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方法文章

基于人多能干细胞的发育毒性检测方法用于化学品安全性筛选及系统生物学数据生成

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DOI：

10.3791/52333

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2015年6月17日

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1Center of Physiology and Pathophysiology, Institute of Neurophysiology, University of Cologne, 2Department of Biology, University of Konstanz, 3Department of Statistics, Technical University of Dortmund, 4Leibniz Research Centre for Working Environment and Human Factors, Technical University of Dortmund

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案描述了两种 体外 基于人类胚胎干细胞和转录组研究的发育毒性测试系统（UKK 和 UKN1）。这些测试系统可预测人类发育毒性的危害，有助于减少动物实验、降低成本以及化学安全性测试所需的时间。

摘要

高效地将人类多能干细胞分化为各种组织的方案，结合组学技术，为 体外 潜在药物的毒性测试。为了为这类检测提供坚实的科学基础，通过系统生物学方法获取发育过程的时间动态及其潜在调控机制的定量信息至关重要。因此，本文针对这些需求优化了两种检测方法。在UKK测试系统中，人胚胎干细胞（hESC）（或其他多能干细胞）在类胚体中自发分化14天，以生成三个胚层来源的细胞。该系统可重现人类早期胚胎发育的关键阶段，若在分化过程中暴露于化学物质，则可预测人类特异性的早期胚胎毒性/致畸性。UKN1测试系统基于hESC向神经外胚层前体（NEP）细胞群体分化6天的过程，可模拟早期神经发育，并预测化学物质引发的早期发育神经毒性和表观遗传改变。这两种系统结合转录组微阵列研究，均适用于毒性生物标志物的鉴定。此外，它们可联合使用，为系统生物学分析提供输入数据。相较于依赖大量实验动物的传统毒理学研究，这些检测系统具有显著优势，有助于降低药物研发和化学品安全性评价的成本。两者的联合应用尤其有助于揭示可能特异性影响神经发育的化合物的作用机制。

引言

人类胚胎干细胞（hESC）能够分化为多种类型细胞的能力开启了一个新时代 体外 毒性测试1疾病建模与再生医学2干细胞具有自我复制、维持其多能状态以及分化为特化细胞的能力。3,4人类胚胎干细胞（hESC）具有分化为所有主要细胞类型的潜能，这一特性也存在于其他人类多能干细胞中，例如人类诱导多能干细胞（hiPSC）或通过核移植技术获得的细胞。5例如，许多不同的人胚胎干细胞系已被分化为神经元6，肾细胞7，神经嵴细胞8心肌细胞9-12或类似肝细胞的细胞13,14此外，人胚胎干细胞（hESC）可自发分化为三个胚层的各种细胞15-18 在类胚体（EBs）中19,20早期胚胎发育受到与不同胚层相关基因差异表达的调控，这种差异表达已通过微阵列技术的转录组学在mRNA水平上得到检测。15这些努力促成了基于人胚胎干细胞/人诱导多能干细胞及转录组学分析的器官特异性毒理学模型的建立（综述见 21,22）。这些模型相较于传统毒理学研究中使用的实验动物具有优势，因为利用实验动物进行的临床前研究并不总能准确预测药物对人体的安全性。在患者中观察到的药物诱导毒性通常与人类和实验动物之间不同的代谢或信号传导过程相关。物种差异导致难以可靠地早期检测出对人体的发育毒性，例如沙利度胺等药物23,24 和己烯雌酚25,26 由于致畸性而被撤出市场。沙利度胺在大鼠或小鼠中未表现出任何发育毒性。环境化学物质如甲基汞27 在多种物种中导致神经系统方面的产前发育毒性，但人类的相关表现难以在动物模型中复制。为解决物种特异性问题，来自ReProTect、ESNATS、DETECTIVE等不同干细胞相关项目的科研人员 等等。 正在利用疑似对人类产生影响的人源毒性物质，开发针对胚胎毒性、神经毒性、心脏毒性、肝毒性和肾毒性的不同模型。在欧洲联合项目“基于胚胎干细胞的新型替代测试策略（ESNATS）”中，已建立了五种测试系统。其中一种测试系统即所谓的 UKK（Universitätsk临床医学中心 Köln）测试系统部分模拟了人类早期胚胎发育过程。在该系统中，人类胚胎H9细胞被分化为三个胚层（外胚层、内胚层和中胚层）。15 并通过Affymetrix芯片平台的转录组学分析捕获了胚层特异性特征。多种发育毒性物质，如沙利度胺28，丙戊酸，甲基汞16,17或阿糖胞苷15 在此系统中已进行测试，并获得了特定毒物的基因表达特征。在第二种测试系统中，即所谓的 UKN1（U大学 Konstanz) 测试系统1中，H9细胞分化为神经外胚层前体细胞（NEP）持续6天。这由神经基因标志物的高表达所证实，例如 PAX6 和 OTX2 在为期6天的分化过程中，NEP细胞暴露于VPA、甲基汞等发育性神经毒物。通过Affymetrix微阵列平台，已获得由不同毒物特异性诱导的转录组学表达谱紊乱特征。16,29.

