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方法文章

香烟烟雾暴露小鼠肺气肿及小气道重塑的自动化测量

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DOI：

10.3791/52236

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2015年1月16日

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1Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, Brigham and Women's Hospital - Harvard Medical School, 2Department of Respiratory Medicine, University of Cambridge - Addenbrooke's Hospital, 3Lung Transplant Program, Brigham and Women's Hospital - Harvard Medical School, 4COPD and IPF Programs, Lovelace Respiratory Research Institute

本文内容

摘要

本实验方案旨在提供一种自动化方法，用于量化慢性阻塞性肺疾病（COPD）小鼠模型中的慢性肺部病理变化。该方案包括将小鼠暴露于香烟烟雾（CS）中、测定肺功能、灌注膨胀肺组织，以及采用形态计量学方法测量小鼠肺气肿和小气道重塑情况。

摘要

预计到2020年，慢性阻塞性肺疾病（COPD）将成为全球第三大常见死亡原因(1)。COPD的动物模型被用于鉴定参与疾病进程的分子，并评估新型COPD疗法的有效性。研究人员使用多种动物模型，涉及不同物种，包括啮齿类动物、豚鼠、兔子和狗(2)。然而，应用最广泛的模型是小鼠暴露于香烟烟雾的模型。小鼠是建模COPD特别有用的物种，因为其基因组易于操作，可生成特定蛋白缺失或过表达的动物。对暴露于香烟烟雾的基因靶向小鼠的研究，已提供了有关单个分子在COPD不同肺部病理中作用的宝贵信息(3-5)。大多数研究集中于与肺气肿发展相关的通路，肺气肿可导致COPD特征性的气流受限。然而，在人类COPD患者中，小气道纤维化也显著导致气流受限(6)，但关于香烟烟雾暴露动物中小气道纤维化病变的发生机制，目前了解甚少。为弥补这一知识空白，本方案对香烟烟雾暴露小鼠的肺气肿发展和小气道纤维化进行定量分析。本方案采用全身暴露技术使小鼠接触香烟烟雾（CS），随后测定小鼠的呼吸力学参数，将小鼠肺组织在标准压力下充气，并用福尔马林固定肺组织。随后，研究人员可对肺组织切片进行染色：使用吉姆萨染色（Gill’s stain）测定平均肺泡弦长（作为肺气肿严重程度的指标），或使用马松三色染色（Masson’s trichrome stain）测定小气道周围细胞外基质（ECM）蛋白的沉积（作为小气道纤维化的指标）。对分子通路在这两种肺部病理中作用的研究，将有助于更深入地理解COPD的发病机制。

引言

利用动物模型研究慢性阻塞性肺疾病（COPD）具有挑战性，因为目前尚无模型能够完全复制人类疾病的全部特征(2)。大多数研究者选择小鼠建立COPD模型，原因是小鼠在肺部生理、病理、遗传和代谢物方面与人类具有相似性。此外，小鼠研究成本相对较低，且在香烟烟雾（CS）暴露后6个月内即可出现肺气肿和小气道重塑(5,7-9)。

香烟烟雾诱导的慢性阻塞性肺疾病（COPD）：有多种方法可在小鼠中诱导COPD。大多数研究人员采用香烟烟雾（CS）暴露法，因为CS是人类COPD的主要致病因素。持续6个月的CS暴露可在小鼠中引起肺气肿和小气道重塑（SAR），但所诱导疾病的严重程度因小鼠品系而异。例如，NZWLacZ小鼠对CS诱导的肺气肿具有抗性，而AKR/J小鼠则极为敏感(10)。大多数研究者在CS暴露模型中使用C57BL/6品系小鼠，因为该品系拥有大量可用的基因靶向小鼠。在持续6个月的CS暴露后，野生型（WT）C57BL/6小鼠会出现肺气肿和小气道纤维化，但两种病变的严重程度均相对较轻(5,10)。研究人员采用两种CS暴露方式：仅鼻部暴露和全身暴露。仅鼻部暴露技术的主要缺点是：1）操作更为耗时费力；2）小鼠需被固定在狭小的暴露舱内，可能引发应激反应和高热(11)。全身暴露（本文所述方法）的主要缺点是：小鼠在清理毛发时可能经口摄入（而不仅是吸入）尼古丁和焦油产物。与仅鼻部暴露CS的小鼠相比，接受全身暴露CS的小鼠碳氧血红蛋白水平较低，且体重下降较少(12)。

