特定mRNA的稳态水平由其合成速率和降解速率共同决定。通过测定mRNA的半衰期，可测量全基因组范围内的mRNA降解速率或特定mRNA的降解速率。本方案重点介绍在Saccharomyces cerevisiae中测定mRNA降解速率的方法。
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摘要
摘要
mRNA 的稳态水平随环境条件的变化而变化。对 mRNA 稳态积累水平的调控可确保在特定生长条件下合成适量的蛋白质。测量 mRNA 降解速率的一种方法是抑制转录，随后监测已存在 mRNA 的消失过程。随后可对 mRNA 的降解速率进行定量，并利用多种技术确定其准确的半衰期。在 S. cerevisiae 中，已有用于测量 mRNA 半衰期的实验方案，其中包括使用携带 RNA 聚合酶 II 温度敏感等位基因 rpb1-1 的菌株来抑制 mRNA 的转录。其他测量 mRNA 半衰期的技术包括使用转录抑制剂（如硫鲁霉素或 1,10-菲咯啉）抑制转录，或利用受可调控启动子控制的 mRNA，例如半乳糖诱导型启动子和 TET-off 系统。本文中，我们描述了使用 RNA 聚合酶 II 温度敏感等位基因来测量 S. cerevisiae 中 mRNA 降解速率的方法。该技术可用于测量单个 mRNA 或全基因组范围内的 mRNA 降解速率。
引言
特定mRNA的转录与降解是基因表达的关键决定因素。特定mRNA的合成速率和降解速率决定了该mRNA的稳态水平。mRNA的稳态水平控制着mRNA的丰度，并决定了可用于蛋白质合成的每种mRNA的数量。mRNA半衰期的测定被广泛用于确定mRNA的降解速率。不同的特定mRNA以不同的速率降解，这些速率与mRNA的结构特征、其所编码蛋白质的功能以及环境条件相关。根据测定mRNA降解速率所使用的技术，降解速率的测量可以是全基因组范围的，也可以针对单个转录本进行。在酵母S. cerevisiae中，最常用于测量全基因组mRNA降解速率的技术包括使用携带RNA聚合酶II温度敏感等位基因的酵母菌株，以及化学转录抑制剂，如硫链丝菌素（thiolutin）和1,10-邻菲啰啉（1,10-phenanthroline）1-5。这些方法也可用于测量单个mRNA的降解速率4。此外，还有其他方法可用于测定mRNA降解速率，包括稳态接近标记法，或利用仅在特定条件下由可调控启动子表达的mRNA分子。每种技术都有其特定的优势和局限性。本文所描述的技术利用了RNA聚合酶II的温度敏感等位基因。该方法以S. cerevisiae为模型，但也可通过采用特定的转录抑制技术，在其他系统中进行修改和应用6。
利用RNA聚合酶II的温度敏感型等位基因测量mRNA半衰期的方法，已被广泛用于全基因组范围及单个mRNA降解的测定4-5。该技术需要使用一种携带RNA聚合酶II温度敏感型等位基因rpb1-11的特定酵母菌株。该方法的原理是，将温度敏感型酵母菌株暴露于非允许温度下，可抑制mRNA的合成；随后，在转录被抑制后的不同时间点监测已存在的mRNA的降解情况。通过在转录关闭后不同时间点提取酵母细胞中的RNA，来监测原有mRNA的减少情况。酵母细胞的收获时间点需通过预实验预先确定，具体取决于所研究的转录本和实验体系。对于寿命较短的转录本采用较短的时间间隔，而对于寿命较长的转录本则采用较长的时间间隔。随后，可通过Northern印迹分析、定量PCR或RNA测序来监测mRNA的降解过程。
利用RNA聚合酶II的温度敏感等位基因来测量mRNA半衰期具有若干优势。首先，该技术操作简便、直接。其次，一旦获得或构建出相应的酵母菌株，便可在不同培养条件下测定mRNA的半衰期，从而评估环境因素对mRNA降解的影响。第三，该方法可实现全基因组范围内的mRNA降解速率监测。其他转录抑制技术也各有优缺点。例如，使用诱导型启动子需要进行亚克隆操作，以使目标mRNA处于可调控启动子的控制之下。硫链丝菌素（thiolutin）不易获得，且价格昂贵。此外，硫链丝菌素的作用机制尚未完全明确，已有报道指出其可能影响其他细胞过程，包括抑制mRNA降解7。相比之下，1,10-菲啰啉（1,10-phenanthroline）更容易获取。然而，所有用于抑制转录的技术均可能干扰细胞正常功能，并对不同的mRNA产生各异的影响。研究者需根据具体的实验条件选择最合适的方法，以获得最可靠的结果。为了确定哪种方法最适合特定研究应用，研究人员需要明确所研究转录本及其编码蛋白的功能。最可靠的mRNA降解速率数据是通过多种技术测定并得到一致结果的数据。没有一种单一技术在所有情况下都是最优的，最合适的技术选择取决于具体的研究情境。
