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活体成像观察小鼠背柱 crush 损伤后轴突与小胶质细胞及巨噬细胞的相互作用

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DOI：

10.3791/52228

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2014年11月23日

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1Department of Neurosciences, Case Western Reserve University, 2Department of Biomedical Engineering, Case Western Reserve University, 3Department of Pediatrics, Case Western Reserve University

本文内容

摘要

双光子活体成像可用于研究骨髓嵌合动物在脊髓背柱受到创伤性脊髓 crush 损伤后，脊髓内不同细胞类型在其原生组织环境中的相互作用。

摘要

创伤性脊髓损伤会引发炎症反应，涉及来自血液的巨噬细胞和中枢神经系统（CNS）常驻的小胶质细胞。活体双光子显微镜技术使得能够在活体动物中研究脊髓损伤部位的巨噬细胞和小胶质细胞。该方法可在成年动物中实施，通过对其背柱造成创伤性损伤来进行观察。本文描述了利用辐射骨髓嵌合体模型来区分中枢神经系统中巨噬细胞与小胶质细胞的方法，获得仅由巨噬细胞或小胶质细胞表达遗传编码绿色荧光蛋白的实验动物。我们还介绍了一种损伤模型，通过挤压脊髓背柱产生一个简单、易于接近且呈矩形的病灶，该病灶可通过椎板切除术在动物体内清晰可视化。此外，我们将概述在损伤后最初数天至数周内，对动物损伤解剖部位进行连续成像的操作流程，以研究细胞间相互作用。

引言

中枢神经系统（CNS）对疾病或损伤的炎症反应尚不明确，尤其是组织内免疫细胞与常驻细胞之间的相互作用更为复杂。在活体动物中研究脊髓内的这些细胞相互作用尤为引人关注。脊髓背柱是唯一易于接近的中枢神经系统白质通路，因此成为改进可行实验方法的重点区域。由于在技术上难以接近并稳定中枢神经系统以进行成像，相关研究一直受到限制。既往已有对脊髓活体成像的描述1-13，但极少有研究探讨脊髓损伤后数小时以上的细胞迁移行为。创伤性脊髓病变是一种复杂的微环境，包含神经元、星形胶质细胞、成纤维细胞、NG2前体细胞，以及包括小胶质细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、T细胞、B细胞和树突状细胞在内的多种免疫细胞14,15。巨噬细胞是负责病灶内吞噬作用的一类免疫细胞，由血液循环中浸润而来。关于这些吞噬细胞的作用一直存在争议，有研究报道它们在受损组织中既可能发挥有害作用，也可能具有保护作用。其作用范围包括在损伤后加剧继发性轴突退缩并发挥吞噬功能16-22，以及呈现促进伤口愈合的表型，从而减轻损伤动物的功能缺陷21,23,24。

过去，区分巨噬细胞与小胶质细胞主要依赖于健康组织中的形态学特征。然而，活化的小胶质细胞和巨噬细胞在损伤后表达许多相同的标志物，且形态学上难以区分25-29，因此仅基于这些因素很难研究这两类细胞的不同功能30。可通过流式细胞术利用CD45的差异表达来分离这些细胞33,34，但该方法在体内鉴别这两种细胞类型时作用有限。研究人员也探索了利用小胶质细胞与巨噬细胞中CCR2和CX3CR1的差异表达进行区分，但随着单核细胞分化为巨噬细胞，这些标志物的表达会发生动态变化，从而增加了准确分析的复杂性35,36。小胶质细胞是中枢神经系统（CNS）内的常驻免疫细胞，起源于胚胎发育时期的卵黄囊前体细胞，而巨噬细胞则来源于骨髓前体细胞，在受到损伤后进入受损的中枢神经系统31,32。一种替代基于形态学区分这两类细胞的方法是：将宿主的骨髓替换为表达可追踪标志物的供体动物的前体细胞，从而使来源于供体前体细胞的巨噬细胞可被标记，同时保留中枢神经系统内原有的、来源于受体的小胶质细胞。这种骨髓嵌合模型已在许多其他研究中广泛应用37-40。然而，该方法存在特定局限性，即用于清除宿主骨髓前体细胞的照射或细胞毒性药物会破坏血脑屏障的完整性，从而限制了其在某些研究中的应用。近年来，研究人员开始通过流式细胞术、基因芯片阵列分析以及嵌合体方法来揭示中枢神经系统中小胶质细胞与巨噬细胞之间的功能差异24,26,41-44，这些方法在未来将具有重要价值。尽管分离这两类细胞仍然困难，但明确它们各自独特的功能，对于开发针对涉及中枢神经系统中小胶质细胞和巨噬细胞的疾病的靶向治疗具有重要意义。