肺功能测试（PFTs）：在空气或香烟烟雾（CS）暴露6个月的C57BL/6野生型（WT）小鼠中，肺顺应性和弹性阻力的测量值通常相似，这是由于该品系暴露于CS后仅产生相对较轻的肺气肿(10)。然而，当肺气肿性破坏更为严重时，可检测到肺顺应性升高以及压力-容积（PV）流量环向左偏移。后者可出现在对CS作用更为敏感的小鼠品系中(10)，或在暴露于CS的C57BL/6基因靶向小鼠中（其肺气肿表型较C57BL/6 WT小鼠更严重）(13)，亦或在暴露于CS并经历环境改变从而对CS更易感的小鼠中(14)。本方案采用小型动物呼吸机，在麻醉小鼠中测定肺弹性回缩力的降低（准静态肺顺应性[Cst]升高，组织弹性阻力[H]降低）、PV流量环，以及气道和组织阻力的变化(15,16)。

肺气肿的评估指标：在暴露于香烟烟雾（CS）的C56BL/6品系小鼠中，肺气肿发展的分析具有挑战性，因其在空间分布上具有异质性。目前有多种不同方法用于量化小鼠的肺泡腔扩大。最早使用的方法是平均线性截距（Lm）(17)。然而，Lm法是一种耗时的手动过程，可能无法充分反映疾病的空间异质性（除非对肺组织的所有切面进行随机取样），因此该方法的使用可能在分析中引入观察者偏倚。破坏指数 [DI,(18)] 是另一种用于量化肺泡腔扩大的方法，其通过将带有50个均匀分布点的透明片覆盖在苏木精-伊红染色肺组织切片的数字化打印图像上进行评估。PI方法根据每个点周围区域中肺泡导管和肺泡壁的破坏程度进行评分。DI方法的主要缺点是耗时较长，且准确性并不优于其他方法(19,20)。

本方案通过Gill染色的石蜡包埋肺组织切片，测量平均肺泡弦长和肺泡面积。形态计量学软件将肺组织切片图像转换为二值图像（其中组织为白色，气腔为黑色），然后叠加由水平和垂直线（弦）组成的均匀网格，软件进而量化被识别为气腔区域内的每条弦的长度。利用该方法，可以以标准化且相对自动化的方式测量肺部各区域肺泡的大小(21)。

小气道重塑（SAR）：在暴露于香烟烟雾（CS）的动物中，细胞外基质蛋白（尤其是间质性胶原蛋白）在小气道周围沉积增加，导致气流受限。相较于肺气肿的形成，研究人员在慢性阻塞性肺疾病（COPD）动物模型中对SAR的研究较少(22)。为了定量分析香烟烟雾暴露小鼠的小气道重塑情况，本方案采用图像分析软件，测量经Masson三色染色的石蜡包埋肺组织切片中小气道（平均直径介于300至899 µm之间的气道）周围沉积的细胞外基质蛋白层的厚度。

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方案

完成该方案大约需要25周。在24周内，该方案使小鼠暴露于空气或烟雾中。在烟雾暴露结束后，当天对小鼠进行肺功能测定，并将肺部充气至固定压力后固定并取出。研究人员还需额外时间进行肺组织的包埋、切片和染色（2–3天），以及图像的采集与分析（根据研究的小鼠数量，需2–4天）。该方案也可用于测量小鼠与年龄相关的肺泡腔扩大。

