冷冻电镜技术的注意事项：大分子三维重构的样品制备与高质量数据采集入门指南

摘要

本文介绍了冷冻电子显微镜技术，该方法可用于获得大分子在接近天然状态下的高质量显微图像。该技术所获得的图像适用于后续基于单颗粒分析方法的计算机处理，以实现大分子的三维结构重建。

摘要

冷冻电子显微镜技术（cryoEM）包括在支撑膜上快速冷冻样品的薄层，然后通过透射电子显微镜（TEM）在冷冻水合状态下观察样品。该方法仅需极少量蛋白质，可在任意选择的缓冲液中进行，且无需使用任何染色剂，因此非常适用于研究大分子的结构与功能关系。当结合单颗粒图像处理技术时，该方法已广泛应用于纯化大分子的三维结构解析。

本文介绍的实验方案详细说明了如何进行冷冻电镜（cryoEM）操作，并分析了最常遇到问题的原因，以便进行合理的故障排除；遵循所有这些步骤应能获得高质量的冷冻电镜图像。该技术需要使用电子显微镜和玻璃化冷冻设备。此外，进行计算机图像处理还需要掌握三维重构的相关概念和软件知识。尤为重要的是，高质量的结果依赖于找到合适的纯化条件，以获得结构完整且均一的生物大分子群体。

冷冻电镜（cryoEM）可视化大分子的能力，结合单颗粒图像处理技术的灵活性，在近天然状态下大蛋白质和大分子机器的结构解析、通过三维差异图谱鉴定其多个组分，以及通过对接X射线结构构建伪原子模型等方面已取得巨大成功。过去30年来，冷冻电镜仪器和图像处理技术的持续发展，使得从头（de novo）生成原子分辨率水平的三维重构成为可能。

引言

冷冻电镜（cryoEM）的目标是获得大分子在天然水合状态下的电子显微镜图像。通过将大分子包埋于玻璃态冰中，可将冷冻水合样品直接引入透射电子显微镜（TEM）进行观察。玻璃态的形成依赖于快速冷冻（10,000 ^oC/秒），该过程避免了水的结晶化，确保样品在冷冻过程中分子结构的重排可忽略不计。样品相对于周围缓冲液具有更高的电子散射能力，从而在无需任何染色的情况下提供虽小但足够的对比度以观察大分子¹。随后可通过计算机图像处理技术重建大分子的三维结构。分子量在约500 kDa至多MDa范围内的大分子是冷冻电镜的理想样品（占电子显微镜数据库（EMDB）条目的80%以上）；这些包括蛋白质、蛋白质复合物、蛋白质-核酸复合物以及嵌入双层膜中的膜蛋白。这些大分子难以形成晶体（在PDB数据库中结晶条目不足2%），但通常可将X射线晶体学或核磁共振（NMR）解析的小片段结构拟合到冷冻电镜获得的三维轮廓中。另一方面，一些通过冷冻电镜解析的最大结构可在完整细胞中通过超薄切片透射电镜观察到²。因此，冷冻电镜有效填补了亚细胞结构与原子结构之间在尺寸和分辨率上的空白。

与更经典的负染色法（NS）相比，冷冻电镜（CryoEM）能更好地反映大分子的天然结构。在负染色法中，大分子会脱水，并被一层重金属染料包围，染料无法进入的区域形成强烈反差的“负”像³。在这两种方法中，电子束都会产生大分子的二维投影图像，称为颗粒（particles），其形状取决于大分子相对于电子束的方向。通过计算机使用“单颗粒分析”（SPA）软件可对大量颗粒（至少约1,000个，无上限）进行分析，通过平均化提高信噪比（SNR），并确定用于通过反投影重建大分子三维结构所需的空间取向参数^4-7。由于负染色法具有较高的信噪比，常用于样品的初步表征，并用于生成从头（de novo）三维重构模型；但其分辨率很少超过20 Å，受限于脱水过程以及重金属颗粒的尺寸。通常，在进行冷冻电镜三维结构测定时，首先通过负染色法获得一个低分辨率的三维重构模型，然后利用冷冻电镜对该低分辨率初始模型进行优化，以进一步研究大分子在天然水合状态下的结构，观察其内部构造，并提高分辨率。需要注意的是，如果负染色模型存在畸变（最常见的例子是脱水导致的压扁⁸），且冷冻电镜颗粒的信噪比较低，则该畸变可能带入冷冻电镜模型中（即模型偏差伪影，这在低信噪比数据集中较为常见⁹）。结构畸变将导致负染色与冷冻电镜原始颗粒之间，以及原始冷冻电镜颗粒与其三维模型在垂直于压扁方向上的投影之间出现不匹配。随着三维模型经历连续的优化循环，模型偏差可能自行消除。若未发生此情况（可通过检测原始冷冻电镜颗粒与三维模型对应投影之间缺乏一致性来发现），则应基于冷冻电镜数据构建一个新的从头模型。一种有效的方法是使用角重构算法¹⁰，该算法可能生成多个可能的三维体积，然后利用负染色三维模型选择最合适的冷冻电镜模型，再进一步优化¹¹。更优的策略是提高冷冻电镜数据集的信噪比（见讨论部分的专门章节）。