关于脊髓损伤病灶内细胞相互作用的描述主要来源于细胞培养模型的研究。这主要是因为对活体动物中脊髓损伤病灶及其免疫细胞进行联合成像存在诸多技术挑战。目前已有多种类型和严重程度不同的啮齿类动物脊髓损伤模型，包括挫伤模型45,46、针刺损伤2、切割伤47，以及本文所述的背柱压迫损伤模型16,18,48。随着损伤程度加重，脑膜部位的炎症反应增强，这为植入观察窗或实施连续成像所需的手术带来了独特挑战。这些挑战包括吞噬细胞的浸润以及手术部位形成纤维组织。通过制造更小的损伤，并在硬脊膜与脊旁肌之间覆盖非免疫原性的外科敷料以保护暴露的脊髓，可在后续进行再次开窗手术，从而部分克服上述问题，本文研究背柱压迫损伤即采用此方法。此外，仅能对脊髓背侧部分进行成像也限制了损伤模型的选择，因为挫伤模型主要造成脊髓中央区域的损伤，而背柱最背侧的部分通常得以保留，尤其是在损伤后的早期阶段45,49。因此，我们描述了一种简单的损伤模型，可产生清晰、可重复的矩形病灶，既便于观察病灶内细胞的运动，也利于对轴突相对于病灶位置进行定量分析。

方案

注意：所有动物的饲养和使用均应遵循所在机构动物护理与使用委员会（IACUC）的规定。本文所述所有操作程序均已获得凯斯西储大学IACUC的批准。

1. 转基因动物

  1. 使用 commercially available fluorescent reporter mice 标记轴突（Thy-1 YFP H）50 和小胶质细胞/单核细胞（CX3CR1GFP/GFP 51；参见材料清单）。应根据机构动物护理政策，将这些小鼠进行杂交并作为独立的繁殖群体进行维持。

2. 骨髓嵌合体

  1. 选择至少8周龄的动物作为受体动物。
  2. 将宿主动物放入专为放射照射设计的圆形固定笼中，确保动物体位固定，以实现均匀的全身照射。
  3. 根据制造商说明，设置铯-137（Cs-137）放射源的计时器，对动物进行800–1,000 Rads的全身照射剂量处理（本示例中为980 Rads）。
  4. 将动物放回笼中，静置休息至少4小时。
  5. 选择具有适当基因型的供体动物（见图2A）作为骨髓前体细胞的来源。
    注意：合适的供体动物应表达与宿主不同的谱系特异性荧光报告基因，以便区分不同细胞群体；或使用与宿主相同基因型的动物作为对照。
  6. 准备一个培养皿加入70%酒精，另一个培养皿加入10 ml Roswell Park Memorial Institute（RPMI）培养基，并将40 µm细胞筛浸泡于其中。另取一个15 ml离心管加入RPMI培养基。将所有培养皿和离心管置于冰上保存。
  7. 根据机构指南，采用CO2窒息法处死供体动物。用70%乙醇浸泡整个动物，直至毛发完全湿润，以清洁皮肤和毛发。
  8. 在动物中段环形剪开皮肤，将皮肤向下拉过后肢，完全暴露腿部肌肉，从而去除下半身皮肤。
  9. 通过膝关节前向过度伸展使胫骨脱位，然后使用无菌镊子和剪刀剥离并切除胫骨两端的肌肉组织。将骨骼短暂放入含酒精的培养皿中（不超过30秒），随后转移至含有培养基的培养皿中的细胞筛上。
  10. 脱位髋关节，并剥离附着于股骨上的肌肉组织。将股骨短暂浸入酒精后，置于同一培养皿中的细胞筛上。
  11. 在组织培养超净台中，使用无菌剪刀剪去骨骼两端，将连接1 ml注射器的21号针头插入骨端，用培养基冲洗骨髓至15 ml锥形离心管中。对剩余骨骼重复此操作。
  12. 使用3 ml注射器的活塞头在培养皿中的细胞筛上碾压骨端，以提取更多细胞。
  13. 将滤膜置于50 ml锥形离心管上方，将15 ml离心管中含细胞的培养基转移至滤膜上。用活塞头碾压滤膜上的骨髓，以获得单细胞悬液。用30 ml培养基冲洗15 ml离心管、骨碎片及细胞筛，并将全部液体收集至50 ml锥形离心管中。
  14. 以500 × g离心5分钟，沉淀细胞。
  15. 加入2 ml氯化铵-氯化钾（ACK）裂解缓冲液裂解红细胞，作用2分钟。加入含10%胎牛血清的10 ml培养基终止裂解反应。以500 × g离心5–10分钟，收集细胞沉淀。
  16. 用10 ml RPMI培养基洗涤细胞一次，再用生理盐水洗涤两次，每次均以500 × g离心5–10分钟收集细胞沉淀。
  17. 将细胞重悬于200 µl生理盐水中，最终浓度为3 × 106 个细胞。
  18. 通过尾静脉注射将3 × 106 个骨髓细胞注入经照射的受体小鼠体内。
  19. 在受体小鼠笼中提供酸化水（pH 3.0），让小鼠恢复。
    注意：移植失败的小鼠通常在术后10–14天内死亡。
  20. 8周后，通过流式细胞术检测外周血免疫细胞，验证骨髓重建情况（图2B–C）。