21世纪毒理学的新愿景st 世纪以来，人们设想测试系统不仅能够提供组织病理学等表型描述 体内，或长期毒物孵育结束时的转录组变化。相反，这表明检测方法能够提供机制性信息3，并且这些信息可以映射到所谓的不良结局通路（AOP），为有害效应提供科学依据30. 为了提供此类信息，所采用的检测系统必须经过严格的质量控制31，例如通过完善的标准化操作程序所记录的那样。此外，还需要以高分辨率绘制出随时间变化的动态过程。这要求测试系统具备同步变化的能力32文中所述的UKN1和UKK测试系统已针对这些要求进行了优化。

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方案

以下实验方案使用人胚胎干细胞系（hESC）H9 进行。该细胞系常规培养于经有丝分裂失活的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）上，培养基为人胚胎干细胞培养基，并添加 bFGF；随后将细胞转移至涂有基底膜基质（如 Matrigel）的 6 cm 培养皿中，使用干细胞培养基培养，以去除 MEFs。选取融合度超过 >80% 的 H9 细胞进行后续传代。培养在基底膜基质包被培养皿上的 H9 细胞用于拟胚体（EBs）的形成。本方案中提及的所有操作均按照无菌操作和良好细胞培养规范的标准方法进行。

第1部分. UKK测试系统

1. 人类胚胎干细胞培养

  1. 在饲养细胞上进行H9细胞的传代与维持
    1. 用移液器将2 ml 0.1%明胶加入每个6 cm培养皿中，在细胞培养箱（37 °C、5% CO2）中孵育30分钟。使用无菌巴斯德吸管吸除明胶溶液。
    2. 在两个经明胶包被的培养皿中各加入2 ml含有0.1 × 106 MEF细胞/ml的MEF培养基，并在细胞培养箱（37 °C、5% CO2）中过夜孵育。
    3. 次日，使用镊子从液氮储存罐中取出H9细胞冻存管，用长柄镊子在37 °C水浴中解冻。
    4. 将冻存管从水浴中取出，用70%乙醇冲洗表面，在生物安全柜中晾干15至30秒，然后将细胞转移至15 ml离心管中。
    5. 沿管壁缓慢加入9 ml H9培养基，于200 × g离心5分钟。
    6. 吸除上清液，将细胞重悬于6 ml含有ROCK抑制剂（10 µM，Y27632）的培养基中，轻轻吹打混匀。吸除6 cm培养皿中的MEF培养基，每皿加入3 ml细胞悬液。第3天更换培养基，之后每隔一天更换一次。当细胞融合度>80%时，按1:3的传代比例进行传代。
      注：通常在5至7天内培养皿中的细胞达到融合状态。所用饲养细胞来源于CF1小鼠胚胎，并通过γ射线照射灭活。
  2. 在基底膜基质包被的培养皿上培养H9细胞
    1. 在室温下解冻干细胞培养基（5×）添加剂，在生物安全柜中将其加入400 ml基础培养基中，总体积为100 ml。
    2. 将基底膜基质置于冰上解冻。根据每批次分析证书推荐的体积，将适量基底膜基质加入24 ml预冷的DMEM/F-12基础培养基中，用于包被十二个6 cm培养皿。通过反复吹打混匀。
    3. 每个6 cm培养皿中加入2 ml上述混合液，在室温下静置1小时。吸除液体，每皿加入2 ml干细胞培养基。
    4. 取出四个在MEF上生长至融合的H9培养皿，在生物安全柜内的体视显微镜下用1 ml移液器吸头去除已分化细胞集落。
    5. 吸除培养基，用4 ml PBS洗涤细胞，每皿加入2 ml干细胞培养基。使用26 G针头将未分化集落切割成每块6至9小片。
    6. 轻柔地将细胞收集至50 ml离心管中，于200 × g离心5分钟。
    7. 吸除上清液，将细胞重悬于12 ml干细胞培养基中。取20 µl悬液滴于载玻片上，在显微镜下计数细胞团块，调整体积使终浓度为每毫升含150个团块。每6 cm培养皿中加入2 ml细胞悬液。
    8. 通过前后及左右轻晃培养皿使团块均匀分布，随后将培养皿置于细胞培养箱（37 °C、5% CO2）中孵育。
    9. 定期去除分化细胞集落，并每隔一天更换一次培养基。