纯化大分子的生化质量对最终结果具有至关重要的影响。从组织中纯化或在异源系统中表达的大分子应具有高度纯度，并保持结构完整。它既不应形成聚集体，也不应发生解聚。为了确定特定的构象，制备条件应促进形成均一的构象状态。在研究复合物时，其解离常数（k_D）最好处于纳摩尔（nM）范围；否则，已成功使用固定剂来稳定亲和力较低的相互作用^12,13。

未经处理的冷冻电镜图像可提供大分子尺寸、总体轮廓、聚集/多聚状态、均一性以及内部结构等方面的宝贵信息。然而，通过图像处理可极大提升该技术的潜力。三维结构能够揭示大分子的整体构架、配体和亚基的三维位置、构象变化，并可实现由X射线晶体学或核磁共振确定的原子结构的对接。三维重构所包含的信息量随分辨率的提高而逐步增加：通常在15–20 Å分辨率下可明确对接原子结构，在9–10 Å下α螺旋可见为杆状结构，在5 Å下可分辨β折叠，而在3.5 Å或更高分辨率下则可构建原子模型¹⁴。

利用单颗粒分析（SPA）技术，仅需相对少量的样品即可获得具有信息量的图像和三维重构，这使得冷冻电镜（cryoEM）成为一种极具吸引力的技术，因为制备一盘透射电镜（TEM）样品仅需至少0.05 mg/ml的样品溶液3–5 µl。进行冷冻电镜实验所需的最低仪器配置包括：自制或商用的冷冻制样仪（cryo-plunger）、具备超高真空系统的电子显微镜、图像记录介质和低剂量成像套件、配备抽气站的冷冻样品台、辉光放电仪以及蒸发仪。在透射电镜上，非必需但更理想的配置还包括CCD相机（现代透射电镜均配备）或直接电子探测器、场发射电子枪（FEG）、能量过滤装置以及高通量数据采集软件。原则上，此类软件可在一次冷冻电镜实验中采集数万个颗粒图像¹⁵，但需同时考虑由此增加的数据存储需求以及后续人工监督的后处理时间。场发射电子枪结合对比传递函数（CTF）校正，是实现足以分辨α螺旋结构的三维重构分辨率的主要技术基础。然而，该分辨率水平也依赖于样品本身的性质：对于膜蛋白而言，达到10 Å分辨率的情况较为少见；而若样品具有高度对称性，则更有可能实现原子级分辨率。近年来直接电子探测器的发展，使得即使对于对称性较低（如4重对称）或无对称性的大分子复合物，也能达到原子级分辨率，其冷冻电镜电子密度图的质量可与X射线衍射数据解析的结果相媲美^16,17。

本文提供了四个重要大分子类型的实例，以说明该技术的能力，这些大分子的结构解析持续依赖冷冻电镜（cryoEM）发挥主导作用。（i）具有二十面体对称性的病毒，其数据集可因此对称性增强60倍，且其较大的尺寸有利于实现精确且可重复的图像对齐，目前已有多种二十面体病毒通过cryoEM结合单颗粒分析（SPA）方法解析至近原子分辨率¹⁸。我们展示了一类二十面体病毒——腺相关病毒（AAVs）的实例，其近原子分辨率结构已通过cryoEM以及cryoEM/X射线联合方法获得^19,20。（ii）具有螺旋结构的大分子包括微管、丝状结构及某些病毒。其沿螺旋轴重复的结构单元可通过适用于螺旋几何构型的改进版单颗粒分析方法进行解析²¹。在本例中，我们展示了烟草花叶病毒（TMV），这是一种RNA病毒，其结构已通过cryoEM解析至原子分辨率²²。（iii）可溶性大分子蛋白已被广泛研究。其中，形成对称多聚圆柱结构的分子是一类常见的构型，常可达到亚纳米分辨率的结构解析^23,24。此处我们展示了匙孔血蓝蛋白（KLH）的图像，这是一种无脊椎动物的氧运输蛋白，其分子模型通过cryoEM与X射线晶体学联合方法构建²⁵。（iv）膜蛋白是一类重要的蛋白质，约占人类基因组编码蛋白的三分之一，但由于跨膜结构域稳定性的复杂性，其结构表征极为困难²⁶，因此通过所有结构生物学技术解析的膜蛋白结构总数尚不足1.5%。cryoEM与三维重构技术在膜蛋白结构解析中的作用可通过兰诺定受体（RyR）体现，RyR是一种大型真核细胞内Ca²⁺通道，在肌肉收缩和脑部信号传导中具有重要作用。迄今为止分辨率最高的cryoEM结构（达10 Å）已可揭示其二级结构特征²⁷。

