本方案描述了两种 体外 基于人类胚胎干细胞和转录组研究的发育毒性测试系统（UKK 和 UKN1）。这些测试系统可预测人类发育毒性的危害，有助于减少动物实验、降低成本以及化学安全性测试所需的时间。
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方法文章
基于人多能干细胞的发育毒性检测方法用于化学品安全性筛选及系统生物学数据生成
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
高效地将人类多能干细胞分化为各种组织的方案，结合组学技术，为 体外 潜在药物的毒性测试。为了为这类检测提供坚实的科学基础，通过系统生物学方法获取发育过程的时间动态及其潜在调控机制的定量信息至关重要。因此，本文针对这些需求优化了两种检测方法。在UKK测试系统中，人胚胎干细胞（hESC）（或其他多能干细胞）在类胚体中自发分化14天，以生成三个胚层来源的细胞。该系统可重现人类早期胚胎发育的关键阶段，若在分化过程中暴露于化学物质，则可预测人类特异性的早期胚胎毒性/致畸性。UKN1测试系统基于hESC向神经外胚层前体（NEP）细胞群体分化6天的过程，可模拟早期神经发育，并预测化学物质引发的早期发育神经毒性和表观遗传改变。这两种系统结合转录组微阵列研究，均适用于毒性生物标志物的鉴定。此外，它们可联合使用，为系统生物学分析提供输入数据。相较于依赖大量实验动物的传统毒理学研究，这些检测系统具有显著优势，有助于降低药物研发和化学品安全性评价的成本。两者的联合应用尤其有助于揭示可能特异性影响神经发育的化合物的作用机制。
引言
人类胚胎干细胞（hESC）能够分化为多种类型细胞的能力开启了一个新时代 体外 毒性测试1疾病建模与再生医学2干细胞具有自我复制、维持其多能状态以及分化为特化细胞的能力。3,4人类胚胎干细胞（hESC）具有分化为所有主要细胞类型的潜能，这一特性也存在于其他人类多能干细胞中，例如人类诱导多能干细胞（hiPSC）或通过核移植技术获得的细胞。5例如，许多不同的人胚胎干细胞系已被分化为神经元6，肾细胞7，神经嵴细胞8心肌细胞9-12或类似肝细胞的细胞13,14此外，人胚胎干细胞（hESC）可自发分化为三个胚层的各种细胞15-18 在类胚体（EBs）中19,20早期胚胎发育受到与不同胚层相关基因差异表达的调控，这种差异表达已通过微阵列技术的转录组学在mRNA水平上得到检测。15这些努力促成了基于人胚胎干细胞/人诱导多能干细胞及转录组学分析的器官特异性毒理学模型的建立（综述见 21,22）。这些模型相较于传统毒理学研究中使用的实验动物具有优势，因为利用实验动物进行的临床前研究并不总能准确预测药物对人体的安全性。在患者中观察到的药物诱导毒性通常与人类和实验动物之间不同的代谢或信号传导过程相关。物种差异导致难以可靠地早期检测出对人体的发育毒性，例如沙....
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方案
以下实验方案使用人胚胎干细胞系（hESC）H9 进行。该细胞系常规培养于经有丝分裂失活的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）上，培养基为人胚胎干细胞培养基，并添加 bFGF；随后将细胞转移至涂有基底膜基质（如 Matrigel）的 6 cm 培养皿中，使用干细胞培养基培养，以去除 MEFs。选取融合度超过 >80% 的 H9 细胞进行后续传代。培养在基底膜基质包被培养皿上的 H9 细胞用于拟胚体（EBs）的形成。本方案中提及的所有操作均按照无菌操作和良好细胞培养规范的标准方法进行。
第1部分. UKK测试系统
1. 人类胚胎干细胞培养
- 在饲养细胞上进行H9细胞的传代与维持
- 用移液器将2 ml 0.1%明胶加入每个6 cm培养皿中，在细胞培养箱（37 °C、5% CO2）中孵育30分钟。使用无菌巴斯德吸管吸除明胶溶液。
- 在两个经明胶包被的培养皿中各加入2 ml含有0.1 × 106 MEF细胞/ml的MEF培养基，并在细胞培养箱（37 °C、5% CO2）中过夜孵育。
- 次日，使用镊子从液氮储存罐中取出H9细胞冻存管，用长柄镊子在37 °C水浴中解冻。
- 将冻存管从水浴中取出，用7....