2. 胚状体（EBs）的形成

按照无菌操作要求并在生物安全柜中进行下述所有操作。

  1. 第0天 — 将H9细胞接种于V型底培养板
    1. 制备5%的嵌段共聚物（如Pluronic F 127）PBS溶液，并使用0.22 µm无菌滤膜通过真空驱动过滤系统进行过滤。
    2. 每孔加入40 µl 5%嵌段共聚物溶液对V型底96孔板进行包被，室温孵育45分钟。
    3. 从培养箱中取出长满H9细胞的基底膜基质培养板，在生物安全柜内的体视显微镜下用1 ml移液枪头去除已分化的细胞集落。
    4. 吸除培养基，用4 ml PBS洗涤细胞。每块培养板中加入2 ml随机分化培养基（H9细胞培养基不含bFGF，RD培养基）。使用传代工具在生物安全柜内的体视显微镜下观察，将H9细胞集落切割成大小和形状均一的细胞团块，然后轻轻刮下细胞。
    5. 将细胞团块收集至50 ml离心管中，以200 × g离心5分钟。吸除上清液，用RD培养基重悬细胞，使细胞浓度达到每毫升1,000个团块。
    6. 吸除V型底培养板中的嵌段共聚物溶液。将细胞团块转移至无菌方皿中，借助多通道移液器将100 µl悬液加入V型底板的每一孔中。
    7. 为促进团块强制聚集，将V型底培养板在4 °C条件下以400 × g离心4分钟。随后将培养板置于细胞培养箱（37 °C，5% CO2）中培养四天。
  2. 第4天 — 胚状体（EBs）的收集
    1. 使用多通道移液器和宽口200 µl枪头，将V型底培养板中的胚状体转移至无菌方皿中。
    2. 用10 ml无菌血清移液管将无菌方皿中的胚状体收集至15 ml离心管中。静置2分钟使胚状体沉降，吸除上清液，并用5 ml PBS洗涤胚状体。
    3. 再次静置2分钟使胚状体沉降，吸除上清液，用5 ml RD培养基重悬胚状体。
    4. 用移液器将10 ml RD培养基加入10 cm细菌培养皿中，随后将胚状体转移至该培养皿中。
    5. 将细菌培养皿置于细胞培养箱（37 °C，5% CO2）内的水平摇床上（往复运动频率为50次/分钟），按所需时间进行培养。每隔一天更换一次培养基（加入15 ml RD培养基）。
      注意：在培养人胚胎干细胞（hESCs）时需轻柔操作。第4天时胚状体的大小存在差异，应通过体视显微镜观察，挑选大小均一（±20%）的胚状体用于后续实验。采用本方法形成的胚状体中约有50%大小均一。在摇床上培养有助于获得形态均一的胚状体。

