利用微型计算机断层扫描评估人脂肪注射物在裸鼠体内的存活能力

摘要

脂肪移植是修复软组织缺损的重要技术。然而，该手术的效果仍不稳定，移植存活率存在较大差异。我们的目标是建立一种小鼠模型，利用一种新型成像方法，比较不同脂肪移植制备与输送技术之间的体积保留情况。

摘要

自体脂肪移植是外科医生用于治疗全身软组织缺损的重要技术手段。脂肪是理想的软组织填充材料，因其来源丰富、易于获取、成本低廉且具有天然的生物相容性¹。然而，尽管该技术日益普及，脂肪移植仍受限于结果不可预测及移植物存活率不稳定的问题，文献报道的脂肪保留率差异较大，范围在10%至80%之间^1-3。

为了促进对脂肪移植的研究，我们因此开发了一种动物模型，可实现对注射脂肪体积存留的实时分析。简言之，在CD-1裸鼠的头皮上做一个小切口，将200–400 µl 经处理的脂肪抽吸物置于颅骨上方。选择头皮作为受区，是因为该部位缺乏天然的皮下脂肪，同时颅骨可提供良好的背景对比度，有助于分析过程。采用微型计算机断层扫描（micro-CT）在基线时及之后每两周对移植物进行扫描。对CT图像进行重建，并使用影像软件定量测定移植物体积。

传统上，评估脂肪移植体积的技术需要处死实验动物，以便通过体外物理测量仅获得一次移植物重量和体积的评估结果。ex vivo 的生化和组织学比较同样需要处死实验动物。本所述成像技术的优势在于，可在初次移植后的多个时间点对移植物体积进行可视化和客观定量，而无需牺牲实验动物。该技术的局限性在于可注射移植物的尺寸，因为较大的移植物存在皮肤和脂肪坏死的风险。该方法适用于所有评估脂肪移植物存活率和体积保留的研究，尤其适用于提供脂肪移植物的可视化表征，并追踪其体积随时间的变化。

引言

软组织缺损可由多种原因引起，包括创伤、肿瘤切除、衰老以及先天性畸形。这类缺损可能严重影响患者生活质量，是整形外科医生面临最常见但最具挑战性的问题之一。目前已有多种方法用于修复软组织缺损，例如局部皮瓣和游离皮瓣、胶原蛋白注射以及合成填充物^4-8。然而，自1893年Neuber首次记录使用自体脂肪移植以来¹，该技术仍是修复软组织缺损的金标准，因其来源充足、获取简便安全，且具有天然的生物相容性^1,2。

尽管具有这些优势，自体脂肪移植的存活率仍存在不可预测且差异较大的问题，随着时间推移，移植脂肪的保留率在10%至80%之间不等。^1-3,9 为了弥补这种预期的体积丢失和对称性丧失，外科医生在填充软组织缺损时往往需要过度矫正，或需进行多次后续手术。

血管化不良的移植床是导致这种组织吸收的部分原因。此外，缺乏用于比较移植存活率的基准分析方法，也可能导致所报告结果的不一致。一种精确测量移植物体积的方法可在评估保留率时减少测量误差，进而帮助研究人员更准确地识别影响移植物存活的致病因素。尽管许多实验室动物模型已促进了对人脂肪移植物存活率的定量和定性评估，但大多数方法基于组织学和生物化学手段，且需要牺牲实验动物才能获得单次测量结果。^3,10-12 关于利用影像学技术在活体（in vivo）中量化脂肪移植物体积保留率的研究报道较少。

一些临床研究已表明，利用影像学技术进行测量更为有效。Hörl 采用了磁共振成像（MRI） 等 测量脂肪移植物存活率¹³，Har-Shai 采用了 CT 等 和 Fontdevila 等 在对患有艾滋病病毒（HIV）感染患者的移植后体积保留情况进行分析时。^14,15 使用三维（3D）成像软件，Meier 等 通过比较自体脂肪移植术前和术后的影像，测量人体内脂肪移植后的体积保留率。¹⁶