本方案中所述所有操作均已获得布莱根妇女医院/哈佛医学院机构动物照护与使用委员会批准。

1. 全身香烟烟雾暴露

  1. 将小鼠置于安装在通风橱内的全身烟雾暴露装置中进行烟雾暴露（见图1）。
    注：该装置可自动将实验香烟装入转轮，点燃香烟，并在侧流烟收集室中收集侧流烟；随后通过泵从香烟中抽取主流烟，将主流烟与侧流烟混合。混合稀释室内的风扇将烟雾与环境空气混合，并将混合烟雾送入暴露舱中。
  2. 将装有小鼠的笼子（无需取下笼盖）（图1）放入暴露舱内。允许小鼠在笼内自由活动，并在整个烟雾暴露期间（约1.75小时）自由获取食物和饮水。
  3. 在香烟燃烧室下方放置一个盛水的桶，用于熄灭弹出的香烟。将乙醇（100%）通入泵中，并将其连接至装置。开启装置的微处理器组件，以启动香烟的自动装载、泵的抽吸动作以及点火丝的加热过程。
  4. 该装置每次同时装载、点燃并燃烧10支香烟，随后弹出用过的香烟，并自动更换为新的一组10支香烟，重复此过程。每个循环持续9分钟。
  5. 通过以下方式使小鼠逐步适应烟雾暴露：第1天暴露于20支香烟的烟雾，第2天40支，第3天60支，第4天80支，第5天100支。在适应期期间，需密切观察小鼠是否出现应激反应的迹象。
  6. 经过5天的适应期后，每天对小鼠进行100支香烟的烟雾暴露，每周5或6天，持续6个月。该暴露水平足以在C57BL/6野生型小鼠中诱导出相对轻度的气道扩张（23,24）。对照组小鼠则在6个月内暴露于室内环境空气中。在烟雾适应前及之后每周称量小鼠体重，以评估烟雾暴露对体重的影响。
  7. 在燃烧完前60支香烟后，监测暴露舱内的总悬浮颗粒物（TSPM）：
    1. 称量滤纸并将其放入与定时滤膜采样器和干式气体流量计相连的在线滤膜 holder 中。定时滤膜采样器从暴露舱中抽取空气通过滤纸，气体流量计则测量采样过程中的空气流速。
      注：当20 m3暴露舱空气通过滤纸（由干式气体流量计测定）时，滤纸可捕获其中的颗粒物。
    2. 根据采样前后滤纸重量的变化（单位为mg）计算每m3空气中的总颗粒物（TPM）浓度。理想的TPM浓度应在150至200 mg/m3之间。
  8. 所有香烟燃烧结束后，将笼子从暴露舱中取出，并观察小鼠20分钟，记录是否有应激反应的迹象。
  9. 每次使用后用100%乙醇清洗泵，并每两周清洁装置中的所有端口和金属杆，以促进空气流通并防止焦油积聚。

2. 肺功能测试（PFTS）与肺扩张

  1. 暴露结束后，通过腹腔注射生理盐水（USP级）200 μl，其中含有混合麻醉剂（氯胺酮 100 mg/kg、赛拉嗪 10 mg/kg 和乙酰丙嗪 3 mg/kg），对每只小鼠进行麻醉，并在眼睛上涂抹兽用眼膏以防止角膜干燥。等待动物达到外科麻醉深度，通过脚趾夹捏法评估麻醉深度。
  2. 剃除气管前方的皮肤毛发，先用含碘溶液消毒，再用乙醇擦拭。使用已灭菌的剪刀在气管前方沿中线切开皮肤及皮下组织，用镊子分离胸骨甲状肌以暴露气管。
  3. 将一段2英寸长的丝线从气管后方穿过，在气管前壁使用已灭菌的气管剪进行气管切开术，插入气管插管（18 G），并用丝线固定插管。
  4. 通过气管插管将小鼠连接至呼吸机适配器的Y型管，启动机械通气，设置潮气量为10 ml/kg，呼吸频率为150 次/分钟。
    注意：此阶段必须确保小鼠处于充分麻醉状态，以获得准确的肺功能检测（PFT）数据。若小鼠未达到外科麻醉深度，需追加麻醉剂。所有PFT操作总时长约7.5分钟，因此一旦达到外科麻醉深度，通常无需再次追加麻醉剂。从麻醉诱导至安乐死的总时间约为20分钟。
  5. 将肺部充气至总肺容量（TLC）3次，建立容积历史以测定吸气容量（IC）并减少肺不张。随后执行单频强迫振荡操作（SnapShot-150扰动），评估呼吸系统的动态阻力（R）、弹性（Ers）和顺应性（Crs）；接着执行宽带频率强迫振荡操作（Quick Prime-3扰动），测量中心气道阻力（Rn）、组织阻力（G）、组织弹性（H）以及G/H比值（）。最后，在容积-压力-流量操作过程中记录准静态顺应性（Cst）。
  6. 重复上述每项操作五次（或持续增加测量次数直至获得稳定读数），每次重复测量组之间将肺部充气至TLC三次。记录每只小鼠各参数的平均值。
  7. 将小鼠从呼吸机上移除，采用CO2麻醉结合颈椎脱位法实施安乐死［本机构动物护理与使用委员会已批准该安乐死方法］。剪开膈肌，沿胸骨中线打开胸腔，去除前部肋骨以暴露肺组织。解剖气管周围的皮肤和皮下组织，并将第二段2英寸长的丝线从气管后方穿过。
  8. 准备肺组织灌注设备（图2）：
    1. 取一个500 ml锥形三角烧瓶，加入无菌PBS至其容积的¾，用橡胶塞密封后倒置，并悬挂在铁架台上（使磷酸盐缓冲液pH7.4（PBS）的液面高于小鼠心脏25 cm）。
    2. 将输液装置的一端穿过橡胶塞插入烧瓶内的PBS中；另将一段6英寸长的塑料移液管穿过橡胶塞，使其开口位于PBS弯月面之上，以便空气进入以替代流出的PBS。
    3. 打开输液装置的阀门，使PBS流经整个系统，以排出输液装置内的空气。
  9. 将输液装置连接至气管插管，打开阀门，使PBS在重力作用下流入肺部，直至肺部完全膨胀。关闭阀门，使用手术缝线在气管插管远端结扎气管，然后移除插管。
  10. 用镊子提起气管，在结扎结近端切断气管，解剖气管后方及肺部的结缔组织。小心取出肺组织（避免划伤），将其置于含有10%生理盐水缓冲福尔马林的试管中。室温下固定过夜（O/N），次日用PBS冲洗两次。
  11. 将肺组织包埋于石蜡中，切取5 μm厚的切片，然后按以下步骤进行Gill's染色。