已有大量研究在不同条件和遗传背景下测定了 S. cerevisiae 中的 mRNA 降解速率。mRNA 降解速率的测定条件取决于具体研究的实验设计。在不同细胞环境中测定 mRNA 降解速率，可判断所研究的条件是否优先影响特定 mRNA 的降解速率。mRNA 的降解速率还可能因所使用的酵母菌株不同而有所差异。例如，可在野生型酵母细胞以及无功能的无义介导的 mRNA 降解（NMD）通路的酵母细胞中测定 mRNA 降解速率。该 mRNA 降解通路迄今在所有已研究的真核生物中均被发现，其功能是触发提前终止翻译的 mRNA 的降解8。NMD 最初被鉴定为降解含有提前终止密码子或无义密码子的 mRNA 的通路，但现在已认识到该通路还调控不含无义突变的天然 mRNA 的表达。该通路的靶标 mRNA 在具有功能性 NMD 通路的酵母细胞中会迅速降解，而在 NMD 通路无功能的酵母细胞中则趋于稳定。因此，作为该通路直接靶标的 mRNA 在野生型酵母细胞中的半衰期比在 NMD 通路无功能的酵母细胞中更短。
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方案
1. 酵母细胞的培养
- 选择适用于mRNA降解速率测定的适当酵母菌株。若需利用RNA聚合酶II的温度敏感等位基因来抑制转录，请使用携带rpb1-1突变的酵母菌株1。可从已有该菌株的实验室获取，或在需要特定遗传背景时，采用标准技术在实验室中自行构建9。
- 采用无菌操作技术，按照标准流程制备酵母培养基10。若无需筛选压力，可制备YPD等丰富培养基；若酵母细胞已转化质粒且需要筛选，则应制备相应的选择性培养基。培养基需经高压灭菌处理。
- 在28 °C下培养酵母细胞，此温度为该菌株的允许温度。培养分两步进行：
- 第一天过夜培养：在5 ml培养基中将酵母细胞培养至饱和状态。
- 在第二天结束前开始第二次过夜培养。取第一次过夜培养的不同量酵母细胞，接种至100至150 ml新鲜培养基中（接种量可为100 µl至1 ml、2 ml或更多，具体取决于次日收获细胞的时间）。此步骤旨在确保至少一个培养物在次日达到合适的OD600值。
2. 收获酵母细胞
- 准备收集酵母细胞。此步骤的时间至关重要；请提前标记所有所需离心管，并将所有必需的设备和材料集中放置。将水浴锅预热至 39 °C，并将两支 15 ml 的培养基分别预热至 28 °C 和 60 °C。
注意：15 ml 培养基的体积可根据需要收集细胞的时间点数量进行调整。 - 当酵母细胞的 OD600 达到 0.4 至 0.7 时，开始收集细胞。将细胞转移至 4–6 个无菌的 50 ml 螺口瓶中，在室温下使用高速离心机以 7,500 × g 离心 5 分钟。
- 弃去上清液，并将沉淀重悬于已在 28 °C 平衡的 15 ml 培养基中。将酵母细胞合并至一个无菌的 250 ml 三角瓶中，并在 28 °C 培养温度下平衡约 5 分钟。
- 酵母细胞在培养温度下平衡后，立即加入已在 60 °C 平衡的 15 ml 培养基，使温度升至 39 °C（非允许温度），并立即将三角瓶放入 39 °C 水浴锅中。确保在后续的细胞收集步骤中，培养基始终处于 39 °C 水浴中，以保证转录被关闭。
- 在将三角瓶放入 39 °C 水浴后，在不同时间点收集细胞。第一个时间点为将三角瓶放入 39 °C 水浴后立即取样。取 3 ml 样品，分装至两个 1.5 ml 微量离心管中。使用小型离心机或掌上离心机以快速减速模式离心 10 秒，收集细胞沉淀，并倒掉上清液。
- 立即用干冰/乙醇浴或液氮将沉淀快速冷冻。将首次收集细胞的时间点定义为零时间点。
- 后续细胞收集的时间点应通过预实验根据目标 mRNA 的特性确定。通常情况下，在以下时间点收集酵母细胞：0、3、6、9、12、18、25 和 35 分钟（图 2B）。若使用上述时间点无法确定 mRNA 半衰期，可对时间点进行调整。例如，对于预期半衰期较短的 mRNA，可采用更短的时间点（即 0、1、2、3、4、6、9、12 和 18 分钟）；对于预期半衰期较长的 mRNA，则可延长取样时间点。