3. 用于确定 IC10 的细胞毒性检测

  1. 将胚胎小体转移至光学底板
    1. 将0.1%明胶在37 °C水浴中解冻15分钟，使用多通道移液器向每孔光学底板加入50 µl 0.1%明胶进行包被。室温孵育45分钟。孵育结束后，从光学底板中吸除明胶。
    2. 取出第4天收集在含RD培养基的10 cm细菌培养皿中的EBs。
    3. 将光学底板置于生物安全柜中呈倾斜位置。在体视显微镜下观察，将两个大小均一的胚胎体（EBs）转移至含100 µl RD培养基的光学底96孔板中，每孔一份。放置12小时th 柱子为空。
    4. 在细胞培养箱（37 °C，5% CO₂）中孵育培养板224小时
  2. 第5天至第14天的药物暴露
    1. 称量待测化合物，并用已知溶剂配制最高浓度溶液。
    2. 将待测化合物在含有溶剂的 Falcon 管中依次进行半对数稀释，共稀释 8 个梯度，Falcon 管编号分别为 A 至 H；设管 I 为溶剂对照，管 J 为阴性对照（RD 培养基），管 K 为阳性对照（70% 乙醇）。
    3. 将RD培养基在37 °C水浴中解冻15分钟。取5 ml RD培养基分别加入已标记为1至11的11个无菌Falcon管中。
    4. 将5 µl溶液从A管至K管分别转移至1至11号管中，涡旋混匀各管。从培养箱中取出光学底板，使用多通道移液器小心吸除培养基。
    5. 向光学底板的相应列中加入 200 µl 来自 1 至 11 号管的培养基。每隔一天更换一次培养基/药物。
      注意：进行半对数稀释时，取6.48 µl溶剂加入标号为2至8的7个试管中。从浓度最高的1号管中取3 µl转移至2号管，涡旋混匀后依次逐管转移3 µl。9号管留作溶剂对照，10号管留作阴性对照，11号管为70%乙醇。
  3. 第14天：Resazurin暴露与荧光测定
    1. 将 RD 培养基在 37 °C 水浴中解冻 15 分钟。以下所有操作均需在生物安全柜中避光进行。
    2. 在15 ml离心管（A）中加入10 ml RD培养基，加入推荐体积的刃天青试剂，用移液器混匀。从培养箱中取出光学底板，用多通道移液器小心吸除全部培养基。
    3. 从A管中向每孔加入100 µl培养基。将培养板置于细胞培养箱中孵育（37 °C，5% CO₂）290 分钟
    4. 使用分光光度计测量荧光（560Ex/590Em).
  4. IC10 值的测定
    1. 在GraphPad Prism中导入减去空白值后的数据。将x轴设为剂量，y轴设为荧光单位。
    2. 将数值归一化以在 y 轴上表示百分比，并对数值进行转换（x 轴采用对数刻度）。计算 IC50 使用S形剂量-反应（可变斜率）参数计算log IC值10 使用以下公式计算数值：
      F = 10 logEC50 = logECF - (1/希尔斜率)*log(F/(100-F))
      Y = 底值 + (顶值 - 底值)/(1 + 10^((LogEC50-X)*HillSlope))
    3. 确定 IC10 用于进一步研究的数值。

4. 基于微阵列的生物标志物研究

  1. 第0天至第5天：
    1. 拟胚体形成并转移至10 cm细菌培养板——按照第2点所述步骤进行拟胚体形成。
      注意：每个实验设置三个生物学重复。将每个生物学重复分为两部分——分别进行IC10浓度药物处理和溶剂对照处理。用溶剂配制比IC10浓度高10,000倍的药物储备液，从中取10 µl加入含H9细胞团的100 ml RD培养基中，在50 ml离心管中充分混匀后接种于V型底板。对照组按相同程序加入等量溶剂。
  2. 在第5天至第14天进行药物暴露时，于第4天按照第2点所述步骤收集拟胚体，并将其转移至10 cm细菌培养板中。将培养板置于细胞培养孵育箱（37 °C，5% CO2）内的水平摇床上（往复运动频率50次/分钟）培养14天，每隔一天更换一次培养基。
  3. 样本采集：在第14天，使用无菌移液管将10 cm培养板中的拟胚体收集至15 ml离心管中。静置2分钟使拟胚体沉降，吸除上清液，并用5 ml PBS洗涤拟胚体。再次静置2分钟，吸除上清液。将拟胚体重悬于1 ml RNAlater溶液或TRIzol试剂中，涡旋混匀后于-80 °C保存，直至后续处理。
    注意：所有操作均应在生物安全柜中按照良好实验室规范进行。通过绕中心做圆周旋转培养板使所有拟胚体集中至中央，使用无菌玻璃巴斯德移液管吸除周围培养基，加入15 ml RD培养基，然后根据分组分别加入15 µl药物或溶剂。