方案

1. 冷冻样品杆的准备与维护

注意：干式泵站由涡轮泵站和一个或多个冷台控制器组成，主要用于以下三个目的：a) 在不使用冷冻样品杆时，可将其安全存放于该泵站内。正确的存放方法是将样品杆在真空条件下保留在泵站中。b) 当从杜瓦瓶中移除液氮并暴露冷冻样品杆尖端时，会形成霜和湿气积累，可通过升温循环将其蒸发去除。c) 用于再生沸石干燥剂，并在冷冻样品杆杜瓦瓶中获得高真空环境。这对于进行冷冻电子显微镜实验时维持恒定温度至关重要。

1. 预热循环。
   1. 将冷冻样品杆插入抽气站的其中一个抽气接口中。将一条抽气管连接到样品杆真空阀下方的金属出口处。确保抽气站上的所有阀门（V1、V2 和 V3）以及冷冻样品杆上的阀门均处于关闭状态。
   2. 打开冷台控制器，并通过控制线将其与样品杆连接。打开涡轮分子泵抽气站的电源开关。
   3. 在冷台控制器中启动“预热循环”选项。当涡轮分子泵抽气站的真空度达到 10^-3 Torr 或更优时，打开蝶形阀 V2，待真空度稳定后，再打开蝶形阀 V1。
   4. 运行预热循环约 30 分钟，直至样品杆温度稳定在 20 °C 以上。关闭 V1，然后停止循环。
2. 分子筛循环。在进行冷冻电镜实验前 4 小时至过夜期间执行一次分子筛循环；若设备未使用，则每周执行一次。
   1. 启动“分子筛循环”选项，并选择适当的时间以获得良好的真空度，目标范围为 1-2 × 10^-4 Torr，从而实现较长的保真空时间。当真空度达到 10^-3 Torr 时，打开杜瓦抽气阀 V3，抽气站将对通向样品杆的管路进行抽真空；等待真空度稳定。
   2. 打开冷冻样品杆上的阀门。循环完成后，按与开启时相反的顺序关闭阀门：先关闭样品杆上的阀门，然后依次关闭 V3、V2，最后关闭 V1。关闭涡轮分子泵抽气站和冷台控制器，并将冷冻样品杆从冷台控制器和涡轮分子泵抽气站上断开。

2. 网格制备

1. 清洗。
   注意：使用商用带孔载网时，建议在使用前进行清洗，以去除制造过程中残留的聚合物。请在玻璃培养皿底部铺上五层滤纸后进行此操作。
   1. 将载网放置在滤纸上，使带孔碳膜的一面朝上。
   2. 使用玻璃巴斯德吸管，在载网周围滴加数滴氯仿润湿滤纸，直至载网刚刚开始漂浮。
   3. 将培养皿盖上盖子并略微打开，置于通风橱中过夜（O/N）。
2. 注意：薄碳支持膜（步骤2.2–2.3）可省略，因为冰层可直接在带孔碳载网的小孔上形成。
   1. 使用镊子劈开一片云母，暴露出两个新表面。将新暴露的云母表面朝上放置在培养皿内的白色纸片上。
   2. 将培养皿放入碳蒸发仪的钟罩内。启动抽气程序，直至真空度低于 2 × 10^-6 Torr。为蒸发碳棒表面的杂质，在培养皿被覆盖的情况下进行预蒸发。然后向钟罩内通入空气，并移除培养皿的覆盖物。
   3. 再次执行抽气程序，使真空度低于 10^-6 Torr，随后在云母表面镀上一层薄碳（约 5 nm）。碳蒸发过程中需佩戴眼部防护装置。通过观察放置在云母片下方纸张上颜色变深的程度，来监测碳膜的厚度。
3. 将薄碳膜转移至透射电镜载网。
   1. 裁剪一块 0.5 × 1 cm 的镀碳云母片，将其碳膜漂浮于过滤去离子水的平整水面上。使用光学镜头纸获得平整的水面。用镊子夹起载网，使带孔碳膜面接触漂浮碳层的上表面，并将其拾取。
   2. 重复步骤 2.3.1 和 2.3.2，直至制备出足够数量的载网。
4. 辉光放电。
   注意：辉光放电可将载网天然疏水的碳涂层转变为亲水性。此步骤为可选。
   1. 将载网碳面朝上放置在覆盖有Parafilm的 7.5 × 2.5 cm 玻璃载片上。将载片放入辉光放电仪腔室中，并关闭腔室。
   2. 抽真空后，在 25 mA 和 7 × 10^-2 mbar 条件下进行 20 秒的辉光放电。
      注意：在此期间可见淡紫色辉光。取出带有载网的玻璃载片，并在 1 小时内使用，否则需要重新进行辉光放电处理。