- 细胞收集完成后，将其储存于 -80 °C 超低温冰箱中，直至进行 RNA 提取。
3. 从酵母细胞中提取RNA
- 在本实验方案的RNA提取部分，应采用无RNase的技术，以防止RNA被RNase降解。配制并准备用于RNA提取的无RNase溶液、玻璃器皿和塑料器皿。
- 根据标准操作流程从酵母细胞中提取RNA。通常使用热酚法12。也可选用适用于从酵母细胞中提取RNA的商用试剂盒。
- 测定RNA的含量和纯度，通常使用Nanodrop测定2 µl RNA在A260和A280处的吸光度。根据A260值确定RNA浓度，并根据该浓度使用DEPC处理水将RNA稀释至1 µg/µl。
注意：A260/A280比值可反映RNA的纯度。若A260/A280比值为2.0 ± 0.1，则表明RNA样品较为纯净。
4. Northern 印迹分析
注意：使用Northern印迹法来定量mRNA水平，并获取有关转录本大小的信息。此外，可使用Northern印迹法检测产生同一mRNA多种异构体的mRNA。
- 制备1.0%琼脂糖-甲醛凝胶。根据标准实验方案12，通过电泳在琼脂糖甲醛凝胶上加载等量的样品RNA。在RNA样品旁同时运行RNA Marker，并利用其确定Northern印迹中检测到的RNA片段大小。在将琼脂糖甲醛凝胶上分离的RNA转移至膜之前，从凝胶上切下含有RNA Marker的泳道，并用溴化乙锭进行可视化检测。
注：也可在RNA转移前对整个凝胶使用溴化乙锭染色。 - 当RNA样品在凝胶中迁移至适当距离后，采用无RNase的技术将RNA转移至膜上。可选用多种已有的RNA转膜方法之一12-13。进行转膜时，将膜裁剪至与凝胶大致相同的尺寸，并根据标准操作流程12完成RNA转移。
- 按照制造商说明，使用紫外交联仪将RNA通过紫外线交联固定在膜上。或者，将膜置于80 °C烘箱中烘烤1小时。此后可将膜长期保存于塑料袋中，置于-20 °C，直至与特异性探针进行杂交。
注：干燥的膜也可在室温下夹于滤纸之间保存。
5. 将与目标 RNA 互补的探针杂交至膜上
注意：检测膜上 mRNA 的一种方法是杂交 32P 标记的 DNA 探针。警告：使用 32P 的研究人员需要采取防护措施以防止污染。请遵循机构关于放射性物质使用的指导方针。
- 根据标准方案12，通过标记25–50 ng待与膜杂交的DNA来制备DNA探针。通过PCR或质粒酶切生成DNA片段。在去除未掺入的核苷酸后，通过计数1 µl放射性标记的DNA探针来测定DNA探针的比活性12。
- 将预杂交/杂交缓冲液预热至42 °C。每100 cm2膜使用约10 ml预杂交/杂交缓冲液12。
- 在杂交炉中，以每毫升杂交缓冲液含1–5 × 106 cpm的放射性标记DNA探针与膜过夜（O/N）杂交，以检测目标mRNA12。确保杂交过程中杂交炉的旋转方向能使整个膜充分接触杂交液，以保证杂交充分。
- 室温下用50 ml 2×SSPE溶液洗涤膜两次，每次15分钟，再于65 °C用50 ml 2×SSPE/2% SDS溶液洗涤一次，持续15分钟12。将膜用保鲜膜包裹，防止其干燥或污染磷屏。
- 使用盖革计数器估算膜上放射性强度。
注意：此估算可确保膜在磷屏上的曝光时间适当。对于放射性较低的膜，应使用更长的曝光时间。 - 对于Northern印迹，使用上样对照以确认每个点上样了等量的RNA。为此，将膜剥离后重新用一段不受所研究过程影响的RNA探针进行杂交。将膜置于含有200 ml煮沸剥离液（0.1% SDS/0.01×SSC）的玻璃托盘中处理2分钟以剥离探针，倒出剥离液并重复该步骤五次12。
注意：SCR1是一种常用的上样对照RNA。SCR1是RNA聚合酶III的转录本，具有稳定且丰度高的特点。在短时间RNA聚合酶II抑制过程中，SCR1 RNA的丰度不应发生显著变化。
6. 定量结合到膜上的 RNA
注意：为了量化膜上的放射性量，将膜暴露于磷屏上。在适当的曝光时间后，使用磷屏成像仪扫描磷屏。
- 根据磷屏成像仪制造商提供的说明扫描磷屏。
- 定量各时间点的 mRNA。使用 ImageQuant 软件或相关软件定量 mRNA 水平。将每个时间点的 mRNA 量标准化至上样对照。如果使用 SCR1 作为上样对照，则将半衰期 Northern 杂交结果标准化至 SCR1。
