特定mRNA的稳态水平由其合成速率和降解速率共同决定。通过测定mRNA的半衰期，可测量全基因组范围内的mRNA降解速率或特定mRNA的降解速率。本方案重点介绍在Saccharomyces cerevisiae中测定mRNA降解速率的方法。
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摘要
摘要
mRNA 的稳态水平随环境条件的变化而变化。对 mRNA 稳态积累水平的调控可确保在特定生长条件下合成适量的蛋白质。测量 mRNA 降解速率的一种方法是抑制转录，随后监测已存在 mRNA 的消失过程。随后可对 mRNA 的降解速率进行定量，并利用多种技术确定其准确的半衰期。在 S. cerevisiae 中，已有用于测量 mRNA 半衰期的实验方案，其中包括使用携带 RNA 聚合酶 II 温度敏感等位基因 rpb1-1 的菌株来抑制 mRNA 的转录。其他测量 mRNA 半衰期的技术包括使用转录抑制剂（如硫鲁霉素或 1,10-菲咯啉）抑制转录，或利用受可调控启动子控制的 mRNA，例如半乳糖诱导型启动子和 TET-off 系统。本文中，我们描述了使用 RNA 聚合酶 II 温度敏感等位基因来测量 S. cerevisiae 中 mRNA 降解速率的方法。该技术可用于测量单个 mRNA 或全基因组范围内的 mRNA 降解速率。
引言
特定mRNA的转录与降解是基因表达的关键决定因素。特定mRNA的合成速率和降解速率决定了该mRNA的稳态水平。mRNA的稳态水平控制着mRNA的丰度，并决定了可用于蛋白质合成的每种mRNA的数量。mRNA半衰期的测定被广泛用于确定mRNA的降解速率。不同的特定mRNA以不同的速率降解，这些速率与mRNA的结构特征、其所编码蛋白质的功能以及环境条件相关。根据测定mRNA降解速率所使用的技术，降解速率的测量可以是全基因组范围的，也可以针对单个转录本进行。在酵母S. cerevisiae中，最常用于测量全基因组mRNA降解速率的技术包括使用携带RNA聚合酶II温度敏感等位基因的酵母菌株，以及化学转录抑制剂，如硫链丝菌素（thiolutin）和1,10-邻菲啰啉（1,10-phenanthroline）1-5。这些方法也可用于测量单个mRNA的降解速率4。此外，还有其他方法可用于测定mRNA降解速率，包括稳态接近标记法，或利用仅在特定条件下由可调控启动子表达的mRNA分子。每种技术都有其特定的优势和局限性。本文所描述的技术利用了RNA聚合酶II的温度敏感等位基因。该方法以S. cerevisiae为模型，但也可通过采用特定的转录抑制技术，在其他系统中进行修改和应用6。
利用RNA聚合酶II的温度敏感型等位基因测量mRNA半衰期的方法，已被广泛用于全基因组范围及单个mRNA降解的测定<....
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方案
1. 酵母细胞的培养
- 选择适用于mRNA降解速率测定的适当酵母菌株。若需利用RNA聚合酶II的温度敏感等位基因来抑制转录，请使用携带rpb1-1突变的酵母菌株1。可从已有该菌株的实验室获取，或在需要特定遗传背景时，采用标准技术在实验室中自行构建9。
- 采用无菌操作技术，按照标准流程制备酵母培养基10。若无需筛选压力，可制备YPD等丰富培养基；若酵母细胞已转化质粒且需要筛选，则应制备相应的选择性培养基。培养基需经高压灭菌处理。
- 在28 °C下培养酵母细胞，此温度为该菌株的允许温度。培养分两步进行：
- 第一天过夜培养：在5 ml培养基中将酵母细胞培养至饱和状态。
- 在第二天结束前开始第二次过夜培养。取第一次过夜培养的不同量酵母细胞，接种至100至150 ml新鲜培养基中（接种量可为100 µl至1 ml、2 ml或更多，具体取决于次日收获细胞的时间）。此步骤旨在确保至少一个培养物在次日达到合适的OD600值。
2. 收获酵母细胞
- 准备收集酵母细胞。此步骤的时间至关重要；请提前标记所有所需离心管，并将所有必需的设备和材料集中放置。将水浴锅预热至 39 °C，并将两支 15 ml 的培养基分别预热至 28 °C ....
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结果
本实验方案准确测定mRNA降解速率的能力依赖于转录抑制、在适当的时间点收集酵母细胞，以及在RNA提取和RNA印迹过程中采用无RNase的技术。通过检测两种已知分别具有不稳定性和稳定性的对照mRNA，可确认实验成功。例如，可使用能够同时检测CYH2前体mRNA和成熟mRNA的探针来实现这一目的。图2B展示了在转录抑制后不同时间点，野生型和无义介导的mRNA降解（nmd）突变型酵母菌株中CYH2前体mRNA的消失情况。与NMD通路失活（upf1）的酵母细胞相比，具有功能性NMD通路（UPF1）的酵母细胞中CYH2前体mRNA的降解速度更快。
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讨论
抑制mRNA合成并在无新合成的情况下监测mRNA的周转，是常用于测定mRNA降解速率的方法。在S. cerevisiae中，通过使用RNA聚合酶II的温度敏感等位基因来抑制转录，从而测定mRNA降解速率，是目前最常用的方法之一。该方法可特异性抑制RNA聚合酶II。利用此技术测定mRNA降解速率时最关键的步骤包括：1）在收集酵母细胞之前，确保将培养物维持在39°C，以完全关闭转录；2）在RNA提取和RNA凝胶电泳步骤中，必须采用无RNase的操作技术；3）使用对照RNA进行归一化处理，以确保上样RNA量相等，并验证实验处理按预期发挥作用；4）至少重复三次mRNA降解速率的测定，以确保半衰期测量结果的可重复性和准确性。
rpb1-1 酵母菌株通常被转移至 37 °C 以抑制转录。然而，我们发现，在 37 °C 条件下，转录抑制在温度变化后约 3 分钟才发生。而在 39 °C 时，转录抑制可立即实现4, 11。然而，利用该技术测定 mRNA 降解速率存在一些局限性。主要局限在于需要使用一种特殊的酵母菌株。如前所述，该酵母菌株可从其.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
作者实验室的研究由德克萨斯州高等教育协调委员会的诺曼·哈克曼高级研究计划以及贝勒大学的启动资金资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 高速离心机 | Eppendorf | 22628169 | |
| 小型离心机 | Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| Genescreen Plus 杂交膜 | PerkinElmer | 50-905-0169 | |
| 杂交炉 | Fisher Scientific | 95-0030-01 | |
| Nanodrop 分光光度计 | Thermo Scientific | ND-8000 | |
| 磷屏 | GE Healthcare Life Sciences | 28-9564-78 | |
| Typhoon 磷酸成像仪 | GE Healthcare Life Sciences | 29004080 | |
| UV 交联仪 | GE Healthcare Life Sciences | 80-6222-31 | 也可将膜置于设定为 80° 的烘箱中烘烤 1 小时 |
| NorthernMax 预杂交/杂交缓冲液 | Life Technologies | AM8677 | |
| 携带 rpb1-1 突变的酵母菌株 | 酵母菌株可从实验室获取，或通过特定遗传背景构建 |
参考文献
- Nonet, M., Scafe, C., Sexton, J., Young, R. Eukaryotic RNA polymerase conditional mutant that rapidly ceases mRNA synthesis. Mol. Cell. Biol. 7, 1602-1616 (1987).
- Santiago, T. C., Purvis, I. J., Bethany, A. J., Brown, A. J. The relationship between mRN....
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重印与许可