3. 背柱压伤模型

注意：根据所需的实验选择合适的嵌合体动物或双转基因动物进行手术。在先前的步骤中已构建出带有标记的常驻细胞或骨髓来源细胞的动物。

  1. 准备并高压灭菌手术器械，包括咬骨钳、Dumont #4 镊子、虹膜剪、夹持组织用镊子、持针器和伤口夹。
  2. 准备用于小鼠镇痛的药物。通常使用布托啡诺（Bupernex）和布比卡因（Marcaine）进行镇痛。根据需要并经机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准后使用适当的药物。
  3. 使用 4% 异氟烷诱导麻醉，并以 1–2% 异氟烷维持麻醉，使呼吸频率保持在每分钟 60–100 次。在动物眼睛上涂抹眼用润滑剂，防止麻醉期间角膜干燥，并通过足部夹捏测试确认无反应。使用加热垫维持体温，并通过直肠探头监测体温。
  4. 使用电动剃毛器剃除目标脊髓节段对应区域的小鼠背部毛发，然后用聚维酮碘擦拭该区域三次，再用 70% 酒精擦拭两次。将动物置于无菌洞巾上，并用另一块在适当位置开孔的无菌洞巾覆盖动物，以便暴露手术区域。整个手术过程中，所有器械均应放置在无菌洞巾上。
  5. 使用虹膜剪沿目标脊髓节段的背侧中线切开皮肤，暴露动物背部的肌肉。
  6. 在解剖显微镜下，沿中线切开背部肌肉，包括斜方肌和背阔肌的韧带，这些结构附着于脊柱后侧的棘突，从而暴露椎体。
  7. 去除椎体横突与棘突之间的旋转肌，以暴露将要切除的特定椎板（本实验中为 T11）。通过最后一根非浮肋插入该椎体的解剖标志来确认 T11 节段。
  8. 将咬骨钳的尖端插入待切除椎板上下方的间隙，轻轻抬起以确保其牢固地卡在椎板周围，但不可过深以免损伤脊髓。一次性闭合咬骨钳以切除椎板。
  9. 根据需要，使用咬骨钳进一步切除残留椎体的小部分组织，以扩大椎板切除范围。
  10. 将 #4 镊子的尖端对准直尺，用永久性记号笔在 1 mm 处做标记。将镊子两齿之间的间距调整为 1 mm，并通过在镊子柄部滑入橡胶镊子环来固定其最大张开宽度为 1 mm。
  11. 使用 30 号针头在硬脊膜上预定的两个镊齿插入点处穿刺，形成小孔，以便镊子进入脊髓区域。
  12. 将镊子齿以 90° 角通过小孔插入硬脊膜，深度至镊子侧面标记的 1 mm 处，确保标记位于硬脊膜上方。闭合镊子并夹持 10 秒，松开后重复夹持两次，共完成三次夹持操作。随后将镊子从脊髓中取出。
  13. 将一块可吸收明胶压缩海绵浸入生理盐水中，然后覆盖于损伤部位。
  14. 使用连续缝合法，以 #4 合成不可吸收尼龙缝线将肌肉层缝合固定在椎板切除区域及浸湿的明胶海绵之上。
  15. 使用 5 mm 伤口夹将皮肤固定闭合。
  16. 在切口周围皮下注射 10 µl 布比卡因（Marcaine，1.0 mg/kg）溶于 490 µl 生理盐水中，并向臀肌内注射 5 µl 布托啡诺（Bupernex，0.1 mg/kg）。
  17. 将动物置于温热垫上恢复，并密切观察其后肢是否存在运动困难或瘫痪迹象。在动物完全从麻醉中恢复之前，不得无人看管或与其他动物同处。任何表现出明显运动功能障碍的动物均不得用于实验。
    注意：尽管该压伤模型可在脊髓任意节段实施，但从技术操作和成像角度考虑，T10–L4 节段在使用夹具稳定身体运动和减少呼吸干扰方面更具优势。若需在胸段成像，夹具的放置位置需围绕肋骨结构进行调整。

