我们介绍了两种用于可视化和定量分析小鼠模型海马中树突分支的方法：实时成像和扩展景深成像。前者可实现复杂的拓扑追踪，并对分支程度进行定量分析，后者则能够快速可视化树突树结构。
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本文内容
摘要
摘要
树突分支已被证明是评估神经元结构和功能完整性的可靠指标。事实上，树突分支的复杂性和延伸范围与这些细胞的突触可塑性密切相关。为了表征神经系统疾病对这些结构的有害影响，并确定治疗干预的效果，迫切需要一种可靠的树突分支评估方法。然而，由于树突结构复杂且具有动态特性，其定量分析一直是一项艰巨的任务。幸运的是，先进的成像技术可与传统的染色方法相结合，用于评估树突分支状态，从而提供一种更可靠且高效的评估手段。以下是将这些成像技术与染色方法结合使用，以表征野生型小鼠树突分支的一个示例。这些互补的成像方法可用于对海马区较广泛区域内分布的树突分支进行定性和定量评估。
引言
突触数量和结构的动态变化是发育、衰老以及多种神经退行性疾病的重要特征1-3。神经元接收和整合突触信息的能力依赖于树突形态以及突触连接的动态变化。事实上，树突棘数量与突触数量之间存在正相关关系，二者均影响认知功能4。因此，树突棘数量的减少与多种神经系统疾病中的认知功能障碍相关联也就不足为奇5-7，这促使研究者对树突棘的定量分析产生了极大兴趣。然而，树突棘密度的定量仍是一项耗时且繁琐的任务，难以提供有关突触在树突树上拓扑结构和分布情况的有用信息。幸运的是，染色方法（例如，高尔基-考克斯染色法和双皮质素（DCX）染色）结合先进的成像技术，可用于克服当前的技术障碍，可靠且高效地获得高分辨率的树突分支图像。虽然高尔基-考克斯染色法可用于评估所有神经元的树突分支状态8，但DCX可用于特异性标记新生成的神经元，尤其是在齿状回和脑室下区9，这一点尤为重要，因为神经发生在这两个脑区持续终生10,11。
染色后，采用两种成像方法评估树突特征：i）实时成像（RTI）和ii）扩展景深成像（EDFI）。RTI技术可用于追踪并量化单个树突节段及分支上分支的长度和分级顺序，从而估算每棵树突树所占据的总面积和体积。. 更具体而言，在RTI方法中，用户需持续识别片段并反复重新对焦，同时神经元追踪软件采集树突结构的x、y和z坐标，并在三维空间中重建其轨迹。相比之下，EDFI方法则提供了一种更为简便快捷的手段，用于评估较厚组织样本中的树突密度，其通过生成一幅复合图像，提供沿整个z轴的信息。具体操作中，用户需记录贯穿组织切片厚度的高清视频文件，随后利用软件搜索视频帧，识别出像素完全聚焦的点位。随后，将这些聚焦的像素合并并整合为一幅高分辨率的复合二维图像。该复合图像包含所有在z轴任意位置上曾处于聚焦状态的像素。随后可对这些二维图像进行定性和定量分析，以确定每个视野中树突分支的密度。
最后，我们介绍一种全景式方法，用于生成极高分辨率的图像，以对整个感兴趣区域内的树突进行分析和评估。该方法可用于克服无法获得高分辨率且昂贵的数码相机的局限。使用此技术时，需沿x轴和y轴在不同位置连续拍摄多幅图像，然后利用免费软件（例如，Image Composite Editor）自动将这些图像拼接在一起。值得注意的是，该方法可用于对较广泛区域内的树突分支进行定性和定量评估。
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方案
注意：实验均按照退伍军人事务帕洛阿尔托医疗保健系统动物研究委员会批准的伦理标准进行。
1. 高尔基-考克斯染色
- 大脑提取与染色
- 第1天，使用100 mg/kg氯胺酮和10 mg/kg赛拉嗪深度麻醉小鼠，随后通过放血法处死。
- 小心移除颅骨并解剖出脑组织。
- 首先去除颅骨顶部的皮肤，将弯剪置于小脑顶部，剪尖朝外，沿中央沟平行方向轻轻剪开颅骨，向嗅球方向移动。在两侧重复此操作。
- 使用手术镊提起颅骨，同时将其朝向嗅球方向翻转并折断。然后，将颅骨倒置，用解剖针切断视神经并松解脑组织。最后，用解剖针在枕骨大孔水平将脑组织与脊髓分离。
- 立即将脑组织浸入15 ml市售未稀释的高尔基-考克斯（Golgi-Cox）溶液中。将脑组织置于带盖的20 ml玻璃瓶内，加入高尔基溶液，于室温避光保存。
- 第2天，缓慢倒出溶液，加入15 ml新鲜的Golgi-Cox溶液。盖紧装有脑组织的瓶子，于避光条件下静置，继续孵育9天。
- 切片与包埋