3. 肺气肿

  1. 吉氏染色法对石蜡包埋肺组织切片进行染色
    1. 将切片置于塑料切片架中，放入70ºC的烘箱内孵育20-30分钟。
    2. 将切片在二甲苯中依次孵育，每次2分钟，共更换四次，以完成脱蜡。
    3. 将切片依次在两份100%乙醇中各孵育2-3分钟进行再水化，随后在两份95%乙醇中各孵育2-3分钟，最后在PBS中洗涤两次，每次2-3分钟，每次更换溶液。
    4. 将切片置于1:1混合的吉氏苏木精染液与改良哈里斯苏木精染液中，孵育18-48小时。
    5. 将切片在五份蒸馏水中依次洗涤2分钟，随后在两份95%乙醇中各孵育2-3分钟进行脱水，再在两份100%乙醇中各孵育2-3分钟。
    6. 将切片在四份二甲苯中依次孵育2分钟，以完成透明处理。
    7. 使用透明封片介质封片，并加盖盖玻片，避免产生气泡，以免影响后续分析。
  2. 随机图像采集：
    1. 使用显微镜、20倍物镜、相机及可获取高质量数字图像的软件，以TIFF格式采集黑白图像。
    2. 每只小鼠随机采集约20-30张图像（放大倍数×200），观察者对实验分组设盲，避免选择肺组织膨胀不足的区域。
    3. 将一个带网格的显微载玻片定位器贴附于切片上。该定位器包含一系列方格，每个方格在垂直方向以字母标记，水平方向以数字标记，每个方格中心有一个十字标记（+），并由一个字母和一个数字组合唯一标识（例如，A1, A2,……Z25）。
    4. 使用“随机区域生成器”Excel表格随机选择一个方格用于图像采集。为生成随机字母，在表格的B1单元格中输入EFGHJKLMNPQRSTU（研究人员可根据切片上覆盖肺组织的方格范围调整该字母序列）。接着，在C1单元格中输入公式[=MID($B$1,1+INT(RAND()*LEN($B$1)))]，以在C1中随机生成一个字母。将C1复制并粘贴至C2、C3、C4等单元格，生成一列随机字母。
    5. 为在相邻列中生成随机数字，在D1单元格中输入公式=RANDBETWEEN(5,25)（5-25为切片上组织的典型范围）。可根据实际情况调整该范围，以覆盖覆盖肺组织区域的数字编号范围。
    6. 将D1复制并粘贴至D2、D3、D4等单元格，生成一列随机数字，与随机字母列并列。因此，每一行包含一对随机生成的字母和数字，对应于定位器方格上的标签（例如，E17, H24…）。
    7. 将切片置于显微镜载物台上，使用4倍物镜找到定位器上的对应方格（例如，E17, H24…），并将该方格置于显微镜视野中心。
    8. 将显微镜视野中心与所选方格中心的“+”对齐。移除定位器，使用20倍物镜聚焦于肺组织，并以灰度TIF文件格式采集图像。若肺组织覆盖面积小于<50%的显微视野，则选择下一个随机生成的方格。重复此过程，直至每只动物采集到约20-30张图像。将每只动物的所有图像保存在一个以该动物标签编号命名的文件夹中，以便Excel报告宏能够识别这些文件。