4. 活体成像

  1. 准备并高压灭菌手术器械，包括Dumont #4镊子、虹膜剪、用于夹持组织的镊子、持针器和伤口夹。
  2. 使用异氟烷对小鼠进行麻醉。诱导麻醉时浓度为4-5%，根据需要维持在1-2%，以保持每分钟60-100次的呼吸频率，并对足部夹捏无反应。保持小鼠体温，成像期间以外监测呼吸频率，并使用直肠探头持续监测动物体温。
  3. 用碘伏和酒精清洁伤口夹周围的皮肤，并按照制造商说明拆除伤口夹。拆除伤口夹后，如有需要，使用Nair去除毛发，再用聚维酮碘和70%酒精再次清洁手术部位。
  4. 用剪刀重新切开皮肤。拆除肌肉上残留的缝线，并用镊子将肌肉分开，必要时使用剪刀剪开。
  5. 在解剖显微镜下，于椎板切除部位上下一个椎体水平的横突侧方用剪刀剪开肌肉，为脊髓夹创建夹持空间。
  6. 将夹子固定在每个椎体周围并拧紧。根据需要调整夹子，为显微镜物镜接近脊髓留出空间。确保脊髓与成像平台平行，并在成像过程中维持组织稳定性。若观察到呼吸伪影，应相应调整夹子以最小化成像视野中的运动。
  7. 用Parafilm覆盖夹子。
  8. 用镊子将可吸收明胶压缩海绵从脊髓上移除，小心地尽可能取下所有碎片，同时尽可能清除覆盖在脑膜上的瘢痕组织。如有需要，用生理盐水和新的海绵覆盖暴露的脊髓。
    注意：若周围肌肉出现出血，可使用海绵压迫止血或必要时进行电灼止血。但需注意避免电灼器械接触脊髓。进行电灼时，应使用湿润的组织片或明胶压缩海绵覆盖脊髓。
  9. 首先用Vetbond密封皮肤和组织，然后使用牙科丙烯酸树脂在脊髓固定器的两个夹子之间以及动物两侧构建一个用于容纳浸没液的围堰。等待丙烯酸树脂固化。
  10. 向围堰内注入人工脑脊液（aCSF），并再次检查手术部位是否有出血。
  11. 可选步骤：此时可通过尾静脉注射荧光血管染料，以在成像过程中突出显示血管。
    注意：通常使用分子量大于70 kDa的荧光葡聚糖，但量子点和荧光标记的凝集素也可作为有效的血管染料。一般静脉注射50 µl 150,000 WM TRITC-葡聚糖。
  12. 为获得符合生理状态的免疫细胞运动性，必须将小鼠体温维持在37 °C。将小鼠转移至显微镜下的温控环境中进行成像，并通过呼吸频率和足部夹捏反应监测麻醉深度。成像过程中应频繁监测动物状态，以确定麻醉深度，目标呼吸频率为每分钟60-100次。
  13. 通过显微镜目镜定位成像区域。
  14. 调整双光子激光扫描显微镜，每30-60秒采集一次z轴层扫图像，以获取动态成像数据。
  15. 成像结束后，将动物从加热箱中取出。
  16. 松开脊髓夹并取出小鼠。在移除夹子的同时，将丙烯酸围堰从皮肤上轻轻剥离。
  17. 若需再次成像，应在脊髓上覆盖浸有生理盐水的明胶压缩海绵。将肌肉和皮肤缝合覆盖手术部位。动物在麻醉恢复期间不得无人看护，也不得与其他动物同处。若动物在恢复后出现任何神经功能缺损迹象，应实施安乐死。否则，应根据IACUC批准的安乐死程序，在动物苏醒前将其置于CO2安乐死舱中实施安乐死。
  18. 按照制造商说明，使用图像分析软件分析荧光图像。

