当降低样品温度。
2. 将组织块在冷冻切片机腔室内平衡至少 30 min。正确的组织块温度对切片质量至关重要。
3. 以 10 μm 或更薄的厚度切取横切面切片。较厚的切片将无法被TUNEL试剂完全渗透。使用冷冻切片机推荐的防卷板、刀片及刀片角度（通常为 5°）。
4. 将切片收集到室温下的明胶或Vectabond包被的载玻片上。立即放入置于干冰上的玻片盒中。将玻片盒放置在靠近冷冻切片机、便于操作的单独容器内，并用干冰保存。
   1. 沿肢体长轴切取连续横切面切片，间隔 100–200 μm。在每个连续切片水平收集至少 3 张相邻切片。

4. 使用商用试剂盒对后肢切片进行TUNEL检测（所有步骤均在室温下进行，除非另有说明）

1. 将载有组织切片的玻片于室温下解冻，并干燥过夜或整个周末。
2. 通过将玻片浸入 PBS 中 2 次，每次 10 分钟，进行切片复水（使用 Coplin 染色缸）。用实验室擦拭纸擦干，尽可能去除切片周围的液体。
3. 对切片进行通透处理
   1. 可选用非蛋白水解型皂苷类商用试剂，或使用含 0.5% Tween20 和 0.05% Triton X100 的 PBS 溶液。
   2. 将玻片放入湿化室中。简易湿化室可使用带紧密盖子的空移液器吸头盒，在盒底加入适量水以覆盖底部即可。
   3. 用移液器吸取足量试剂滴加至玻片上，以完全覆盖切片区域（50 μl 可满足新生小鼠肢体组织切片的需求）。避免直接将试剂滴在切片上，以免反复操作导致切片从玻片脱落。
   4. 使用钝头镊子将一小块长方形 Parafilm 膜覆盖在切片上，以使试剂均匀铺展并完全覆盖切片。若 Parafilm 膜下产生气泡，应轻轻揭起，擦干后重新放置。
   5. 将玻片置于加盖的湿化室中，与通透试剂共同孵育 1 小时。若发现切片开始从玻片脱落，可将通透时间缩短至 30 分钟。
   6. 在 Coplin 染色缸中用 PBS 洗涤玻片 2 次，每次 5 分钟。Parafilm 膜会浮至液面，可将其移除并丢弃。
   7. 用实验室擦拭纸尽可能吸干切片周围的液体。
4. TdT 介导的 DNA 断裂末端标记
   1. 按照试剂盒说明书配制 1x TdT 标记缓冲液，用移液器吸取足量缓冲液滴加至玻片上以覆盖组织切片（50 μl 可满足新生小鼠肢体组织切片的需求），在湿化室中孵育 5 分钟。也可将玻片浸入 Coplin 染色缸中的 TdT 标记缓冲液内进行处理。
   2. 根据试剂盒说明书配制 TdT 标记反应混合液。试剂盒中包含钴、镁和锰阳离子；其中锰阳离子在多种组织（包括骨骼肌、神经系统组织、肝脏、皮肤和骨组织）中均表现出良好效果。
   3. 作为阳性对照，可在 TdT 标记混合液中加入 DNase（试剂盒中标注为“nuclease”）。或者，根据试剂盒说明，用含 DNase 的核酸酶缓冲液在 37 °C 下预处理阳性对照切片 1 小时。应将 DNase 溶液及经 DNase 处理的切片与其他实验组切片分开存放，以防交叉污染。
   4. 作为阴性对照，应在标记混合液中省略 TdT 酶。
   5. 用实验室擦拭纸尽可能去除玻片上的 TdT 标记缓冲液，然后滴加 TdT 标记混合液（每张切片 50 μl），覆盖新的 Parafilm 膜，置于湿化室中 37 °C 孵育 1 小时。
   6. 根据试剂盒说明书配制 1x 终止缓冲液。用实验室擦拭纸去除玻片上的 TdT 标记混合液，加入 200–300 μl 终止缓冲液以覆盖组织切片，在湿化室中孵育 5 分钟。也可将玻片浸入 Coplin 染色缸中的终止缓冲液中进行处理。
   7. 在 Coplin 染色缸中用 PBS 洗涤玻片 2 次，每次 2 分钟。用实验室擦拭纸尽可能去除玻片上的 PBS。
5. 荧光标记
   1. 根据试剂盒说明书配制荧光素标记溶液，用于在 DNA 断裂位点标记 dNTP。将溶液滴加至玻片上（每张切片 50 μl），覆盖新的 Parafilm 膜，在湿化室中孵育 20 分钟。
   2. 在 Coplin 染色缸中用 PBS 洗涤玻片 2 分钟。用实验室擦拭纸尽可能去除玻片上的 PBS。
   3. 将 Hoechst 33258 核染料用 PBS 稀释至 1 μg/ml，滴加至玻片上（100–200 μl 即可完全覆盖切片），在湿化室中孵育 5 分钟。
   4. 在 PBS 中洗涤 3 次，每次 5 分钟。
   5. 使用抗荧光淬灭封片剂加盖盖玻片，并用指甲油密封边缘。