然而，在基础科学研究中，尚缺乏一种利用影像学来测量脂肪移植存活率的标准化方法。采用高分辨率成像技术评估脂肪移植物的体积，不仅能够实现准确且可重复的体积测量，还可进行多次重复测量，从而实时可视化地观察脂肪移植物存活过程的动态变化。

方案

注意：获取脂肪组织的实验方案和患者知情同意书已通过斯坦福大学机构审查委员会（IRB）的审查和批准（方案编号 #2188）。所有动物实验均经斯坦福大学实验室动物护理与使用管理小组（APLAC）批准，批准编号为 #9999。所有实验均严格遵循动物安全与人道护理指南进行。

1. 脂肪采集

1. 采用 Coleman 方法^17-19，从接受择期吸脂术的健康女性患者的腹部、侧腰部和/或大腿部位获取人体脂肪组织。
2. 为处理吸脂物用于移植，首先让脂肪静置 30 分钟。
3. 吸脂物通常会分为三层：顶部为油层，中间为脂肪层，底部为血液层。吸除并弃去顶部的油层和底部的血液层。
4. 为进一步去除残留的肿胀液或细胞碎片，将脂肪在 4 °C 条件下以 350 × g 离心 5 分钟，并吸除底部的水相层。
5. 计算移植所需脂肪量，预留 20% 的输送误差，并将所需体积的脂肪转移至 50 ml 锥形管中。将小鼠数量乘以 400，得到移植所需的脂肪微升数（µL）。
6. 此时，若进行细胞辅助脂肪移植^20,21，需将用于移植的脂肪置于冰上。随后按照 Zuk et al²² 描述的标准技术，从剩余脂肪中分离获取脂肪来源的基质细胞（ASCs）。

2. 脂肪移植

1. 获取 用于实验研究的雌性纯合CD-1裸鼠，选择8至12周龄的小鼠。
2. 为诱导麻醉，将小鼠放入击倒箱中，以2 L/min流速通入2.5%异氟烷/氧气混合气体，持续约10分钟。请注意，推荐的异氟烷剂量因小鼠品系而异。
3. 当小鼠呼吸频率减慢后，通过脚趾夹捏测试确认镇静充分。向小鼠双眼涂抹兽用润滑性眼膏。
4. 若小鼠对脚趾夹捏无反应，则表明麻醉深度足够。将小鼠鼻部置于鼻罩中，持续给予1–2 L/min流速的2.5%异氟烷/氧气混合气体。若小鼠对脚趾夹捏产生回缩反应，应返回击倒箱，并在5分钟后重新测试。
5. 在小鼠下方建立无菌区域，随后用2.5%聚维酮碘溶液擦拭头皮，再用70%乙醇溶液处理，重复此过程两次。 
6. 在小鼠身上覆盖手术巾，注意维持无菌区域。 始终使用无菌器械、手套及个人防护装备。
7. 若待移植的脂肪组织此前保存在冰上，应在注射前使其先恢复至室温。
8. 用1 ml鲁尔锁注射器回装1 ml脂肪组织。
9. 将一根14 G、8 cm长的脂肪移植套管针连接至注射器末端。
10. 推动注射器活塞，排出空气并预充系统，直至注射器内剩余200–400 µl脂肪。推动活塞过程中，通过观察远端套管孔有脂肪溢出，确认套管已完全充满脂肪。
11. 使用精细镊子，在颅骨尾侧最末端中线处提起背部皮肤。使用精细剪刀在皮肤上做1.5 mm切口。
12. 在切口中央穿过一根6-0尼龙缝线，用于后续移植完成后对合伤口边缘。暂不打结。
13. 将套管针经皮肤切口插入，在颅骨表面以扇形方式前后移动，从而在皮下创建一个腔隙，分离皮肤与下方结缔组织的连接。
14. 腔隙形成后，将套管针置于小鼠中线颅骨正上方，使针尖位于腔隙最前端，即两眼连线稍后方位置。（图1A）
15. 以逆行方式缓慢注射脂肪，在拉动套管针的同时推进活塞。使用镊子将伤口边缘对合并提起，防止脂肪从腔隙中漏出。
16. 打结固定先前放置的缝线，确保第一个结轻贴皮肤表面。再打三个方结，留3 mm线尾后剪断。（图1B）
17. 通过肉眼观察和手动触诊确认腔隙未过度填充，且覆盖腔隙的皮肤无张力。若腔隙填充过多，应剪断缝线，清除腔隙内全部脂肪，用pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水（PBS）冲洗腔隙，然后注入较小体积的脂肪。
18. 将小鼠从麻醉状态中移出，单独放置于清洁笼内，仰卧或侧卧。监测动物是否出现规律呼吸、正常活动、无出血以及疼痛或痛苦的迹象。若动物疼痛，皮下注射0.1 mg/kg布托啡诺，每6小时一次，最多持续48小时。
19. 在无人看管前，确保动物已充分苏醒，能够维持胸骨卧姿。在完全恢复前，不得将动物放入与其他动物共用的笼中。
20. 4小时后，确认动物能够正常进食饮水、活动及呼吸，且手术部位无出血，随后将其送回动物饲养设施。