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结果
UKK测试系统中甲基汞暴露
采用H9胚胎体（EBs）进行细胞毒性检测，以获得甲基汞毒性的IC10值（细胞活力降低10%）（图1）。我们还开展了基于微阵列（Affymetrix平台）的生物标志物研究。将H9胚胎体暴露于甲基汞（0.25 和 1 µM）中持续14天。在第14天，使用TRIzol收集样品并提取RNA。采用人类全基因组U133 Plus 2.0芯片进行转录谱分析。数据分析使用Partek Genomic SuiteTM 6.6软件完成。通过主成分分析（图2A）、维恩图生成（图2B）和热图构建（图2C）获得初步数据概览。主成分分析反映了基因表达的整体分布情况，清晰地显示了1 µM甲基汞组与溶剂对照组及0.25 µM甲基汞组之间的分离（PC # 25.2）（图2A）。经过统计学处理（单因素方差分析）并对数据进行筛选（变化倍数阈值为±2，经多重校正的Benjamini-.......
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讨论
传统的毒理学检测方法依赖于大量的动物实验，导致检测成本高昂且耗时。此外，由于物种间的差异，临床前动物安全性研究并不总能有效预测潜在药物对人体的毒性效应。尽管非人灵长类动物的预测性最强，但现代社会对开发灵敏且可靠的检测方法提出了日益强烈的伦理和社会经济要求 体外 测试 与人类安全相关的系统
人类胚胎干细胞（hESCs）具有分化为所有体细胞类型的独特能力，从而重现 体内 将人类发育过程与敏感的毒物基因组学方法相结合，已被提议作为传统药物安全性测试方法的替代方案6,21在“ESNATS”项目下，已开发出“UKK”测试系统，用于基于转录组学谱预测胚胎发育毒性。在该系统中，人胚胎干细胞（hESC）被诱导分化为类胚体，持续14天。获得的时间动力学转录组谱显示，在第14天，外胚层、内胚层和中胚层这三种胚层特异性分化标志物均呈现高表达，部分重现了早期人类胚胎发育过程。基于这些结果，已知的致畸药物在14天分化过程中被施加处理，并获得了差异表达基因谱。令人印象深刻的是，该测试系统能够预测人类中观察到的沙利度胺致畸效应相关的基因.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢 M. Kapitza、Margit Henry、Tamara Rotshteyn、Susan Rohani 和 Cornelia Böttinger 提供出色的技术支持。本工作得到了德国研究基金会（RTG 1331）和德国联邦教研部（BMBF）资助项目的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 11320082 | 杜氏改良伊格尔培养基：营养混合物 F-12 |
| KOSR | Life Technologies | 10828028 | 无血清替代物 |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050061 | GlutaMAX 添加剂 |
| NEAA | Life Technologies | 11140050 | MEM 非必需氨基酸溶液 |
| DPBS | Life Technologies | 14190-0144 | 杜氏磷酸盐缓冲液，不含钙，不含镁 |
| mTeSR 培养基 | Stemcell Technologies | 5850 | |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443-250G | |
| V 型底板 | VWR | 734-0483 | 微孔板，V 型底，96 孔，无菌，1 * 50 ST |
| V 型底板盖 | VWR | 634-0011 | 微孔板盖，带冷凝环，1 * 50 ST |
| 青霉素-链霉素（Pen/Strep） | Life Technologies | 15140-122 | 青霉素-链霉素溶液，液体 |
| 蒸馏水 | Life Technologies | 15230-089. | 无菌蒸馏水 |
| 人 FGF-2 (bFGF) | Millipore | GF003AF-100UG | 碱性成纤维细胞生长因子，人重组型，无动物成分 |
| 0.22 μm 滤器 | Millipore | SCGPU02RE | Stericup-GP，0.22 μm，聚醚砜膜，250 ml，辐射灭菌 |
| StemPro EZPassageTM 一次性工具 | Invitrogen | 23181010 | |
| BD MatrigelTM，适用于 hESC 的基质 | Stemcell Technologies | 354277 | 5 ml 小瓶 |
| DMSO | Sigma | D-2650 | |
| RNA later 稳定溶液 | Life Technologies | AM7020 | 可稳定并保护未冷冻样品中的 RNA 完整性 |