- mRNA 半衰期的计算方法是：将每个时间点残留的 mRNA 量除以 0 时间点（初始时间点）的 mRNA 量。以剩余 mRNA 百分比对时间作半对数图（图 2C）。按以下公式计算 mRNA 半衰期：
t1/2 = -0.693/k （负 0.693） - k 为最佳拟合直线的斜率，t1/2 为 mRNA 半衰期。
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结果
本实验方案准确测定mRNA降解速率的能力依赖于转录抑制、在适当的时间点收集酵母细胞，以及在RNA提取和RNA印迹过程中采用无RNase的技术。通过检测两种已知分别具有不稳定性和稳定性的对照mRNA，可确认实验成功。例如，可使用能够同时检测CYH2前体mRNA和成熟mRNA的探针来实现这一目的。图2B展示了在转录抑制后不同时间点，野生型和无义介导的mRNA降解（nmd）突变型酵母菌株中CYH2前体mRNA的消失情况。与NMD通路失活（upf1）的酵母细胞相比，具有功能性NMD通路（UPF1）的酵母细胞中CYH2前体mRNA的降解速度更快。
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讨论
抑制mRNA合成并在无新合成的情况下监测mRNA的周转，是常用于测定mRNA降解速率的方法。在S. cerevisiae中，通过使用RNA聚合酶II的温度敏感等位基因来抑制转录，从而测定mRNA降解速率，是目前最常用的方法之一。该方法可特异性抑制RNA聚合酶II。利用此技术测定mRNA降解速率时最关键的步骤包括：1）在收集酵母细胞之前，确保将培养物维持在39°C，以完全关闭转录；2）在RNA提取和RNA凝胶电泳步骤中，必须采用无RNase的操作技术；3）使用对照RNA进行归一化处理，以确保上样RNA量相等，并验证实验处理按预期发挥作用；4）至少重复三次mRNA降解速率的测定，以确保半衰期测量结果的可重复性和准确性。
rpb1-1 酵母菌株通常被转移至 37 °C 以抑制转录。然而，我们发现，在 37 °C 条件下，转录抑制在温度变化后约 3 分钟才发生。而在 39 °C 时，转录抑制可立即实现4, 11。然而，利用该技术测定 mRNA 降解速率存在一些局限性。主要局限在于需要使用一种特殊的酵母菌株。如前所述，该酵母菌株可从其...
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
作者实验室的研究由德克萨斯州高等教育协调委员会的诺曼·哈克曼高级研究计划以及贝勒大学的启动资金资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 高速离心机 | Eppendorf | 22628169 | |
| 小型离心机 | Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| Genescreen Plus 杂交膜 | PerkinElmer | 50-905-0169 | |
| 杂交炉 | Fisher Scientific | 95-0030-01 | |
| Nanodrop 分光光度计 | Thermo Scientific | ND-8000 | |
| 磷屏 | GE Healthcare Life Sciences | 28-9564-78 | |
| Typhoon 磷酸成像仪 | GE Healthcare Life Sciences | 29004080 | |
| UV 交联仪 | GE Healthcare Life Sciences | 80-6222-31 | 也可将膜置于设定为 80° 的烘箱中烘烤 1 小时 |
| NorthernMax 预杂交/杂交缓冲液 | Life Technologies | AM8677 | |
| 携带 rpb1-1 突变的酵母菌株 | 酵母菌株可从实验室获取，或通过特定遗传背景构建 |
参考文献
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重印与许可