3. 微型计算机断层扫描（Micro-CT）

1. 术后第3天对小鼠进行基线体积扫描，之后在术后第2、4、6和8周重复扫描。
2. 在每个时间点对小鼠进行成像时，遵循此前步骤2.2–2.4和2.17–2.19中所述的术前和术后镇静及动物护理指南。
3. 使用重建体素尺寸为100 µm或更优的微型CT扫描仪进行扫描。
4. 在9分钟的扫描过程中，以80 kVp的X射线峰值电压和450 µA的阳极电流，向每只小鼠给予约5厘戈瑞（centiGy）的辐射剂量。请注意，这些数值会因扫描方案的不同而有所变化。
5. 在进行首次扫描前，使用可区分空气、水和骨强度的成像模体对微型CT进行校准。
6. 将四只小鼠以腹侧朝上的位置放入扫描仪中，上下各放置两只。可使用60 ml注射器固定小鼠身体，10 ml注射器作为鼻锥，简便地构建扫描床。²³
7. 以每分钟1–2升的2.5%异氟烷/氧气混合气体维持小鼠麻醉状态。
8. 通过定位像确认，小鼠整个颅骨——从鼻部至第一颈椎，以及从颅顶至颅底——均将被完整成像。

4. 微计算机断层扫描分析

1. 使用允许通过设定像素强度阈值来选择体素以创建感兴趣区域（ROI）的微计算机断层扫描（micro-CT）图像分析软件打开重建后的图像。该软件还支持通过对选定体素进行插值生成三维表面，并进行体积分析。
2. 首先以二维（2D）冠状面、轴向面和矢状面视图加载重建的CT图像。（图2A）
3. 以轴向切片为参考，导航至对应于脂肪移植物最左侧部分的矢状切片。设定像素强度的上限和下限阈值，以包含所有对应于脂肪移植物的体素，同时排除周围组织和骨骼。（图2B）
4. 在矢状面视图中，使用先前定义的像素强度阈值划定对应于脂肪移植物的感兴趣区域（ROI）。每隔五个矢状切片重复此操作，直至到达移植物最右侧部分。（图2C）
5. 将所有二维ROI中选定的体素插值合并为一个统一的三维ROI。（图2D）
6. 记录软件计算出的ROI体积。
7. 渲染三维等值面以可视化最终的脂肪移植物体积。（图2E）
8. 在后续分析中，务必保持像素强度的最大值和最小值阈值与基线分析所用值一致。