4. 形态计量学用于测量肺气肿

该方案使用 Scion Image 及自定义宏来分析肺泡腔扩大情况。Scion Image 是原始 NIH Image 软件的 Windows 兼容版本，后者运行于 Macintosh 操作系统。Scion Image 可在 Windows XP 系统下运行，目前仍可通过 Wikiversity.org 在线获取，在该网站搜索“Scion Image”即可找到该软件的手册链接以及 beta 4.0.2 版本的下载链接。软件的安装与操作详情见在线补充手册，下文将对其进行简要概述。肺泡弦长宏（alveolar chord length macro）是在 NIH Image 提供的宏基础上修改而成。

  1. 准备用于 Scion 图像分析的 Gill 染色肺组织切片 TIFF 图像：
    1. 启动 Scion Image，并按照在线补充材料中的说明加载宏。选择 Open Brightfield Image [1] 宏以选择并打开图像 TIFF 文件。接着，使用图像编辑工具对图像进行分析前处理。
    2. 使用画笔工具，将图像中非气腔或肺泡壁的区域强制设定为气腔或组织。例如，将支气管和血管涂成黑色，使其被分析为组织；将占据肺泡腔空间的炎性细胞（或尘埃）涂成白色，使其被分析为气腔。
    3. 通过点击 LUT 窗口底部的 Black 或 White 文字来选择画笔颜色。然后点击画笔工具。如需更改画笔大小，双击画笔工具并输入合适的画笔尺寸。按住鼠标在图像上拖动，以将结构涂成所选颜色（参见上述第1步）。
  2. 测量气腔的平均弦长
    1. 选择宏 Chord Length Air [2] 以测量气腔的弦长。
    2. 通过首先在图像中心附近单击鼠标，然后上下拖动鼠标来调整阈值（介于0到255之间的数值，显示在“Info”窗口中）。再次单击鼠标以确认所选阈值。调整阈值，使肺泡壁的厚度与原始图像中的厚度一致。
      注意：研究人员必须避免阈值过低，否则会在原始图像中不存在断裂的位置产生人为的肺泡壁断裂，从而导致弦长测量值虚高。
    3. 程序会自动移除孤立像素（即被8个白色像素包围的单个黑色像素）。
    4. em>4.2.4. 观察弹出窗口，提示用户重新设定二值图像的阈值、继续执行宏或取消宏。若需重新设定阈值，请在提示时回答 Y 并点击“OK”按钮。
    5. em>4.2.5. 观察由宏生成的水平和垂直网格窗口，线条间隔为5像素。程序将测量与气腔重叠的水平和垂直线段的长度。
    6. 将文件保存至任意文件夹，但请勿更改默认文件名，否则 Excel 报告宏将无法找到该文件（文件格式为图像名称后附加“CLa.txt”，用于表示气腔弦长）。
      注意：如果程序未进行测量，可能是阈值过低（必须> 1）。若发生此情况，研究人员应使用更高的阈值重新设定图像。
    7. em>4.2.7. 如需进行肺泡面积测量（除弦长外），还需运行额外的 [4] 和 [5] 宏。
    8. em>4.2.8. 继续操作，直至所有图像均完成分析。
  3. 使用 Excel 报告宏分析结果
    1. 打开 Excel Report 20x.xls 文件。根据所使用的 Excel 版本的默认安全设置，必要时手动启用宏。
    2. 在“宏”窗口中查看宏列表（见表1）。
      注意：CL_Air_1 报告单个动物（文件夹）的气腔弦长；CL_Air_Multi 报告多个动物（文件夹）的气腔弦长；AP_No_Edge_1 报告单个动物（文件夹）无边缘接触的肺泡面积；AP_No_Edge_Multi 报告多个动物（文件夹）无边缘接触的肺泡面积；AP_With_Edge_1 报告单个动物（文件夹）有边缘接触的肺泡面积；AP_With_Edge_Multi 报告多个文件夹中具有边缘接触的肺泡面积。
    3. 选择 CL_Air_Multi 宏，以报告对应于多只小鼠图像的多个文件夹的肺泡弦长测量结果。程序将报告所选文件夹中的所有 _CLa.txt 文件。如需排除某个 _CLa.txt 文件，可将其移至当前文件夹的子文件夹中，或重命名其中的 _CLa 部分。
    4. 在文件窗口中，一次选择一个文件夹：先高亮选中文件夹，然后点击“OK”（程序不支持同时多选）。每选中一个文件夹后，可在工作表中查看其数据。选择“取消”或关闭文件窗口以继续操作。
      注意：根据 Excel 版本的不同，研究人员在每次选择一个文件夹后，可能需要返回上一级文件夹目录。
    5. 每个文件夹将生成一个独立的工作表，显示每个 _CLa.txt 文件的统计结果，随后是所有 _CLa.txt 文件合并后的弦长数据统计。
    6. 另有一个名为“All CL”的独立工作表，包含所有工作表的数据总和。
    7. 重命名并保存该电子表格。默认文件名为父文件夹名称后附加 _CLa.xls。在选择另一个宏之前，请先关闭当前工作表。