3. 样品投入冷冻

注意：使用该仪器时应佩戴护目镜并穿着适当的防护鞋具，以防止液氮和乙烷飞溅造成伤害。

1. 开启冷冻固定装置。在加湿器储水槽中加入蒸馏水。设定所需的温度、相对湿度以及冷冻条件，包括吸滤时间、吸滤力度和吸附时间（本示例中为 22 °C、95%、2 秒、2 和 40 秒）。更换新的吸滤滤纸。
2. 通过向外部容器中注入液氮来冷却乙烷容器，直至温度稳定（约 10 分钟）。当液氮停止剧烈沸腾后，将乙烷气罐导管的末端插入内腔，并极其缓慢地打开阀门。使乙烷在内腔中液化，并填充至距顶部 1 mm 处。注意避免乙烷完全冻结。警告：乙烷具有高度易燃性和爆炸性。
3. 确保镊子 在冷冻固定装置中正确对齐。
4. 开启加湿功能。将载网装入镊子，然后在有孔载网的碳膜表面（无光泽面）滴加 3–5 µl 样品。等待样品在载网上吸附后，进行吸滤以形成一层极薄的液体膜。
5. 通过将载网迅速浸入液态乙烷中实现快速冷冻。从液态乙烷中取出镊子-载网组件时，应稳定握住镊子，并将其转移至盛有液氮的外层腔室。再将载网转移至浸没在液氮中的小型载网盒内。在将样品转移至储存罐或冷冻电镜样品杆的过程中，必须始终确保玻璃态样品处于液氮 环境中。
   注：载网盒可长期储存在大容量（35–50 L）液氮杜瓦瓶中，至少可保存一年。为便于储存，可将载网盒放入顶部带有两个通气孔并配有鱼线系于瓶盖的 50 ml Falcon 管中，鱼线可从杜瓦瓶口引出以便取用。

4. 将冷冻网格转移至透射电子显微镜

1. 将冷冻 holder 插入冷冻转移工作站中。插入时注意不要损坏 holder 的尖端。使用放大镜检查 holder 杆和 O 形圈上是否存在细小纤维或灰尘，如有则用光学镜头纸清除。
2. 用液氮填充 holder 的杜瓦瓶以及工作站的容器。使用工作站配备的带储液漏斗加注，避免液氮溅出。
3. 将冷冻 holder 连接到冷台控制器以监测温度，并持续添加液氮 ，直至温度稳定在约 -194 °C。确保工作站容器和 holder 杜瓦瓶中的液氮液面均低于真空密封圈的位置。在工作站上预冷网格镊子、夹环以及夹环工具的钝端。同时，在另一个装有液氮的杜瓦瓶中预冷一套大镊子和螺丝刀。
4. 使用大镊子迅速将装有冷冻水合网格的冷冻网格盒转移至工作站的液氮中。用螺丝刀打开冷冻网格盒，取出冷冻水合网格并将其放入样品 holder 插槽中。
5. 将夹环放置在网格上方，并用夹环工具的钝端轻轻按压，直至其牢固就位。关闭冷冻快门。将工具和冷冻网格盒从工作站中移出。
6. 将带有 holder 和网格的整个工作站转移至透射电镜控制台，以尽量减少网格在室温空气中的暴露时间。
7. 向透射电镜的防污染阱中补满液氮（此前应已预先填充并冷却至少 20 分钟）。将电镜样品台预倾斜至 -60°。
   注意：此操作可减少插入 holder 时液氮的损失。
8. 启动电镜的预抽气锁循环。确保电子枪的阀门处于关闭状态（特别是场发射透射电镜）。在插入冷冻 holder 前，等待预抽气锁程序完成（约 2 分钟）。
   注意：当样品台上的红灯熄灭时，表示该过程已完成。
9. 将 holder 插入气锁腔，并顺时针旋转 90°； 将冷台控制器线缆连接至冷冻 holder 以监测温度。再次等待红灯熄灭，然后将样品台和 holder 一同转回 0° 位置，将 holder 插入透射电镜的高真空腔室。
10. 确保温度始终不超过 -160 °C，以避免形成结晶冰。
11. 重新填充冷冻 holder 的杜瓦瓶。等待 15–45 分钟，直至 holder 达到热平衡且透射电镜的真空恢复后，再开始记录图像。
12. 若观察到液氮出现冒泡现象，可调整液氮 的填充高度，或用棉签轻轻触碰冒泡起始点以消除气泡。