结果

背柱压迫损伤的示意图如图1A所示。损伤后，使用脊柱夹具对动物进行准备和稳定，以进行活体显微成像（图1B）。背柱压迫损伤后立即拍摄的图像显示一个清晰可见的矩形损伤区域，镊子齿插入点明确可辨。损伤部位的轴突在整个背柱范围内被完全切断（图1C）。血管结构保持完整，荧光检测未发现血管染料渗漏。为了在数周内对同一损伤区域进行连续成像，可在椎板切除术后将肌肉和皮肤缝合，以便后续再次暴露。在后期时间点可观察到类似的损伤形态（图1D、E）。损伤后5天，镊子插入部位仍可见，但由于炎症引起的继发性损伤，损伤区域已开始扩大。损伤区域尾端的轴突通过一种称为“轴突回缩”的过程从初始损伤部位发生回缩。损伤区域头端的轴突则表现出类似沃勒变性（Wallerian degeneration）的退变现象（图1D、E）。损伤后第5天至第22天之间，损伤区域的大小趋于稳定。与此同时，在这些时间点可观察到大量CX3CR1+细胞浸润至压迫损伤区域及其周围，但由于本实验制备方法的限制，尚无法区分这些细胞的具体类型（小胶质细胞或巨噬细胞），如图1所示。

为了区分微胶质细胞和巨噬细胞在挤压损伤微环境中的行为，采用了辐射嵌合体模型（如图2A所示）。首先，将CX3CR1+/GFP小鼠的骨髓前体细胞替换为非荧光的供体细胞，从而仅能通过荧光成像观察到GFP+的中枢神经系统驻留型微胶质细胞。骨髓重建的效率可通过移植后8周外周血的流式细胞术检测来确认（图2B, C）。在图2B中，于CX3CR1+/GFP → C57BL/6嵌合小鼠中检测到呈蓝色标记的F4/80和GFP双阳性巨噬细胞，其中也存在部分GFP阴性但F4/80阳性的单核细胞。而在图2C中，当用野生型骨髓替换CX3CR1+/GFP受体小鼠的骨髓后，不再检测到F4/80与GFP双阳性细胞。损伤前，微胶质细胞均匀分布于脊髓中，呈现静息状态的分支状形态（图2D）。损伤后8天，在损伤区域及其周围仅能检测到少量微胶质细胞，这些细胞呈现阿米巴样形态（图2E）。其次，将非荧光小鼠的骨髓前体细胞替换为来自CX3CR1+/GFP小鼠的骨髓细胞，从而使骨髓来源的CX3CR1+单核细胞/巨噬细胞可通过GFP荧光被观察到（图2A）。损伤前，所检测到的唯一GFP+细胞主要位于血管周围，据报道这些细胞来源于骨髓，并持续进行常规更替28（图2F）。在挤压损伤后，可在围绕损伤区域的血管内侧观察到CX3CR1+/GFP细胞（图2H-J），而损伤中心则充满浸润的CX3CR1+/GFP巨噬细胞（图2G）。

可以对背柱进行长达6小时的时间推移成像。在图3中，我们展示了一只非嵌合型CX3CR1+/GFP小鼠在损伤后立即观察到循环系统中的细胞从血管中移出，朝向损伤核心区域迁移，并在损伤部位内移动（图3A, B；补充视频1）。利用荧光强度进行图像分析以识别细胞，可追踪巨噬细胞的移动路径（图3A, B；补充视频1）。基于图像分析所得的统计数据表明，巨噬细胞在病灶区域的平均迁移速率为3.6 µm/min（图3D）。最后，在损伤后22天，仍可在病灶区域内检测到轴突、小胶质细胞和巨噬细胞，表明成像区域在长时间内保持稳定（补充视频2）。

脊髓挤压损伤过程、镊子使用、损伤时间线示意图、小胶质细胞反应研究。
图1：背柱挤压损伤的建立及连续成像。（A） 通过切除目标节段椎骨的背侧突来实施背柱挤压损伤。将镊子插入脊髓背柱，间距为1 mm，然后闭合3次，以产生如紫色区域所示的损伤。（B） 随后将动物用脊髓夹固定，以确保活体成像时的稳定性。（C） 损伤后立即可清晰识别镊子插入部位（红色椭圆）和矩形挤压损伤区域（灰色方框）。可见背根中的轴突（白色箭头），以及损伤灶尾侧受伤轴突的末端（实心箭头）。（D） 损伤后5天，仍可轻松观察到镊子插入部位（红色椭圆）和损伤范围（灰色方框），且损伤区域较初始损伤有所扩大。在损伤灶头侧可见经历类似沃勒变性（Wallerian-like degeneration）的轴突（空心箭头），以及背根中的轴突（白色箭头）和受伤轴突的末端（白色箭头）。（E） 损伤后22天，损伤部位仍可识别，其尺寸与损伤后5天相似。注意在损伤部位及其周围存在大量CX3CR1+细胞。标注的结构与（D）中相同。所有比例尺 = 200 μm。 请点击此处查看该图的放大版本。

