脂肪移植是修复软组织缺损的重要技术。然而，该手术的效果仍不稳定，移植存活率存在较大差异。我们的目标是建立一种小鼠模型，利用一种新型成像方法，比较不同脂肪移植制备与输送技术之间的体积保留情况。
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方法文章
利用微型计算机断层扫描评估人脂肪注射物在裸鼠体内的存活能力
* These authors contributed equally
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摘要
摘要
自体脂肪移植是外科医生用于治疗全身软组织缺损的重要技术手段。脂肪是理想的软组织填充材料，因其来源丰富、易于获取、成本低廉且具有天然的生物相容性1。然而，尽管该技术日益普及，脂肪移植仍受限于结果不可预测及移植物存活率不稳定的问题，文献报道的脂肪保留率差异较大，范围在10%至80%之间1-3。
为了促进对脂肪移植的研究，我们因此开发了一种动物模型，可实现对注射脂肪体积存留的实时分析。简言之，在CD-1裸鼠的头皮上做一个小切口，将200–400 µl 经处理的脂肪抽吸物置于颅骨上方。选择头皮作为受区，是因为该部位缺乏天然的皮下脂肪，同时颅骨可提供良好的背景对比度，有助于分析过程。采用微型计算机断层扫描（micro-CT）在基线时及之后每两周对移植物进行扫描。对CT图像进行重建，并使用影像软件定量测定移植物体积。
传统上，评估脂肪移植体积的技术需要处死实验动物，以便通过体外物理测量仅获得一次移植物重量和体积的评估结果。ex vivo 的生化和组织学比较同样需要处死实验动物。本所述成像技术的优势在于，可在初次移植后的多个时间点对移植物体积进行可视化和客观定量，而无需牺牲实验动物。该技术的局限性在于可注射移植物的尺寸，因为较大的移植物存在皮肤和脂肪坏死的风险。该方法适用于所有评估脂肪移植物存活率和体积保留的研究，尤其适用于提供脂肪移植物的可视化表征，并追踪其体积随时间的变化。
引言
软组织缺损可由多种原因引起，包括创伤、肿瘤切除、衰老以及先天性畸形。这类缺损可能严重影响患者生活质量，是整形外科医生面临最常见但最具挑战性的问题之一。目前已有多种方法用于修复软组织缺损，例如局部皮瓣和游离皮瓣、胶原蛋白注射以及合成填充物4-8。然而，自1893年Neuber首次记录使用自体脂肪移植以来1，该技术仍是修复软组织缺损的金标准，因其来源充足、获取简便安全，且具有天然的生物相容性1,2。
尽管具有这些优势，自体脂肪移植的存活率仍存在不可预测且差异较大的问题，随着时间推移，移植脂肪的保留率在10%至80%之间不等。1-3,9 为了弥补这种预期的体积丢失和对称性丧失，外科医生在填充软组织缺损时往往需要过度矫正，或需进行多次后续手术。
血管化不良的移植床是导致这种组织吸收的部分原因。此外，缺乏用于比较移植存活率的基准分析方法，也可能导致所报告结果的不一致。一种精确测量移植物体积的方法可在评估保留率时减少测量误差，进而帮助研究人员更准确地识别影响移植物存活的致病因素。尽管许多实验室动物模型已促进了对人脂肪移植物存活率的定量和定性评估，但大多数方法基于组织学和生物化学手段，且需要牺牲实验动物才能获得单次测量结果。3,10-12 关于利用影像学技术在活体（in vivo）中量化脂肪移植物体积保留率的....
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方案
注意：获取脂肪组织的实验方案和患者知情同意书已通过斯坦福大学机构审查委员会（IRB）的审查和批准（方案编号 #2188）。所有动物实验均经斯坦福大学实验室动物护理与使用管理小组（APLAC）批准，批准编号为 #9999。所有实验均严格遵循动物安全与人道护理指南进行。
1. 脂肪采集
- 采用 Coleman 方法17-19，从接受择期吸脂术的健康女性患者的腹部、侧腰部和/或大腿部位获取人体脂肪组织。
- 为处理吸脂物用于移植，首先让脂肪静置 30 分钟。
- 吸脂物通常会分为三层：顶部为油层，中间为脂肪层，底部为血液层。吸除并弃去顶部的油层和底部的血液层。
- 为进一步去除残留的肿胀液或细胞碎片，将脂肪在 4 °C 条件下以 350 × g 离心 5 分钟，并吸除底部的水相层。
- 计算移植所需脂肪量，预留 20% 的输送误差，并将所需体积的脂肪转移至 50 ml 锥形管中。将小鼠数量乘以 400，得到移植所需的脂肪微升数（µL）。
- 此时，若进行细胞辅助脂肪移植20,21，需将用于移植的脂肪置于冰上。随后按照 Zuk et al22 描述的标准技术，从剩余脂肪中分离获取脂肪来源的基质细胞（ASCs）。
2. ....