5. 低剂量数据采集

注意：低剂量数据采集技术通过将电子辐照量限制在 20 电子/Ų 以内，以尽量减少电子辐射对样品的损伤。该技术通过在三种模式之间切换实现：低倍率（约 5,000X）和大视野的“搜索”模式，高倍率（约 150,000X）和小视野的“对焦”模式，以及具有所需最终放大倍数并包含待记录感兴趣区域的“曝光”模式。在不同模式之间切换时需关闭电子束。

1. 设置透射电子显微镜（TEM）和低剂量程序
   1. 收回冷冻快门并打开镜筒阀门。
   2. 居中样品台，并使用α倾斜控制器（alpha wobbler）将样品台上下倾斜±15°来设定齐焦高度（Z）。调节Z位置，直至样品台倾斜时样品无明显移动。启动低剂量程序，并为每种模式选择相应的探测器。
   3. 在曝光模式下，找到载网上无碳膜的区域，通过选择合适的聚光镜光阑和光斑尺寸来调节照明，使待记录区域获得均匀照明。务必在过聚焦方向上展宽电子束。
   4. 在搜索模式下，找到一个在高倍率下易于识别的小特征结构。切换至曝光模式，使用操纵杆（x-y样品台控制器）将该特征居中。如果该特征不在视野中，可从较低倍率开始操作。
   5. 在搜索模式下，使用低剂量x-y图像偏移控制将该特征移至视野中心。切换至曝光模式，沿倾斜轴方向使用操纵杆移动该特征，使其离开待记录区域（0.5 - 3 微米）。然后切换至对焦模式，使用x-y图像偏移控制将该特征居中。如果该特征不在视野中，可从较低倍率开始操作。
   6. 始终确保电子束处于光路中心。
2. 数据采集
   1. 收回冷冻快门并打开镜筒阀门。启动低剂量程序。
   2. 在搜索模式下，识别一个含有薄而均一冰层的载网方格。
   3. 选择一个合适的孔，并将其置于视野中心。切换至对焦模式并对图像进行聚焦，然后将图像欠焦0.5 - 4.5微米。
   4. 切换至曝光模式并记录图像。
   5. 切换回搜索模式，重复步骤5.2.3–5.2.4。在载网方格内移动时，避免提前曝光那些待记录的优质孔区。
   6. 完成当前载网方格的数据采集后，移至另一个合适的方格。
   7. 重新调整高度（Z），并继续数据采集。

结果

严格遵循图1中所述的所有实验步骤，可实现对冷冻水合、未染色大分子的可视化观察。本文展示了四种具有不同结构特征的代表性样品的结果，并比较了其通过负染（NS）和冷冻电镜（cryoEM）方法获得的显微图像（图2）。(i) AAV5 的负染图像显示直径约为 130 Å 的类病毒颗粒。完整与空心结构的共存分别对应于破损（允许染料进入）和结构完整的衣壳。冷冻电镜显示结构均为空心；事实上，这些病毒颗粒不含遗传物质²⁸。负染图像中主要呈现圆形颗粒，而冷冻电镜则主要显示六边形颗粒，反映出其二十面体对称结构。(ii) 螺旋状烟草花叶病毒（TMV）的图像显示直径为 180 Å、长度可变的杆状结构，常超过 0.1 µm，其 23 Å 的螺旋重复周期在负染和冷冻电镜图像中均可观察到。负染图像中，40 Å 的中心通道被染料填充，而在冷冻电镜图像中则为空腔。(iii) 天然的钥孔戚血蓝蛋白（KLH，一种分子量为 8 MDa 的双十二聚体）组装成特征性的桶状结构，直径为 350 Å，长度为 400 Å。负染与冷冻电镜均揭示出 KLH 的矩形侧视图和圆形端面视图。两种技术均显示出六条垂直于对称轴的条纹结构，以及每一层级内等间距的形态单元。冷冻电镜进一步揭示其内部为空腔结构。(iv) 兰诺定受体（Ryanodine receptor）是一种分子量为 2.26 MDa 的大型四聚体内质网钙释放通道，呈 275 × 275 Ų 的方形结构。复杂的表面特征，如中心十字形结构和中央凹陷，在负染中表现为染料聚集，在冷冻电镜中则表现为低密度区域。尽管负染在所有四种测试样品中显示出相似的对比度，但冷冻电镜图像的比较表明，由于使用去垢剂溶解该膜蛋白，RyR1 的信噪比（对比度）较低。