小鼠模型实验，显示标记的小胶质细胞和巨噬细胞、轴突损伤示意图及显微图像。
图 2：构建嵌合小鼠以追踪背柱 crush 损伤中表达 CX3CR1+/GFP 的中枢神经系统驻留小胶质细胞或骨髓来源巨噬细胞。（A） 生成嵌合小鼠的示意图，其中小胶质细胞或巨噬细胞表达 CX3CR1+/GFP。首先，对 Thy-1 YFP H 小鼠进行照射，并用从 CX3CR1+/GFP 小鼠中分离的骨髓细胞重建骨髓，从而获得巨噬细胞为 GFP+ 的嵌合小鼠。其次，对 Thy-1 YFP H / CX3CR1+/GFP 小鼠进行照射，并用从非荧光小鼠中分离的骨髓细胞重建骨髓，从而产生小胶质细胞为 GFP+ 的嵌合小鼠。（B） 嵌合动物外周血中 F4/80+ 和 CX3CR1 GFP+ 细胞的流式细胞术数据分析示例，该动物由 CX3CR1+/GFP 供体骨髓移植至经照射的 C57BL/6 受体小鼠获得。来源于 CX3CR1 阳性供体且同时表达 GFP 和 F4/80 的细胞显示在蓝色高亮区域。（C） 嵌合动物外周血中 F4/80+ 和 CX3CR1 GFP+ 细胞的流式细胞术数据分析示例，该动物由 C57BL6 供体骨髓移植至经照射的 CX3CR1+/GFP 受体小鼠获得。注意蓝色高亮区域内缺乏 CX3CR1+/GFP 和 F4/80 双阳性细胞。（D） 来自第一种嵌合方案小鼠的活体双光子显微镜快照，显示背柱内具有分支形态的 GFP+ 小胶质细胞（箭头）。这些细胞散布于背根和背柱的轴突（黄色）之间。比例尺 = 100 µm。（E） 同一只（D）小鼠在背柱损伤后 8 天的活体成像显示，少数 CX3CR1+ 小胶质细胞具有较大、阿米巴样形态的胞体，且缺乏突起（箭头）。比例尺 = 100 µm。（F） 来自（A）中第二种嵌合方案小鼠的快照，显示中枢神经系统实质内仅有少量 GFP+ 巨噬细胞。比例尺 = 100 µm。（G） 同一只（F）小鼠在背柱损伤后 8 天的活体成像显示，损伤部位及其周围出现大量巨噬细胞浸润。比例尺 = 100 µm。（H） 未受伤动物中与血管接触的 CX3CR1+ 血源性细胞的高倍放大图像。比例尺 = 30 µm。（I) 与血管接触的 CX3CR1 细胞的三维重建图像，从血管内部视角观察。比例尺 = 30 µm。（J） 与血管接触的 CX3CR1 细胞的三维重建图像，从血管外部视角观察。比例尺 = 20 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

标记的小胶质细胞和巨噬细胞的小鼠模型实验、轴突损伤示意图、显微图像。
图 3：背柱挤压损伤后非嵌合型 CX3CR1+/GFP 小鼠中典型的细胞追踪数据。（A） 背柱挤压损伤后立即拍摄的受损轴突（黄色）周围 CX3CR1+ 小胶质细胞和巨噬细胞的快照，数据来自 补充视频 1。（B） 在110分钟的活体成像过程中，(A) 中 CX3CR1+ 细胞的运动路径（灰色）。（C） (B) 中路径的时间编码表示。轨迹颜色根据其在整个110分钟视频中的时间点进行着色，如时间条所示。（D） CX3CR1+ 细胞总体运动性的直方图。所有比例尺均为 30 µm。请点击此处查看该图的高清版本。

补充视频1：双杂合子 Thy-1YFP/+ / CX3CR1GFP/+ 小鼠背柱挤压损伤后即刻的活体成像视频。 在T11水平进行背柱挤压损伤后立即进行活体脊髓成像。右侧面板显示CX3CR1+小胶质细胞和巨噬细胞的运动情况。细胞运动的路径在左侧面板中以白色轨迹表示。损伤部位位于左上角。可见CX3CR1+细胞沿这些轨迹向损伤部位迁移。轴突以黄色显示。比例尺 = 40 µm。总时长：110分钟。播放速度：300倍。