5. 脂肪采集

1. 在小鼠完成第8周^24,25时间点的扫描后，按照上述步骤2.2–2.4和2.17–2.19中所述方法对小鼠进行麻醉。
2. 根据APLAC指南，通过分离小鼠脊柱的方式实施安乐死。
3. 将小鼠置于手术区域，使用肌腱剪小心打开皮下囊腔，并剥离覆盖在脂肪移植物上的皮肤及结缔组织附着物。
4. 此时，可切除部分覆盖的背部皮肤，以利于移植物的取出。（图3A）
5. 用镊子轻轻牵拉移植物，并左右旋转，以便观察需用剪刀松解的连续张力点。
6. 切除过程中应尽量贴近移植物操作，以最小化随移植物带出的结缔组织量。（图3B）
7. 取出移植物后，使用已去皮重且精度不低于0.01克的天平测量其质量。
8. 利用测得的质量值和人体脂肪的平均密度（0.9 g/mL）作为换算系数，计算脂肪移植物的体积。
9. 将计算所得的脂肪移植物体积与微计算机断层扫描（micro-CT）获得的结果进行比较。
10. 如需进一步分析，可将脂肪移植物进行组织学处理或其他后续分析。

结果

在研究过程中，脂肪移植物的体积逐渐减小，至第8周时平均存活率为62.2%。（图4A）²⁴在第8周扫描结束后，每块脂肪移植物均被完整取出。采用Wilcoxan秩和检验比较通过显微CT测量或根据物理质量计算所得脂肪移植物体积之间的差异，两种方法之间无显著差异（双侧p值 = 0.9362）。（图4B）

每次扫描剂量为5厘戈瑞，共进行五次扫描，每只小鼠在整个研究过程中接受的总剂量不超过25厘戈瑞。与此一致的是，所有小鼠均未表现出明显的皮肤放射性灼伤迹象。

讨论

迄今为止，大多数研究人员依赖非成像方法来量化脂肪移植物的长期存活情况，但这些方法需要牺牲实验动物，且只能获得单次测量结果。^3,10-12 本研究展示了一种改进的分析方法，可在小鼠模型中实现对脂肪移植物存活的客观、实时定量评估。

在此过程中，关键是要使用免疫功能足够低下的小鼠，以防止具有完整免疫系统的小鼠发生移植物排斥反应。在脂肪获取、处理和移植过程中，维持脂肪的完整性至关重要。根据传统公认的标准，用于移植的脂肪应通过负压辅助吸脂术（SAL）获取。在移植过程中，脂肪应以不超过0.5 ml/sec的稳定流速注射。在小鼠移植中推荐使用14号套管，但使用更大直径的套管也不会对脂肪造成损伤。在移植过程中应避免使用较小的套管和针头——尤其是直径小于16号的器械，因为它们可能因剪切应力增加而导致脂肪破坏。尽管上文描述了我们偏好的处理方法，但在移植前只要能充分将油脂层和血液层与脂肪分离，也可采用静置沉降、离心和/或过滤的任意组合方式。

脂肪移植物的体积应至少为 200 µl，以尽量减少因脂肪移植本身的不均一性所导致的结果...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
SAL 脂肪抽吸物
离心机	Beckman Coulter, Inc., Pasadena, CA
50 ml 锥形管	BD Biosciences, San Jose, CA
CD-1 裸鼠 (Crl:CD1-Foxn1nu)	Charles River Laboratories, Inc., Wilmington, MA
异氟烷	Henry Schein, Dublin, OH
2.5% 碘伏	Purdue Pharma, L.P., Stamford, CT
70% 乙醇溶液	Gold Shield, Hayward, CA
1 cc 锁扣式注射器	BD Biosciences, San Jose, CA
14 号套管针	Shippert Medical, Centennial, CO
镊子	Fine Science Tools, Heidelberg, Germany
肌腱切断剪	Fine Science Tools, Heidelberg, Germany
6-0 尼龙缝线	Ethicon, Blue Ash, OH
磷酸盐缓冲液	Gibco, Carlsbad, CA
微型 CT 扫描仪	Siemens Healthcare, Pleasanton, CA
模体	TriFoil Imaging, Northridge, CA
影像分析软件	IRW, Siemens Healthcare, Pleasanton, CA
天平	Mettler-Toledo International, Inc., Columbus, OH