5. RNA 提取与完整性检测

  1. RNA 提取：
    以下提到的大多数步骤均需按照 RNeasy Mini Kit 说明书进行 RNA 纯化。始终使用无核酸酶的离心管、移液器吸头和水。使用 TRIzol 时，所有操作均应在化学安全通风橱中进行，并佩戴防护眼镜和化学防护手套。
    1. 将样品在冰上解冻。若样品保存于 RNAlater 溶液中，则在 4 °C 下以 12,000 × g 离心 5 分钟。弃去上清液，加入 1 ml TRIzol 试剂。
    2. 使用 24 号针头和 1 ml 注射器反复吹打样品。约吹打 15 次即可充分裂解拟胚体（EBs）、细胞壁和质膜。
    3. 向每个样品中加入 200 µl 氯仿。充分涡旋混匀。在 4 °C 下以 12,000 × g 离心 15 分钟。取出 RNeasy 小柱、1.5 ml 离心管并正确标记。
    4. 将上清液收集至 1.5 ml 离心管中（收集时避免扰动中间层或底层）。加入等体积预冷的 70% 乙醇。轻轻振荡混匀。
    5. 从管中取 700 µl 溶液加入对应的小柱中，在室温下以 12,000 × g 离心 20 秒。后续所有步骤均在室温下进行。
    6. 弃去滤液，将剩余溶液加入对应小柱中，在 12,000 × g 下离心 20 秒。弃去滤液。
    7. 向小柱中加入 350 µl RW1 缓冲液，在 12,000 × g 下离心 20 秒。弃去滤液，然后向小柱中加入 10 µl DNA 酶和 70 µl RDD 缓冲液。
    8. 室温孵育 15 分钟。加入 350 µl RW1 缓冲液，在 12,000 × g 下离心 20 秒。弃去滤液。加入 500 µl RPE 洗涤缓冲液，在 12,000 × g 下离心 20 秒。弃去滤液。再次加入 500 µl RPE 洗涤缓冲液，在 12,000 × g 下离心 2 分钟。弃去滤液。
    9. 将小柱转移至新的 2 ml 收集管中，在 12,000 × g 下离心 1 分钟。再将小柱转移至已标记的 1.5 ml 收集管中，加入 22 µl 无核酸酶水。在 12,000 × g 下离心 1 分钟。
    10. 取下收集管并置于冰上。使用自动化电泳系统测定 RNA 浓度。
  2. RNA 浓度、纯度及完整性检测。
    使用自动化电泳系统及相应试剂盒进行 RNA 纯度和完整性检测33。

6. 微阵列研究

  1. 使用市售的人类基因表达谱芯片进行转录组分析。RNA样本制备、片段化及杂交步骤34 以及芯片染色、洗涤35 使用市售试剂盒。
  2. 使用标准流体工作站、芯片扫描仪和标准操作软件进行芯片扫描及质量控制检查36用于基因表达分析时，将扫描仪生成的文件导入标准的商用软件37，使用稳健多芯片分析法（Robust Multi-array Analysis, RMA）进行背景校正、汇总和标准化。
  3. 为获得差异表达基因（DEG）列表，进行单因素方差分析（one-way ANOVA）。根据倍数变化（±2）和经FDR校正的p值（< 0.05）。进行主成分分析（PCA）、热图 等等。 使用该软件。

第2部分. UKN 1 测试系统

1. hESC 的维持

  1. MEF 的接种
    1. 用于分化实验时，使用 NSCB#8534（H9）细胞系。将细胞培养在小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）上作为饲养层细胞。用 4 ml 0.1% 明胶包被 T25 培养瓶，于 37 °C 孵育 30 分钟。
    2. 在 37 °C 水浴中解冻 MEFs，并将细胞转移至预热的 DMEM/10%FBS 培养基中。
    3. 以 500 × g 离心 3.5 分钟，弃上清液，重悬细胞至浓度为 1 × 107 个细胞/ml。将 MEFs 以 4 × 104/cm2 的密度接种于明胶包被的 T25 培养瓶中。可选择在接下来的两天内使用。MEF 批次的质量对人胚胎干细胞（hESC）的维持极为关键，因此建议明确最适合 H9 细胞的供应商和制备方法。我们使用 PMEF P3 代细胞。
  2. H9 细胞的传代与维持
    1. 每瓶 T25 培养瓶中的 H9 细胞加入 1 ml 预热的分散酶（dispase），于 37 °C 孵育 9 分钟。
    2. 向经分散酶处理的细胞中加入 2 ml 洗涤培养基，用 5 ml 移液管上下吹打 5 次，然后将细胞悬液转移至离心管中。
    3. 用 9 ml 洗涤培养基冲洗培养瓶，并将冲洗液与细胞悬液合并。以 500 × g 离心 3.5 分钟，弃上清液，将细胞重悬于 10 ml hESC 培养基中。
    4. 再次以 500 × g 离心 3.5 分钟，弃上清液，将细胞重悬于 4 ml hESC 培养基中。取 0.5 ml 细胞悬液加入 4.5 ml hESC 培养基，接种至新的（经 PBS 洗涤的）含 MEF 饲养层的 T25 培养瓶中。每天更换整个培养瓶的 hESC 培养基（5 ml）。