- 第11天，将脑组织置于用ddH₂O配制的30%蔗糖溶液中2O 表示脱水。12 小时后更换为新配制的 30% 蔗糖溶液。将脑组织在 30% 蔗糖溶液中于 4 °C 孵育 3 天。
- 第14天，用30%蔗糖溶液填充振动切片机的储液槽，直至刀片完全浸没。将切片速度设为1 mm/s，振幅设为0.95 mm。
- 用Kimwipe擦拭脑组织以去除多余水分，并使用剃刀片进行冠状切面切割以去除小脑。
- 用超级胶水将整个大脑牢固地固定在振动切片机平台上，静置 2-4 分钟使其凝固。将附着大脑的平台放入储液槽中，并调整刀片至大脑顶部。
- 使用振动切片机在室温下将脑组织切成150 µm厚的切片，注意每处理3个脑组织后更换一次刀片。
- 使用细头毛笔从储液槽中拾取切片，并将其浸入 含0.3%明胶的培养皿，明胶以ddH₂O配制2O. 当切片仍在培养皿中时，向每张载玻片上加入0.5 ml的0.3%明胶，并用刷子涂抹均匀，覆盖SuperFrost+载玻片表面。
- 轻轻从培养皿中取出浸没的切片，将其放置在明胶包被的载玻片上。通过仅接触切片侧面而非顶部的方式，调整脑切片的方向。
- 约十分钟后，在组织完全干燥前用30%蔗糖覆盖切片。然后将制备好的载玻片置于暗处的载玻片架中，风干3天。
- 将市售的10倍浓缩显影液用ddH₂O稀释至1倍浓度2O. 将切片浸入显色液中孵育7-10分钟，用ddH₂O冲洗切片3次。2O.
- 脱水
- 配制20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%和95%的乙醇溶液，使用蒸馏ddH₂O2O.
- 将载玻片依次浸入浓度逐渐升高的乙醇溶液中，每种浓度浸泡10分钟。
- 将载玻片浸入100%乙醇溶液中，每次10分钟，共3次。
- 将载玻片浸入100%二甲苯中，连续处理3次，每次5分钟，使切片在最后一次溶液中保留，直至盖片。
- 使用塑料移液管在每张载玻片上加入足量的DPX封片剂（邻苯二甲酸二丁酯溶于二甲苯，约1-1.5 ml）。小心加盖盖玻片，避免产生气泡。
- 将已加盖玻片的脑切片水平放置，风干3天。
2. 双皮质素染色
- 深度麻醉动物（参见步骤 1.1.1）。
- 使用新配制的含磷酸盐缓冲液的 4% 多聚甲醛进行心脏灌注12。
- 取出脑组织（参见 1.1.2），置于 45 ml 4% 多聚甲醛中，在 4 °C 条件下于摇床上过夜保存。
- 将脑组织转移至 30% 蔗糖溶液中，在 4 °C 下静置 48 小时以完成脱水。从蔗糖溶液中取出脑组织，直接放置于置于干冰上的铜块上。
- 用最佳切割温度（OCT）包埋剂填充模具，并以嗅球为解剖标志标记脑组织的方向。
- 使用冷冻切片机在 -20 ºC 下切出 70 微米厚的切片，将切片置于冷冻保护液（25% 乙二醇、25% 甘油溶于 0.05 M 磷酸钠缓冲液，pH 7.4）中，并在 -20 °C 保存至使用。
- 配制 50% 冷冻保护液与 50% 甲醇的混合溶液，在其中加入 0.5%（体积比）过氧化氢。将漂浮切片在室温下孵育 30 分钟。
- 将切片置于组织学烘箱中，在 37 ºC 的 TBS（Tris 缓冲盐水）中预热 30–40 分钟。
- 在免疫染色前，将切片在室温下用含 0.3% Triton 和 3% 正常马血清的溶液孵育 45 分钟。随后将切片在含有 0.3% Triton 和 1% 正常马血清的 TBS 溶液中，与 DCX 抗体以 1:500 比例稀释后于 4 ºC 过夜孵育，每份使用 3 ml 溶液。
- 次日，用 TBS 溶液连续洗涤切片三次，每次 10 分钟。
- 将切片在室温下与生物素标记的马抗山羊二抗（1:200 稀释于 TBS）孵育 2 小时，随后用 TBS 溶液连续洗涤三次，每次 10 分钟。
- 将切片在室温下与 ABC Lite（1:1,000 稀释）孵育 1.5 小时。
- 将一片 10 mg DAB（3,3”-二氨基联苯胺）溶于 15 ml 1 M Tris-HCl（pH 7.6）溶液中，加入 5 µl 30% H2O2。立即在此溶液中孵育切片 5 分钟。
- 用冰冻 TBS 洗涤三次终止反应，再用室温 TBS 洗涤一次。
- 依次使用系列乙醇溶液（50%、60%、70%、80%、90%、95%、100%，每次 5 分钟）脱水，二甲苯透明，然后参照步骤 1.3 使用 DPX 封片。
3. 可视化
- 切片完全干燥后，移除 用锋利的刀片刮去载玻片表面多余的DPX，然后将其置于显微镜的扫描载物台上。该系统由配备扫描载物台、操纵杆和彩色12位相机的显微镜组成。
- 启动程序。打开一个新的数据文件。