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结果
在研究过程中，脂肪移植物的体积逐渐减小，至第8周时平均存活率为62.2%。（图4A）24在第8周扫描结束后，每块脂肪移植物均被完整取出。采用Wilcoxan秩和检验比较通过显微CT测量或根据物理质量计算所得脂肪移植物体积之间的差异，两种方法之间无显著差异（双侧p值 = 0.9362）。（图4B）
每次扫描剂量为5厘戈瑞，共进行五次扫描，每只小鼠在整个研究过程中接受的总剂量不超过25厘戈瑞。与此一致的是，所有小鼠均未表现出明显的皮肤放射性灼伤迹象。
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讨论
迄今为止，大多数研究人员依赖非成像方法来量化脂肪移植物的长期存活情况，但这些方法需要牺牲实验动物，且只能获得单次测量结果。3,10-12 本研究展示了一种改进的分析方法，可在小鼠模型中实现对脂肪移植物存活的客观、实时定量评估。
在此过程中，关键是要使用免疫功能足够低下的小鼠，以防止具有完整免疫系统的小鼠发生移植物排斥反应。在脂肪获取、处理和移植过程中，维持脂肪的完整性至关重要。根据传统公认的标准，用于移植的脂肪应通过负压辅助吸脂术（SAL）获取。在移植过程中，脂肪应以不超过0.5 ml/sec的稳定流速注射。在小鼠移植中推荐使用14号套管，但使用更大直径的套管也不会对脂肪造成损伤。在移植过程中应避免使用较小的套管和针头——尤其是直径小于16号的器械，因为它们可能因剪切应力增加而导致脂肪破坏。尽管上文描述了我们偏好的处理方法，但在移植前只要能充分将油脂层和血液层与脂肪分离，也可采用静置沉降、离心和/或过滤的任意组合方式。
脂肪移植物的体积应至少为 200 µl，以尽量减少因脂肪移植本身的不均一性所导致的结果.......
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披露
所有作者均无任何需披露的 competing financial interest。
致谢
本研究由Oak Foundation、Hagey儿科再生医学实验室和美国国立卫生研究院（NIH）资助，项目编号为NIHR21DE019274、NIHR01DE019434、NIHR01DE021683和NIHU01HL099776，受资助者为M.T.L。D.C.W.获得美国癌症学会（ACS）Franklin H. Martin教员研究奖学金、Hagey儿科再生医学实验室以及斯坦福大学儿童健康研究所教员学者奖的支持。微型计算机断层扫描（Micro-CT）在斯坦福大学创新中心完成 在 活体 成像。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| SAL 脂肪抽吸物 | |||
| 离心机 | Beckman Coulter, Inc., Pasadena, CA | ||
| 50 ml 锥形管 | BD Biosciences, San Jose, CA | ||
| CD-1 裸鼠 (Crl:CD1-Foxn1nu) | Charles River Laboratories, Inc., Wilmington, MA | ||
| 异氟烷 | Henry Schein, Dublin, OH | ||
| 2.5% 碘伏 | Purdue Pharma, L.P., Stamford, CT | ||
| 70% 乙醇溶液 | Gold Shield, Hayward, CA | ||
| 1 cc 锁扣式注射器 | BD Biosciences, San Jose, CA | ||
| 14 号套管针 | Shippert Medical, Centennial, CO | ||
| 镊子 | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | ||
| 肌腱切断剪 | Fine Science Tools, Heidelberg, Germany | ||
| 6-0 尼龙缝线 | Ethicon, Blue Ash, OH | ||
| 磷酸盐缓冲液 | Gibco, Carlsbad, CA | ||
| 微型 CT 扫描仪 | Siemens Healthcare, Pleasanton, CA | ||
| 模体 | TriFoil Imaging, Northridge, CA | ||
| 影像分析软件 | IRW, Siemens Healthcare, Pleasanton, CA | ||
| 天平 | Mettler-Toledo International, Inc., Columbus, OH |
参考文献
- Gir, P., et al. Fat grafting: evidence-based review on autologous fat harvesting, processing, reinjection, and storage. Plast Reconstr Surg. 130 (1), 249-258 (2012).
- Kaufman, M. R., et al.
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重印与许可