2. 人类胚胎干细胞向神经外胚层前体细胞（NEP）的分化

  1. 准备hESC培养基和KCM培养基。每个T25培养瓶对应用明胶（PBS中0.1%）包被一个10 cm培养皿，于37 °C孵育30分钟。从hESC中移除培养基，加入足量的accutase覆盖整个培养瓶底部（每T25培养瓶1 ml），于37 °C孵育25至30分钟。
  2. 在accutase孵育期间准备基底膜基质包被的培养板。加入冷的DMEM/F12至冷冻的基底膜基质沉淀中，按1:20比例溶解。通过40 µm细胞筛过滤基底膜基质溶液。将过滤后的溶液加入培养板，确保完全覆盖整个底部（每6孔板需1 ml），于室温孵育2小时。
  3. 孵育结束后，移除基底膜基质上清液，并将细胞接种至包被好的孔中。accutase处理步骤（2.1）后，加入1.5 ml HES培养基终止反应。用刮棒将细胞从培养瓶上刮下，加入8 ml hESC培养基，使用10 ml移液管反复吹打形成单细胞悬液。通过40 µm细胞筛过滤细胞。
  4. 以500 × g离心细胞3分钟，弃上清，将细胞重悬于10 ml hESC培养基中。再次以500 × g离心3分钟，弃上清，将细胞重悬于含ROCK抑制剂Y-27632（终浓度为10 µM）的hESC培养基中。
  5. 移除明胶包被培养皿中的上清液。将细胞悬液接种至明胶包被的培养皿中以去除MEF细胞，并在培养箱中孵育恰好1小时。
    注意：在此步骤中，MEF细胞会贴附于明胶包被的培养皿表面，而hESC无法贴附于明胶。因此，该步骤对获得无饲养层的分化至关重要。孵育时间过长会导致hESC聚集成团，过短则导致MEF去除不充分，均为关键控制点。孵育45分钟后应检查培养皿中是否已有MEF贴壁及hESC是否形成细胞团。
  6. 当MEF细胞已贴壁后，轻轻用培养皿中原有培养基洗去未贴壁的细胞（hESC）。若使用多个T25培养瓶以获得较多细胞，此时可合并单细胞悬液。用hESC培养基洗涤培养皿一次。
  7. 以500 × g离心细胞3分钟，弃上清，将细胞重悬于约4 ml含10 µM ROCK抑制剂Y-27632和10 ng/ml FGF-2的KCM培养基中。
  8. 使用台盼蓝染色在血细胞计数板中计数细胞。以18 × 103 细胞/cm2 的密度将细胞接种至含10 µM ROCK抑制剂Y-27632和10 ng/ml FGF-2的KCM培养基中的基底膜基质包被板上（6孔板每孔使用1.5 ml）。为成功分化为神经外胚层前体细胞（NEPs），必须以正确的细胞密度接种。
  9. 24小时后，更换为新鲜的含10 µM ROCK抑制剂Y-27632和10 ng/ml FGF-2的KCM培养基。再过24小时后，更换为含10 ng/ml FGF2的新鲜KCM培养基。
  10. 接种细胞72小时后，通过更换为KSR培养基启动分化。此时间点称为分化第0天（DoD0）。此时可加入待测物质。
  11. 在DoD1和DoD2，培养基更换方式与DoD0完全相同。下一次换液在DoD4，使用含25% N2-S和75% KSR的培养基。在DoD6终止分化，收集细胞进行分析。