5. 数字图像采集

1. 使用配备 DAPI、FITC 和 Texas Red 滤光片（或等效滤光片）的传统荧光显微镜采集图像。采用较高倍率的物镜（20X 或 40X）确认标记是否成功，并观察细胞核（完整或碎片化）是否被标记。定量分析 TUNEL 阳性点状信号时，10X 物镜已足够。
2. 分别采集 Hoechst 染色、TUNEL 染色和自发荧光信号的图像，作为三个独立的伪彩通道，并合并为一幅图像。若 TUNEL 荧光标记为绿色，则在红色滤光通道中成像自发荧光信号，反之亦然。
   1. 保持各玻片之间的成像参数一致，以便后续进行阈值设定和定量分析。对每个滤光通道，预设并记录曝光时间、增益和 binning 参数（建议不使用 binning）；请勿使用自动曝光或自动增益设置。
   2. 通过反复试验确定最佳的曝光时间和增益设置，以充分捕捉所有染色玻片中荧光强度的动态范围。确保所采集图像中无饱和像素，否则将影响定量结果的准确性。
3. 采集目标肌群的完整图像。这可能需要获取多张图像并通过“拼接”方式组合成完整视图。

6. 图像分析

1. 使用市售的图像分析程序分析TUNEL染色的数字图像。本文展示了使用商业软件的分析方法。此外，也可使用美国国立卫生研究院（NIH）提供的免费软件ImageJ进行TUNEL染色分析。
2. 对与TUNEL染色切片相邻的组织切片进行苏木精和伊红（H&E）染色，并使用常规明场显微镜拍摄整张切片的数字图像。将此H&E图像结合解剖学图谱^5,18,19，用于勾画需定量的解剖结构。
3. 关闭TUNEL通道，借助Hoechst染色和自发荧光通道的信号，手动勾画待定量区域的轮廓。将所勾画区域转换为掩膜（即一组待分析的像素坐标集合）。
4. 打开TUNEL通道。在图像分析程序中使用强度阈值功能，设定下限阈值以排除所有自发荧光信号。
5. 将相同的阈值设置应用于研究中所有图像，并将阈值筛选结果转换为掩膜。
6. 对每张图像，合并肌肉区域掩膜与TUNEL掩膜。新生成的组合掩膜将仅表示限定肌肉区域内存在的TUNEL信号。
7. 对组合掩膜进行定量分析，以确定限定肌肉区域内TUNEL信号的物体数量及物体面积。可使用ImageJ中的“粒子分析器”（Particle Analyzer）功能完成此步骤。

结果

染色成功时，TUNEL阳性信号应足够明亮，可通过设定强度阈值将其与自发荧光区分开来。在低倍镜下，骨骼肌中的TUNEL阳性信号可能呈现为明亮而不规则的碎片（图1A）。然而，若涉及的细胞死亡类型为凋亡，则在高倍镜下应观察到部分具有典型凋亡形态的TUNEL阳性结构（图1B）。阳性对照（添加DNase）应显示丰富的TUNEL阳性信号，且在切片的所有组织中均匀分布（图1C）。阴性对照（反应中省略TdT酶）应仅显示低强度背景信号和自发荧光信号（图1D）。在整条腿的切片中，皮肤可作为内部阳性对照，因为该组织具有较高的正常凋亡率（图1A）。

红细胞、骨组织和内皮细胞可能会产生显著的自发荧光信号（图2）。建议在未进行荧光标记的情况下，分别在独立通道中对每个切片成像，以确保不会将自发荧光误判为TUNEL阳性信号。真正的TUNEL阳性信号强度应远高于自发荧光，因此可通过设定图像强度阈值将其分离（

讨论

本文介绍了一种检测和定量分析小鼠骨骼肌中与DNA损伤相关的细胞凋亡的方法。该操作流程包括组织采集、TUNEL染色、数字图像获取以及图像分析。实验需要常规组织学耗材和工具，并需使用特定的商用TUNEL试剂盒。所需的主要大型设备包括冷冻切片机、配备数字成像功能的落射荧光显微镜，以及用于图像分析的计算机系统。