| 70 μm 细胞筛 | Becton Dickinson | 352350 | 带 70 μm 尼龙网的细胞筛 |
| 35 μm 筛盖，5 ml 管 | Becton Dickinson | 352235 | 5 ml 聚苯乙烯圆底试管，带细胞筛盖（35 μm） |
| 50 ml 无菌聚丙烯管 | Greiner Bio-One | 227261 | 50 ml 聚丙烯锥底管，无菌 |
| T75 培养瓶 | Greiner Bio-One | 658175 | CELLSTAR 带滤膜盖细胞培养瓶，75 cm2 |
| TRIzol | Life Technologies | 10296010 | |
| 96 孔光学底板 | Thermo Scientific | 165305 | |
| CellTiter-Blue | Promega | G8081 | |
| Accutase | PAA | L11-007 | |
| 转铁蛋白 | Sigma-Aldrich | T-2036 | |
| 分散酶（Dispase） | Worthington Biochemicals | LS002104 | |
| 背维素（Dorsomorphin） | Tocris Bioscience | 3093 | |
| EDTA | Roth | 8043.2 | |
| FBS | PAA | A15-101 | |
| FGF-2 | R&D Systems | 233-FB | |
| 明胶（Gelatine） | Sigma-Aldrich | G1890-100G | |
| 葡萄糖 | Sigma-Aldrich | G7021-100G | |
| GlutaMAX | Gibco Invitrogen | 35050-038 | |
| HEPES | Gibco Invitrogen | 15630-056 | |
| 胰岛素 | Sigma-Aldrich | I-6634 | |
| Knockout DMEM | Gibco Invitrogen | 10829-018 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | |
| Noggin | R&D Systems | 719-NG | |
| PBS | Biochrom AG | L1825 | |
| 孕酮（Progesteron） | Sigma-Aldrich | P7556 | |
| 腐胺（Putrescine） | Sigma-Aldrich | P-5780 | |
| ROCK 抑制剂 Y-27632 | Tocris Biosciences | 1254 | |
| SB431542 | Tocris Biosciences | 1614 | |
| SDS | Bio-Rad | 161-0416 | |
| 硒（Selenium） | Sigma-Aldrich | S-5261 | |
| β-巯基乙醇 | Gibco Invitrogen | 31350-010 | |
| [header] | |||
| 试剂盒列表 | |||
| RNeasy Mini Kit (250) | QIAGEN | 74106 | |
| GeneChip 杂交、洗涤和染色试剂盒 | Affymetrix | 900721, 22, 23 | 该试剂盒提供微阵列杂交、洗涤和染色所需的所有试剂 |
| 无 RNase 的 DNase 试剂盒 | QIAGEN | 79254 | |
| [header] | |||
| 设备列表 | |||
| 倒置显微镜 | Olympus | IX71 | |
| Genechip 杂交炉 - 645 | Affymetrix | ||
| Genechip 流体工作站-450 | Affymetrix | ||
| Affymetrix Gene-Chip 扫描仪-3000-7 G | Affymetrix | ||
| Spectramax M5 | Molecular Devices | ||
| [header] | |||
| 软件列表 | |||
| Prism 4 | |||
| Affymetrix GCOS | |||
| Partek Genomic Suite 6.25 | |||
| 功能注释在线工具 DAVID Onto-tools 智能系统与生物信息学实验室 |
参考文献
- Liu, W. W., Deng, Y. G., Liu, Y., Gong, W. R., Deng, W. B. Stem Cell Models for Drug Discovery and Toxicology Studies. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 27 (1), 17-27 (2013).
- Zuba-Surma, E. K., Jozkowicz, A., Dulak, J. Stem Cells in Pharmaceut....
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重印与许可