3. 人胚胎干细胞和神经前体细胞的染色质免疫沉淀（ChIP）

  1. 细胞核制备
    1. 向每个待分析的6孔板中加入500 µl的accutase，于25至30分钟内孵育。使用台盼蓝染色，在Neubauer计数板中计数细胞。
    2. 将细胞重悬于含1%多聚甲醛的DMEM/F12培养基中进行交联。10分钟后加入Tris（pH 7.5），使其终浓度为125 mM，以终止交联反应。
    3. 在4 °C条件下以500 × g离心3分钟，弃上清，将细胞重悬于预冷的PBS中。
    4. 在4 °C条件下以500 × g离心3分钟，弃上清，将细胞重悬于1 ml L1缓冲液/1 × 106个细胞。
    5. 冰上孵育5分钟，在4 °C条件下以800 × g离心5分钟，弃上清，将细胞核重悬于1 ml L2缓冲液/2 × 106个细胞。
  2. 超声破碎与质量控制
    1. 进行超声处理，使DNA片段长度为300–700 bp。在4 °C条件下以10,000 × g离心1分钟，将上清转移至新管中。片段大小必须合适，否则将影响免疫沉淀效率以及后续qPCR结果。
    2. 取50 µl样品与50 µl L2缓冲液混合，通过琼脂糖凝胶电泳检测超声破碎效率。
    3. 在65 °C、500 rpm条件下孵育4小时以逆转交联。将样品按1:5比例加入橙G加样缓冲液，上样至1.5%琼脂糖凝胶，在1×TBE缓冲液中以110 V电泳45分钟，检测片段大小（应在300–700 bp之间）。
  3. 染色质免疫沉淀（ChIP）
    1. 用稀释缓冲液将样品按1:5稀释，并分装至硅化管中，每管1 ml用于免疫沉淀。
    2. 从稀释后的染色质样品（步骤3.3.1）中取出5%体积，4 °C保存作为“输入”对照。
    3. 在旋转仪上，于4 °C条件下用所选抗体及非特异性IgG对样品进行过夜孵育。
    4. 免疫沉淀后，向每份样品中加入50 µl Protein-A/G Sepharose微珠，在旋转仪上4 °C孵育3小时。在4 °C条件下以1,500 × g离心1分钟，弃上清。
    5. 用1 ml洗涤缓冲液洗涤微珠，在4 °C条件下以1,500 × g离心1分钟，弃上清。重复步骤g至h。最后用1 ml终洗缓冲液洗涤。洗涤过程中应避免丢失任何微珠，否则会直接影响洗脱产物的量。
    6. 在4 °C条件下以1,500 × g离心1分钟，弃上清，加入125 µl洗脱缓冲液，在摇床中65 °C、1,000 rpm条件下孵育15分钟。
    7. 以1,500 × g离心1分钟，将上清转移至新管中。重复步骤k和l。向“输入”样品（3.3.2）中加入200 µl洗脱缓冲液。向各样品中加入蛋白酶K和RNase，在摇床中37 °C、500 rpm条件下孵育30分钟，随后在65 °C、500 rpm条件下孵育4小时。
      注意：DNA纯化可使用 commercially available ChIP DNA Clean and Concentrator Kit38。

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结果

UKK测试系统中甲基汞暴露

采用H9胚胎体（EBs）进行细胞毒性检测，以获得甲基汞毒性的IC10值（细胞活力降低10%）（图1）。我们还开展了基于微阵列（Affymetrix平台）的生物标志物研究。将H9胚胎体暴露于甲基汞（0.25 和 1 µM）中持续14天。在第14天，使用TRIzol收集样品并提取RNA。采用人类全基因组U133 Plus 2.0芯片进行转录谱分析。数据分析使用Partek Genomic SuiteTM 6.6软件完成。通过主成分分析（图2A）、维恩图生成（图2B）和热图构建（图2C）获得初步数据概览。主成分分析反映了基因表达的整体分布情况，清晰地显示了1 µM甲基汞组与溶剂对照组及0.25 µM甲基汞组之间的分离（PC # 25.2）（图2A）。经过统计学处理（单因素方差分析）并对数据进行筛选（变化倍数阈值为±2，经多重校正的Benjamini-...

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讨论

传统的毒理学检测方法依赖于大量的动物实验，导致检测成本高昂且耗时。此外，由于物种间的差异，临床前动物安全性研究并不总能有效预测潜在药物对人体的毒性效应。尽管非人灵长类动物的预测性最强，但现代社会对开发灵敏且可靠的检测方法提出了日益强烈的伦理和社会经济要求 体外 测试 与人类安全相关的系统