实验人员应注意潜在的陷阱。组织自发荧光是荧光成像中的一个主要问题。在未灌注的动物中，残留的红细胞会产生较强的自发荧光信号。内皮细胞也可能具有显著的自发荧光。因此，必须确认未将自发荧光误判为TUNEL阳性信号。这一评估可通过在无荧光染料的通道中采集图像来实现，用于与TUNEL阳性通道进行比较，必要时进行背景扣除。通过这种方式，基于荧光的TUNEL方法优于基于比色法的明场显微技术，后者无法提供背景染色的内部对照。

组织固定对TUNEL标记的成功具有显著影响。最好将多聚甲醛固定时间缩短至最低限度，不超过24 hr。胚胎和新生组织所需的固定时间应明显短于24 hr。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
磷酸盐缓冲液中的4%多聚甲醛	Electron Microscopy Sciences	19202	本实验所述步骤中，4%溶液由粉末新鲜配制。可使用任意供应商提供的多聚甲醛。配制好的甲醛溶液应保存在4 °C，且不可在过期后使用（有效期最长数月）。多聚甲醛为致癌物，经吸入或皮肤接触具有毒性。操作多聚甲醛时，请遵循材料安全数据表（MSDS）中规定的防护措施。
蔗糖	Sigma	S0389	用于组织冷冻前的冷冻保护。可使用任意供应商提供的蔗糖。
O.C.T. 包埋剂	Tissue-Tek	4583	冷冻切片的包埋介质。
冷冻切片机	Leica	CM 3050S	本实验所用为Leica CM3050S冷冻切片机。任何能够切割10 μm切片的冷冻切片机均可使用。
载玻片，25 × 75 × 1 mm	Fisher	12-552-3	可使用任意供应商提供的载玻片。
明胶	Sigma	G-9391	明胶用于促进组织切片在载玻片上的附着。明胶包被载玻片的制备方法：将2.75 g明胶和0.275 g铬矾溶于500 ml蒸馏水中，加热至60 °C，将载玻片浸入数秒后取出晾干。可使用任意供应商提供的明胶。也可直接购买预包被明胶的载玻片。
十二水合硫酸铬钾（铬矾）	Sigma	243361	铬矾添加至明胶溶液中以增强组织在载玻片上的附着能力。其为可能的致癌物，经吸入或皮肤接触具有毒性。操作铬矾时，请遵循材料安全数据表（MSDS）中规定的防护措施。
Vectabond组织粘附试剂	Vector Labs	SP-1800	可选底物，用于增强组织在载玻片上的附着；也可使用明胶包被的载玻片替代。
Tween20	Sigma	P9416	用于组织通透的去垢剂。可使用任意供应商提供的Tween20。
Triton X100	Sigma	T8787	用于组织通透的去垢剂。可使用任意供应商提供的Triton X100。
TACS 2 TdT 荧光 原位 凋亡检测试剂盒	Trevigen	4812-30-K	基于荧光的TUNEL标记商用试剂盒。
DNase/核酸酶	Trevigen	4812-30-K	（随试剂盒提供）
DNase/核酸酶缓冲液	Trevigen	4812-30-K	（随试剂盒提供）
10×磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.4	Amresco	780	配制1× PBS用于洗涤和稀释。可使用任意供应商提供的PBS。
无DNase水	Quality Biologicals	351-029-131	可使用任意供应商提供的水。
Hoechst 33258	Sigma	94403	细胞核染料。可使用任意蓝色荧光细胞核染料。Hoechst为DNA结合染料，疑似致癌物，操作时应佩戴防护装备以减少皮肤接触。
Parafilm M封口膜	multiple	807	可使用其他疏水性膜或盖玻片。可从多个供应商处获得。
配备数字相机的荧光显微镜	--	--	任何能够分别在红、绿、蓝通道中数字采集荧光信号的荧光显微镜均可使用。
Vectashield抗荧光淬灭封片剂	Vector Labs	H-1000	可使用任意供应商提供的抗荧光淬灭封片剂。
盖玻片，1号厚度	Brain Research Labs	2222-1	可使用任意供应商提供的盖玻片。22 × 22 mm的最小尺寸足以覆盖新生小鼠腿部切片。
指甲油	Ted Pella	114-8	用于密封盖玻片。可使用任意供应商（包括普通零售商）提供的指甲油。避免使用带有颜色或添加剂的指甲油，以免在荧光成像过程中产生光反射。