补充视频2：双杂合子Thy-1YFP/+ / CX3CR1GFP/+小鼠在背柱挤压损伤后22天的代表性活体成像视频。 本视频展示了一只小鼠在T11脊髓节段初次背柱挤压损伤后22天的代表性活体成像结果。损伤部位位于画面右上角。右下侧显示的是向头端走行的轴突（黄色）。背侧静脉和血管用TRITC-葡聚糖标记（红色）。与损伤后即刻相比，病灶内CX3CR1+细胞的移动速度较慢。比例尺 = 50 µm。总时长：90分钟。播放速度：600倍。

讨论

实时成像不同细胞类型在其原生组织区室中伴随病理过程发生的相互作用，已引起广泛关注。在中枢神经系统（CNS）致密的网络结构中，细胞与邻近细胞之间的接触和信号传递对正常功能至关重要，也是理解CNS病理机制的关键。本文描述了利用双光子激光扫描显微镜观察脊髓机械性损伤区域内细胞运动的方法。除了手术质量和组织准备的优劣之外，组织的机械稳定性对于成功进行时间序列显微成像尤为关键，特别是必须将脊髓与呼吸运动带来的伪影有效隔离。可通过解剖显微镜下观察脊髓是否出现与动物心率或呼吸节律同步的移动来评估稳定性。稳定性评估应在手术过程中以及开始成像前立即进行。若动物稳定性不佳，应调整脊髓夹的位置及其夹紧程度。结合骨髓嵌合方法，利用细胞类型特异性的荧光报告小鼠模型，可有效区分单核细胞与小胶质细胞以及轴突。既往研究利用本文所述方法已证实，在创伤后继发性轴突损伤中起作用的是来源于血液的单核细胞，而非小胶质细胞43。使用葡聚糖偶联的血管染料可标记血管，既可作为成像时的解剖标志，也可用于识别血管完整性的破坏。选择合适的荧光报告小鼠模型对于准确识别目标成像细胞类型至关重要。

开发适用于所开展研究的荧光小鼠模型对于实验的成功也至关重要。传统上，区分中枢神经系统（CNS）中两种吞噬性CX3CR1+/GFP细胞群体一直较为困难。如本文所示，一种常用的免疫学技术——辐射嵌合体，可用于区分具有放射抗性的CNS常驻小胶质细胞与骨髓来源的巨噬细胞。辐射过程有可能损伤血脑屏障并改变细胞表型，因此应谨慎使用该模型。这些变化的程度取决于辐射剂量以及恢复期的长短，其对不同炎症模型的影响尚未得到充分研究。在辐射过程中对头部进行屏蔽可最大限度减少辐射对CNS血脑屏障的影响，已有研究表明，即使脊髓未被直接屏蔽，头部屏蔽仍可减少辐射后细胞向脊髓的浸润52。本文观察到，在稳态条件下，由于嵌合体生成而浸润到CNS的细胞数量与进入病灶区域的细胞数量相比可忽略不计。其他可考虑的替代模型包括药物诱导的嵌合体52或连体小鼠模型53。

本文介绍了一种特异性强、操作简便且可重复的小损伤模型，该模型可导致脊髓背侧白质发生易于通过双光子显微镜成像的病灶。该方法还可提供可量化的损伤区域，用于检测背侧柱中轴突回缩的程度，这一指标在文献中已与互补的固定组织分析相结合16,18,43,48,54。在此模型中，动物仅表现出轻微的功能缺陷，损伤后无需特殊护理。未来利用本文所述的背侧柱压迫损伤模型及成像技术，可能成为评估脊髓损伤治疗效果的有力筛选工具。这些治疗方法可能包括小分子抑制剂、药物、细胞产物、组织移植以及联合治疗。巨噬细胞、小胶质细胞与神经元之间的相互作用也可能在脊髓其他疾病模型中发挥作用，包括多发性硬化、肿瘤、脑膜炎和肌萎缩侧索硬化等，该技术在这些疾病的研究中亦可能具有应用价值。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