人类胚胎干细胞（hESCs）具有分化为所有体细胞类型的独特能力，从而重现 体内 将人类发育过程与敏感的毒物基因组学方法相结合，已被提议作为传统药物安全性测试方法的替代方案6,21在“ESNATS”项目下，已开发出“UKK”测试系统，用于基于转录组学谱预测胚胎发育毒性。在该系统中，人胚胎干细胞（hESC）被诱导分化为类胚体，持续14天。获得的时间动力学转录组谱显示，在第14天，外胚层、内胚层和中胚层这三种胚层特异性分化标志物均呈现高表达，部分重现了早期人类胚胎发育过程。基于这些结果，已知的致畸药物在14天分化过程中被施加处理，并获得了差异表达基因谱。令人印象深刻的是，该测试系统能够预测人类中观察到的沙利度胺致畸效应相关的基因...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢 M. Kapitza、Margit Henry、Tamara Rotshteyn、Susan Rohani 和 Cornelia Böttinger 提供出色的技术支持。本工作得到了德国研究基金会（RTG 1331）和德国联邦教研部（BMBF）资助项目的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
DMEM/F-12Life Technologies11320082杜氏改良伊格尔培养基：营养混合物 F-12
KOSRLife Technologies10828028无血清替代物
GlutaMAXLife Technologies35050061GlutaMAX 添加剂
NEAALife Technologies11140050MEM 非必需氨基酸溶液
DPBSLife Technologies14190-0144杜氏磷酸盐缓冲液，不含钙，不含镁
mTeSR 培养基Stemcell Technologies5850
Pluronic F-127SigmaP2443-250G
V 型底板VWR734-0483微孔板，V 型底，96 孔，无菌，1 * 50 ST
V 型底板盖VWR634-0011微孔板盖，带冷凝环，1 * 50 ST
青霉素-链霉素（Pen/Strep）Life Technologies15140-122青霉素-链霉素溶液，液体
蒸馏水Life Technologies15230-089.无菌蒸馏水
人 FGF-2 (bFGF)MilliporeGF003AF-100UG碱性成纤维细胞生长因子，人重组型，无动物成分
0.22 μm 滤器MilliporeSCGPU02REStericup-GP，0.22 μm，聚醚砜膜，250 ml，辐射灭菌
StemPro EZPassageTM 一次性工具Invitrogen23181010
BD MatrigelTM，适用于 hESC 的基质Stemcell Technologies3542775 ml 小瓶
DMSOSigmaD-2650
RNA later 稳定溶液Life TechnologiesAM7020可稳定并保护未冷冻样品中的 RNA 完整性
70 μm 细胞筛Becton Dickinson352350带 70 μm 尼龙网的细胞筛
35 μm 筛盖，5 ml 管Becton Dickinson3522355 ml 聚苯乙烯圆底试管，带细胞筛盖（35 μm）
50 ml 无菌聚丙烯管Greiner Bio-One22726150 ml 聚丙烯锥底管，无菌
T75 培养瓶Greiner Bio-One658175CELLSTAR 带滤膜盖细胞培养瓶，75 cm2
TRIzolLife Technologies10296010
96 孔光学底板Thermo Scientific165305
CellTiter-BluePromegaG8081
AccutasePAAL11-007
转铁蛋白Sigma-AldrichT-2036
分散酶（Dispase）Worthington BiochemicalsLS002104
背维素（Dorsomorphin）Tocris Bioscience3093
EDTARoth8043.2
FBSPAAA15-101
FGF-2R&D Systems233-FB
明胶（Gelatine）Sigma-AldrichG1890-100G
葡萄糖Sigma-AldrichG7021-100G
GlutaMAXGibco Invitrogen35050-038
HEPESGibco Invitrogen15630-056
胰岛素Sigma-AldrichI-6634
Knockout DMEMGibco Invitrogen10829-018
MatrigelBD Biosciences354234
NogginR&D Systems719-NG
PBSBiochrom AGL1825
孕酮（Progesteron）Sigma-AldrichP7556
腐胺（Putrescine）Sigma-AldrichP-5780
ROCK 抑制剂 Y-27632Tocris Biosciences1254
SB431542Tocris Biosciences1614
SDSBio-Rad161-0416
硒（Selenium）Sigma-AldrichS-5261
β-巯基乙醇Gibco Invitrogen31350-010
[header]
试剂盒列表
RNeasy Mini Kit (250)QIAGEN74106
GeneChip 杂交、洗涤和染色试剂盒Affymetrix900721, 22, 23该试剂盒提供微阵列杂交、洗涤和染色所需的所有试剂
无 RNase 的 DNase 试剂盒QIAGEN79254
[header]
设备列表
倒置显微镜OlympusIX71
Genechip 杂交炉 - 645Affymetrix
Genechip 流体工作站-450Affymetrix
Affymetrix Gene-Chip 扫描仪-3000-7 GAffymetrix
Spectramax M5Molecular Devices
 
 
 
[header]
软件列表
Prism 4
Affymetrix GCOS
Partek Genomic Suite 6.25
功能注释在线工具
DAVID
Onto-tools 智能系统与生物信息学实验室

参考文献

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  36. Affymetrix GeneChip Operating Software. , Available from: http://www.affymetrix.com/estore/partners_programs/programs/developer/gcos_sdk/gcos_sdk_overview.affx#1_1 (2014).
  37. Partek Genomics Suite. , Available from: http://www.partek.com/pgs (2014).
  38. ChIP DNA Clean and Concentrator. , Available from: http://www.zymoresearch.com/dna/dna-clean-up/pcr-dna-clean-up-concentration/chip-dna-clean-concentrator (2014).
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基于人多能干细胞的发育毒性检测方法用于化学品安全性筛选及系统生物学数据生成
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