5. 小气道重塑

  1. 染色与图像采集
    1. 使用商业试剂盒对肺组织切片进行马松三色染色（Masson’s trichrome stain），并遵循制造商提供的说明。
    2. 在显微镜下使用20倍物镜，采集两肺中所有可完整容纳于图像区域内的气道图像（包括气道外侧的蓝色层，即细胞外基质蛋白沉积层）。
      注意：在香烟烟雾暴露小鼠中，较大的气道并不伴随细胞外基质蛋白沉积的增加。
    3. 将彩色图像保存为jpeg格式文件。
  2. 图像分析：在图像分析软件程序中打开图像文件。
    1. 打开并命名日志文件，用于记录测量数据。
    2. 选择线条绘制工具。绘制4条穿过气道管腔（内径）的直线以测量气道大小，并仅将符合目标尺寸的气道纳入分析。接着，在气道周围按钟面数字位置均匀绘制12条等间距的直线，从紧邻气道的外膜层边缘延伸至包围气道的蓝色染色区域边缘，以测量气道外侧沉积的细胞外基质蛋白层厚度（图 5）。避免在气道与其他气道或血管相交的区域进行测量。
    3. 首先在日志文件中记录全部4条内径测量线，然后记录用于测量气道周围蓝色细胞外基质层厚度的12条线。
    4. 关闭当前图像，再打开下一张图像。
    5. 重复上述步骤，直至该实验动物所有图像的数据均记录至同一文件夹中。
    6. 对下一个文件夹（包含下一只动物肺组织切片所采集的图像）从步骤5.2开始重复操作。在完成实验中所有动物肺组织切片内全部气道的分析后，退出程序。
    7. 将每只小鼠每条气道记录的4条内径测量值和12条细胞外基质蛋白层厚度测量值输入Excel电子表格中，并计算每只动物的平均内径和细胞外基质蛋白层厚度。
    8. 将测量值从像素单位转换为微米（µm）。
    9. 根据气道内径大小对气道进行分组（例如，300–399 µm、400–499 µm等），比较空气暴露组与烟雾暴露组小鼠中相似尺寸气道周围的细胞外基质蛋白层厚度（例如，内径为300–899 µm的气道；图 5）。
    10. 如需要，可对肺组织切片进行特定蛋白的免疫染色（包括间质胶原蛋白和基底膜蛋白），并采用类似方法对目标蛋白的沉积情况进行定量分析。

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结果

本方案首先对小鼠进行全身暴露于香烟烟雾（CS）的处理。对设备进行充分的监管和维护，并监测总悬浮颗粒物（TPM）浓度，以确保烟雾暴露的一致性（图1）。研究人员需熟练掌握使用肺膨胀装置进行肺部膨胀的技术