- 在屏幕任意位置单击鼠标指针以放置参考点。这将激活程序窗口工具面板中的所有图标。
- 单击工具栏上的“Joystick Free”图标，然后使用操纵杆在第一部分中定位海马体的齿状回。
- 在程序窗口的“工具”选项卡中，选择“连续切片管理器”。单击窗口左下角的“新建切片”图标，此时将打开“连续切片设置”窗口。
- 选择连续切片设置窗口，然后输入包含海马区域的切片总数。选择评估间隔。输入切片厚度（DCX 染色切片为 70 µm，Golgi 染色切片为 150 µm）。
- 通过点击工具栏中的“Freehand Contour Drawing”图标，开始勾画齿状回区域。勾勒出齿状回颗粒细胞层的轮廓。
- 选择“100X” "放大倍数" 菜单。在切片上滴加一滴浸油，将物镜切换至100倍。在此物镜下定位齿状回颗粒细胞胞体及其树突。
- 聚焦于选定的神经元，点击工具栏上的“Neuron Tracing”图标。描记齿状回颗粒细胞胞体的轮廓。完成描记后，单击右键选择“Finish Cell Body”。
- 在x、y和z方向上手动追踪树突，使用操纵杆和z轴电机旋钮逐段跟踪每一分支。在分支点或三分叉节点处，右键单击并从下拉菜单中选择相应选项。追踪由这些节点产生的每一分支。在每一分支末端，右键单击并从下拉菜单中选择“终止”。
- 在软件窗口中使用箭头键图标随机选择另一个齿状回颗粒细胞，并按照步骤 3.9–3.10 所述相同程序进行操作。保存完整的追踪结果。
- 启动神经元示踪软件。
- 打开实验组第一只小鼠的第一个 NRX 数据文件。接着添加该组第二只小鼠的 NRX 文件。依次继续，直至该组所有 NRX 文件均被添加。
- 在“分析”选项卡下，选择“Fan In-示意图”。这将打开 Fan In-分析窗口。勾选“树突”，然后点击“显示”，即可呈现该组小鼠树突的长度和分支模式图1).
4. EDFI
注意：该方法可使用户快速记录每个视野在 z 轴方向上的大量图像，并生成一幅包含 z 轴全程中所有聚焦像素的二维图像。最终结果是一幅由采集到的图像中所有聚焦像素组成的复合图像。
- 将显微镜连接至数码相机。先将切片放置在与显微镜相连的扫描载物台上，然后切换至10X物镜。移动载物台至目标区域。
- 启动视频采集程序。
- 按下录制按钮。一旦开始录制，立即使用宏观调焦旋钮在4秒内从切片顶部移动到底部。保存生成的视频文件。
- 使用ImageJ免费软件打开AVI视频文件，并将其另存为未压缩格式，以转换为未压缩的文件格式。
- 启动图像分析程序并打开AVI文件。进入“Process”菜单，点击“Extended Depth of Field”。选择相应的视频文件。在“Output”选项中，选择“Generate Composite Best-Focus Image”。
- 在“Focus Analysis”选项中，选择“Normalized Illumination”和“Max Local Contrast”选项。然后选择“Create”。生成的图像表示在整个z轴范围内所有处于最佳焦距的像素（图2）。
- 保存生成的图像。
5. 生成极高分辨率图像
注意：此方法可让用户以自动化方式，从高倍率高分辨率图像自动生成低倍率且极高分辨率的图像。
- 将切片首先放置在与显微镜相连的扫描台上。显微镜连接有数字相机。移动载物台至目标区域。
- 启动图像采集程序。
- 使用10倍物镜，对目标区域采集并保存高分辨率（4076 × 3116）图像，确保相邻图像之间至少有10%的重叠。
- 运行图像拼接软件（Image Composite Editor）进行图像拼接。
- 进入“文件”菜单，点击“新建全景图”。选择存储图像的文件夹，选中属于同一区域的图像，然后点击“确定”。
- 点击“导出到磁盘”按钮并保存图像。该图像即为所选区域的超高清分辨率图像，可用于后续分析和/或展示（图3）。
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结果
使用Golgi-Cox染色或DCX染色方法，在野生型小鼠中分析了现存及新生齿状回颗粒细胞树突分支的程度（图1）。DCX阳性细胞的树突节段长度为13–36微米。采用Kolmogorov-Smirnov检验分析树突长度的正态分布情况（D = 0.1217，p <0.01，Liliefors p <0.001；图4和图5）。