RyR1的冷冻电镜（cryoEM）常见伪影示例如下：晶状冰、冰污染、像散以及网状结构（图3）。其成因及预防措施将在讨论部分进一步阐述。

对冷冻水合状态下的RyR1进行单颗粒分析（SPA）和三维重构，揭示了其具有四重对称性的结构，反映了该蛋白的同源四聚体组织形式（图4A）。胞质结构域形成一个尺寸为275 × 275 × 120 ų的方柱形结构，包含多个可重复识别的球状结构域，构成类似支架的结构。跨膜结构域则形成一个较小且呈锥形的方柱体，最大尺寸为115 × 115 × 60 ų。在10 Å分辨率下，可清晰分辨出α螺旋结构（图4B）。三维差异图谱可揭示重要配体的结合位置；本例中，FKBP12（一种被视为RyR1亚基的12 kD蛋白）的三维差异图谱叠加在RyR1结构上（图4C）²⁹。最后，构象变化提供了该大分子动态行为的视图；在此例中，先前分别在关闭态和开放态条件下稳定的RyR1显示出从关闭态到开放态的质量迁移（图4D）²⁷。

图1. 冷冻电子显微镜技术的流程图。该图示强调了本实验方案的主要步骤。

图 2. 多种样品的负染（NS）与冷冻电镜（cryoEM）比较。（A）AAV5，一种二十面体病毒。（B）烟草花叶病毒（TMV），一种螺旋形病毒。插图显示其螺旋重复周期为 23 Å。（C）天然状态的钥孔戚血蓝蛋白（KLH）。（D）雷诺丁受体 1（RyR1）；图中突出显示了代表性视图（f，四重对称视图；s，侧视图）。所有样品均在低剂量条件下成像，放大倍数均为 50,000 倍，加速电压为 200 kV。比例尺：10 nm。所有负染样品均载于碳支持膜上；冷冻电镜样品 A、C、D 载于覆盖在 Quantifoil 载网上的一层薄碳膜上，冷冻电镜样品 B 则直接置于 Quantifoil 载网孔上。请点击此处查看该图的高清版本。

图3. 显示RyR1冷冻电镜样品中常见伪影的图像图集。（A） 结晶冰。（B） 冰污染（箭头所示）。（C） 像散。在像散图像中，RyR1几乎不可见。右侧插图显示该图像的功率谱，具有不对称的Thon环；左侧插图显示非像散图像的功率谱作为对照。（D） 网状结构。请点击此处查看该图的放大版本。

图 4. 兰诺定受体的冷冻电镜结构与三维重构。（A） 等值面表示。（B）RyR1 N端晶体结构的对接³⁰，显示原子坐标与冷冻电镜密度图之间具有良好的一致性；箭头指示从结构中突出的两个α螺旋。箭头指示围绕离子通道孔道的四个螺旋之一。虚线表示膜的边界。（C）RyR1 及其 FKBP12 配体（橙色）的三维定位。（D）RyR1 从闭合状态（橙色）转变为开放状态（黑色网格）时的构象变化。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