本方案首先对小鼠进行全身体暴露于香烟烟雾（CS）。对设备进行充分的监管和维护，并监测总悬浮颗粒物（TPM）浓度，以确保烟雾暴露的一致性（图1）。研究人员需熟练掌握使用膨胀装置进行肺组织膨胀的技术（图2），并在肺膨胀后仔细取出肺组织，以获得充分膨胀的肺切片，从而准确分析肺泡腔的扩大情况。图3A显示一个膨胀良好的肺组织，而图3B显示一个膨胀不良的肺组织。图3C为准备进行阈值分割步骤的膨胀肺切片图像（肺泡腔内的巨噬细胞被标记为白色，血管和支气管被标记为黑色）。阈值分割步骤生成一幅二值图像，其中肺泡腔内的所有像素为白色，非肺泡区域的所有像素为黑色（图3D）。图3E和图3F分别显示宏程序生成的肺泡垂直和水平弦长。

肺功能检测显示，压力-容积...

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讨论

大多数研究人员使用小鼠来模拟人类慢性阻塞性肺疾病（COPD）中的主要慢性肺部病理变化和异常肺生理特征（如肺泡腔扩大、小气道重塑以及肺顺应性增加）。为了全面评估感兴趣分子在这些慢性疾病过程中的作用，需要在小鼠中建立一种综合性方法，以同时评价这些分子对肺气肿发展和小气道重塑的影响。

本实验方案中有若干关键步骤。首先，在香烟烟雾暴露过程中，必须每周至少清洁一次仪器，因为焦油类物质会在设备中沉积，可能导致烟雾暴露不足，无法有效诱导肺部疾病。  其次，必须充分膨胀肺组织，以准确测量肺泡腔的扩大程度。若在从胸腔取出肺组织时造成肺组织破损，会导致肺叶塌陷，从而低估肺泡腔的大小。因此，为保护肺组织，仅在剪刀尖端可见时才进行剪切操作。第三，为准确分析肺气肿的形成，需使用Gill染色法将肺组织切片的肺泡壁染成深色，并优化图像采集的曝光时间，以确保图像的阈值设定理想，从而生成准确的二值图像用于后续分析。第四，应以随机方式采集图像，以避免观察者偏倚；每只动物至少采集和分析20张图像，以确保对香烟烟雾暴露的C57BL/6 WT小鼠中呈异质性分布的肺泡腔扩大情况进行准确评估。第五，在小气道重塑（SA...

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披露

我们没有需要披露的利益冲突。

致谢

我们谨感谢布里格姆妇女医院的研究员 Francesca Polverino 医生对本文做出的贡献，同时感谢 Monica Yao（理学学士）和 Kate Rydell（理学学士）在小鼠饲养及小鼠香烟烟雾暴露实验中的协助。

本研究工作得到了公共卫生服务署、国家心肺血液研究所基金（资助号：HL111835、HL105339、HL114501）、飞行员工会医学研究基金会（资助号：#CIA123046）、布莱根妇女医院-洛夫莱斯呼吸研究所联盟以及剑桥国家健康研究所生物医学研究中心的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
全身烟雾暴露装置Teague EnterpriseTE-10z用于在小鼠中诱导慢性肺疾病的慢性烟雾暴露
研究用香烟肯塔基大学3R4F 参比香烟
Pallflex® 空气监测滤膜，Emfab 滤膜 TX40HI20WW，25 mmPall Corporation7219用于总颗粒物（TPMs）的测定
25 mm 滤膜夹Pall Corporation
滤膜采样器Intermatic金属 T100
气体流量计AEM气体流量计 G1.6；G2.5；G4
小鼠气管插管（18 号）Labinvention肺功能分析
机械呼吸机ScireqFlexiVent
吉尔苏木精溶液 Sigma-AldrichGSH316用于吉尔染色，操作时需在通风橱中进行
哈里斯改良苏木精溶液Sigma-AldrichHHS16
Cytoseal-60Thermo Scientific8310-16
显微镜载玻片定位标尺Andwin Scientific INC50-949-582用于肺气肿分析
Scion Image 图像分析软件Scion Corporation
Mason 三色染色液Sigma-AldrichHT15用于小气道纤维化的分析
MetaMorph 离线版 7.0Molecular Devices LLC31032

参考文献

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