在对分支级次中各节段长度的分析中，发现第一级分支的节段最长（38.38 ± 1.45 µm）。表面（111.98 ± 3.93 平方微米）和体积（27.93 ± 1.03 立方微米）也呈现出类似模式。 µm）。还检验了片段长度与其占据的表面积和/或体积之间的线性相关性。表面积（p = 0.001，r2 = 0.873）和体积（p = 0.001，r2 与每个树突节段的长度呈显著相关（= 0.621）。
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讨论
本文介绍了两种利用常规染色方法结合RTI和EDFI来定量分析成熟神经元和新生神经元树突分支程度的方法。获取神经元的高分辨率图像为检测神经退行性疾病的有害效应提供了极为有效的方法，同时也为评估针对海马神经元的治疗策略提供了手段。
尽管RTI方法被用于获取有关分支程度和拓扑结构的深入数据，但EDFI方法无法提供有关单个树突段或神经元树突结构复杂性的信息。然而，EDFI方法的优势在于无需购买昂贵的硬件设备，且耗时较少。
使用图像分析程序对视频文件进行扩展景深成像（EDFI）。借助高分辨率和高速摄像机，可采集每个视野厚度方向上大量图像，生成真实反映x、y和z三维空间信息的图像。EDFI方法的一个局限在于，在z轴不同焦平面上可能存在多个像素（相同的x和y坐标）同时处于聚焦状态。为此设想一种方法，通过为这些像素分配不同颜色，以在二维图像中精确呈现三维轮廓的范围。需要注意的是，EDFI方法也可用于细胞轮廓的分析。例如、突触、小胶质细胞和星形胶质细胞）。此外，该方法还可用于分析小胶质细胞在组织切片厚度方向上分布的范围
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披露
本文的出版费用由 MBF Bioscience 资助。
致谢
本研究得到了LuMind基金会、Research Down Syndrome基金会和阿尔茨海默病协会（AS）资助。CP部分得到了阿肯色州立大学护理与健康专业学院教师发展基金的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 改良高尔基-考克斯染色液 | Weill Cornell Medical College | NA | 4°C 保存至使用 |
| 1x 显影液（10x 储存液） | Weill Cornell Medical College | NA | 4°C 保存至使用 |
| 30% 蔗糖 | Sigma | CAS # 57-50-1 | 使用前新鲜配制 于 ddH2O 中 |
| 0.3% 明胶 | Sigma | CAS # 9000-70-8 | NA |
| 梯度乙醇溶液（20%、30%、40%、50%、80%、90%、95%、100%） | Sigma | CAS 603-003-00-5 | NA |
| 二甲苯 | Sigma | CAS # 1330-20-7 | NA |
| DPX 封片剂 | EMS | #13510 | NA |
| Superfrost (+) 白片 | Electron Microscopy Sciences | 71869-10 | NA |
| 盖玻片 22x50mm（VWR #48393-059） | VWR | #4811-703 | NA |
| DCX 抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-8066 | 4°C |
| DAB | Sigma | CAS 编号 91-95-2 | -20°C |
| OCT 包埋剂 | Tissue-tek | 4583 | NA |
| Tris | Sigma | CAS 编号 77-86-1 | NA |
| ABC Lite | Vector | PK4000 | NA |
| 显微镜 | Nikon | Eclipse 80i | |
| 数码相机 | Nikon | DS-Ri1 | |
| 12 位相机 | QImaging | 01 MBF2000RF-CLR-12 | |
| Neurolucida 系统 | MBF Bioscience | V.10 | |
| 图像合成编辑器 | Microsoft | 1.4.4.0 | |
| NIS 元素软件 | Nikon | F 3.0 | |
| Image Pro Plus | Mediacy | 版本 7.00 |
参考文献
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重印与许可