以下机构为本研究提供了关键的资金支持：MSTP T32 GM007250（T.A.E.）、5T32EB7509（D.S.B.）、NCI R01 CA154656（A.Y.H.）、Dana基金会（A.Y.H.）、St. Baldrick’s基金会（A.Y.H.）、Alex’s Lemonade Stand基金会（A.Y.H.）、Gabrielle’s Angel基金会（A.Y.H.）以及Hyundai Hope-on-Wheels项目（A.Y.H.）。作者衷心感谢Jerry Silver和Sarah Busch在学习背柱压迫（Dorsal Column Crush, DCC）损伤技术过程中提供的不可或缺的帮助。作者还感谢Jingquang You、Elisabeth Hare和Hongmei Hu在基因分型方面的技术支持，以及Ross Anderson在安装脊柱稳定装置方面的协助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
CX3CR1 GFP 小鼠杰克逊实验室5582
Thy-1 YFP H 小鼠杰克逊实验室3782
小鼠派式笼Braintree ScientificMPC 2 套件
60 mm2 培养皿康宁430166用于骨髓分离
Falcon 40 μm细胞滤膜Fisher Scientific08-771-1用于骨髓分离
1 个 15 ml 和 1 个 50 ml 离心管Fisher Scientific用于骨髓分离
21号针头BD305177用于骨髓分离
1 ml 注射器BD309628用于骨髓分离
ACK裂解缓冲液GibcoA10492-01用于骨髓分离
HBSSCorning Cellgro21-022-CV用于骨髓分离
RPMI 培养基SigmaR8758用于骨髓分离
F4/80 抗体Ebioscience12-4801 PE用于嵌合体的流式细胞术验证
30 号胰岛素注射器BD328280尾静脉注射方法
脊髓夹NarshingeSTS-A用于成像
Ortho-Jet 牙科丙烯酸粉末Lang DentalREF1320用于成像
Ortho-Jet 牙科丙烯酸液体Lang DentalREF1404用于成像
Gelfoam 明胶海绵Pfizer9034201用于成像
4-0 Ethilon 缝线Ethilon1667G用于手术
反射夹，7 mmKent ScientificINS750344用于手术。使用前灭菌
虹膜剪精细科学工具14061-09用于手术
45/5 镊子，Dumoxel精细科学工具11251-35用于手术
咬骨钳Fine Science Tools16021-14用于手术
30号针头BD305106用于在硬脑膜上制作通路孔
Dumont #4 镊子，生物学用尖头Dumont11242-40用于手术
持针器精细科学工具12002-12用于手术
米歇尔伤口夹持钳Kent ScientificINS700753用于手术
伤口夹移除器精细科学工具12033-00用于手术
镊子用O形圈Fine Science Tools11200-00手术时，通常随#4镊子提供，也可单独订购
无线可充电动物毛发修剪器Wahl8900 系列用于手术
Vetbond3M1469SB用于手术
聚维酮碘溶液（10% 普罗维碘皮肤外用溶液）Purdue Products L.P.NDC 67618-150-08用于手术
Nair 脱毛乳液Church & Dwight Co., Inc.NRSL-22329-05手术用
异氟烷Butler ScheinNDC 11695-6776-2药物 – 用于手术
MarcaineHenry ScheinNDC 0409-1587-50药物 – 手术时皮下注射1.0 mg/kg
BupernexHenry Schein121-7793药物 – 用于手术的布托啡诺 0.1 mg/kg
aCSFSigma 化学品119 mM NaCl
26.2 mM NaHCO₃3
2.5 mM KCl
1 mM NaH2PO4<脊髓创伤性损伤会引发涉及血液来源的巨噬细胞和中枢神经系统（CNS）常驻小胶质细胞的炎症反应。活体双光子显微镜技术使得能够在活体动物中研究脊髓损伤部位的巨噬细胞和小胶质细胞。该技术可在成年动物背柱受到创伤性损伤后实施。本文描述了利用辐射骨髓嵌合体方法区分中枢神经系统中巨噬细胞与小胶质细胞的技术，以获得仅巨噬细胞或仅小胶质细胞表达遗传编码绿色荧光蛋白的实验动物。同时介绍了一种损伤模型，通过压迫脊髓背柱产生一个简单、易于接近且呈矩形的损伤区域，该区域可通过椎板切除术在动物体内清晰观察。此外，本文还将概述在损伤后数天至数周内，对动物损伤解剖部位进行连续成像的操作流程，以研究细胞间相互作用。>1.3 mM MgCl2
10 mM 葡萄糖		用于手术
来自《冷泉港实验方案》
TRITC-葡聚糖 150,000 MWSigmaT1287用于静脉注射以标记血管系统

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