透射电子显微镜（TEM）结合单颗粒分析（SPA）已解析出大量大分子的三维结构，截至2014年年中，电镜数据库（EMDB）中此类结构已接近2,000个。通常情况下，对于特定的大分子，首先通过负染（NS）数据获得低分辨率的三维结构，随后可能进一步获得更高分辨率的冷冻电子显微镜（cryoEM）三维结构。负染提供的分子边界高对比度有助于实现初始的三维重构，而冷冻电镜则凭借其在完全水合状态下描绘大分子内部结构的能力，以及实现更高分辨率的潜力，对结构进行进一步优化。冷冻电镜的另一优势在于避免了脱水过程可能引起的大分子塌陷。此外，冷冻电镜还可省去碳支持膜，从而消除可能的表面吸附效应，并展现大分子在溶液中的真实构象。冷冻负染技术是冷冻电镜与负染的结合，可在完全水合的样本中提供高对比度，并同样可用于单颗粒分析的三维重构，但该方法应用较少，EMDB中相关条目不足10个，部分原因在于染色剂本身可能干扰大分子的完整性³¹。另外两种适用于三维重构的透射电镜技术是二维电子晶体学和电子断层扫描。二维电子晶体学需要平面或管状晶体，利用晶体的电子衍射数据进行三维重构，有望达到原子分辨率³²。在对玻璃态或传统固定样本进行电子断层扫描时，大分子或亚细胞组分在透射电镜中被旋转，进而实现断层三维重构³³，其优势在于可对单一对象进行重构；但目前该技术的分辨率极限在40至20 Å之间^34,35。在所有这些分子级透射电镜技术中，负染和冷冻电镜数据的单颗粒分析应用最为广泛。本文所示方案专注于获取适用于单颗粒分析的冷冻电镜图像；然而，该方案的大部分步骤同样适用于二维晶体和断层扫描样本的冷冻电镜实验。

一次成功的冷冻电镜实验依赖于多个关键步骤的共同成功；下文将介绍需要牢记的重要方面、常见冷冻电镜伪影的解释及其避免方法。本节还描述了采用单颗粒分析方法获得高质量三维重构数据的数据采集指南。

避免转变为结晶冰。 关键的一点是，样品自冷冻投入起直至透射电子显微镜（TEM）观察期间，必须始终保持在玻璃态。因此，在将样品浸入液态乙烷后，所有后续操作均需在液氮（-196 °C）或液氦（-269 °C）温度下进行。当温度升至高于 -135 °C 时，玻璃态水会转变为结晶态水，此时可能发生大分子重排，且图像中将出现大量水结晶（图3A），此类样品应予以弃用。若冷冻投入过程、冷冻载网在容器之间的转移（即使使用载网盒保护）、和/或冷冻样品杆插入透射电镜的操作过慢，或操作镊子预冷不充分，均可能导致样品意外升温。此外，在冷冻转移过程中，透射电镜内部真空度显著下降（冷样品会捕获较暖的进入空气）也可能导致样品升温。最后，样品受到过度辐照也可能引起向结晶冰的转变。

尽量减少冰污染。由于施加到透射电镜（TEM）载网上样品体积较小（3–5 µl），蒸发可能导致缓冲液组分（盐、去垢剂）浓缩，从而影响大分子的完整性，包括多聚体状态的丧失。通过使用高相对湿度（RH）的微环境或密闭腔室可避免此问题。或者，也可在通风良好的低温环境房间内进行冷冻 plunge。冷冻 plunge 后，应尽可能降低相对湿度，以防止冰污染，或环境湿气在冷冻载网上冷凝，因为冷冻载网本身会充当冷阱。冰污染表现为高对比度、无内部结构的颗粒，尺寸范围从约 5 nm 到数微米不等，会干扰甚至完全遮挡图像。在冷冻载网空气转移过程中，应避免气流扰动、对着载网说话或呼吸，并尽量降低环境相对湿度。含有冷凝水的液氮容器（可见白色悬浮颗粒）也应弃用。

最大化大分子的取向/视角多样性。 在样品载网上，需在真正的有孔载网与在有孔载网上覆盖薄碳膜之间进行选择。这一选择取决于以下因素：(i) 样品在碳膜表面与碳膜孔洞区域的分布情况；(ii) 可用的样品浓度，因为裸露的孔区可能需要比碳膜支撑更高的浓度（约从 0.02 到 2 µM，相差可达 100 倍）才能在图像中获得相似的颗粒密度；(iii) 大分子取向分布的随机性程度。需要注意的是，辉光放电处理（使碳膜具有亲水性）会对上述三个方面均产生重要影响，且该效应依赖于具体样品。关于大分子的取向，虽然在采用随机锥形重构法进行初始结构解析时，重复出现的某一视角是有利的，但在对三维重构进行高分辨率优化时，则希望大分子的视角尽可能随机。在本例中，RyR1 会与碳膜相互作用，倾向于呈现一种特定的“四重对称”视角（图 2D），因此需要使用有孔载网以获得更随机的取向分布，从而实现更高分辨率的结构解析³⁶。

最大化信噪比。 提高信噪比的最佳策略是降低背景噪声来源。过厚的冰层以及（如果存在）超出支撑和包埋蛋白质所需厚度的碳膜都会引入额外噪声。因此，应通过控制 blotting 时间、压力、相对湿度（RH）和滤纸质量，将冰层厚度降至最低必要水平。对于碳支持膜，通常在较厚的有孔碳膜上覆盖一层薄的（约 5 nm）碳膜：厚的有孔碳膜提供机械强度，而样品则在薄碳膜覆盖的孔区成像。然而需要注意的是，过薄的冰层和/或碳膜可能导致支撑结构易破裂，形成网状结构（图 3D）。为最大化信噪比，应避免使用任何不必要的缓冲液成分。对于膜蛋白，去垢剂会显著降低对比度（见 图 2D，右图）。此外，去垢剂通过降低表面张力，改变了样品在支撑膜上的铺展方式。某些膜蛋白除了去垢剂外还需要脂质存在，这会进一步降低对比度。为克服此问题，可在冷冻 plunge 前将样品稀释于去垢剂浓度更低且不含脂质的缓冲液中³⁷。新型替代性去垢剂¹⁶以及使用纳米盘（nanodisks）³⁸来稳定跨膜结构域的方法，已被证明是通过冷冻电镜成像膜蛋白的有效策略。

力求获得高质量图像，并为CTF校正做好准备。 玻璃态冰冻样品需要较高的欠焦值以产生足够的图像（相位）对比度，此时传递函数（CTF）——即强度与频率关系的函数——会出现多个过零点，在这些点上无信息存在。虽然在低分辨率三维重构中无需进行CTF校正，但在追求更高分辨率以获得三维结构的准确表征时，需采集不同欠焦值的图像，以便进行计算化的CTF校正。CTF的判定与校正已包含在主流单颗粒分析（SPA）软件包中。 ^4-7；详细信息可参见其他文献 ³⁹为获得最佳的CTF校正效果，应使用一系列不同的离焦值。一个有效的策略是在3-4个离焦值之间交替使用。具体数值取决于大分子的尺寸（分子越大，所需离焦越小）、冰层/碳膜厚度（样品越薄，所需离焦越小）以及加速电压（电压越低，所需离焦越小）。在200 kV条件下，推荐的起始离焦范围为2.5、3、3.5和4 µm。CTF在衍射图中表现为明暗交替的环状条纹（Thon环）。 ⁴⁰在倒易空间表征中，即功率谱。显示功率谱可揭示分辨率潜力；最外侧可见Thon环的频率即为最高分辨率的近似值 先验的 可达到的分辨率估计。应定期检查功率谱，观察是否存在散光（非圆形）的索恩环（图3C应使用物镜消像散器进行校正，至少在期望分辨率范围内应能观察到萨恩环。

采用本方案获得的冷冻电镜数据可直接通过单颗粒分析法（SPA）进行处理，以生成三维重构结构。即使样品处于理想状态，三维重构的质量仍取决于透射电子显微镜设备的性能与参数设置，以及图像处理过程。随着这两方面技术的持续进步，特别是近年来开发的直接电子探测器，实现更稳定地获得原子分辨率三维重构结构的可能性已比以往任何时候都更接近现实。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
乙烷	Airgas	371745	纯度99.99%至关重要，杂质可能导致载网上出现高对比度污染物。注意：易燃
液氮	Airgas	27135	纯度99%。注意：在低温室内操作液氮存在严重的窒息风险，因为氮气会置换氧气且无任何警示迹象。
Dumont no. 5 无磁镊子	Ted Pella	5326
云母片，1 × 4 cm	Ted Pella	54
石墨棒，预磨尖，直径1/8”，长2 ¼”，尖端直径0.039”，颈型	Electron Microscopy Sciences	70220-45
350 ml 冷冻杜瓦瓶	Pope	8600
Cu 400目带孔载网  Quantifoil	Quantifoil	Q10525
Cu 400目带孔载网 C-Flat	Protochips	CF-1.2/1.3-4C
辉光放电装置	Electron Microscopy Sciences	Model E7620
涡轮抽气站	Gatan	Model 655
碳蒸发仪	Denton Vaccum	Model 502B
冷冻压片装置	FEI	Vitrobot Mark IV
200 kV 透射电子显微镜	FEI	Model Tecnai F20
CCD相机，4k × 4k	Gatan	UltraScan 4000 UHS
图像处理软件 CTFFIND3/CTFTILT			http://grigoriefflab.janelia.org/ctf
图像处理软件 EMAN			http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2
图像处理软件 Spider			http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html
图像处理软件 Freealign			http://grigoriefflab.janelia.org/frealign
三维可视化软件 Chimera			http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/
天然钥孔血蓝蛋白	Biosyn