我们介绍了两种用于可视化和定量分析小鼠模型海马中树突分支的方法：实时成像和扩展景深成像。前者可实现复杂的拓扑追踪，并对分支程度进行定量分析，后者则能够快速可视化树突树结构。
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本文内容
摘要
摘要
树突分支已被证明是评估神经元结构和功能完整性的可靠指标。事实上，树突分支的复杂性和延伸范围与这些细胞的突触可塑性密切相关。为了表征神经系统疾病对这些结构的有害影响，并确定治疗干预的效果，迫切需要一种可靠的树突分支评估方法。然而，由于树突结构复杂且具有动态特性，其定量分析一直是一项艰巨的任务。幸运的是，先进的成像技术可与传统的染色方法相结合，用于评估树突分支状态，从而提供一种更可靠且高效的评估手段。以下是将这些成像技术与染色方法结合使用，以表征野生型小鼠树突分支的一个示例。这些互补的成像方法可用于对海马区较广泛区域内分布的树突分支进行定性和定量评估。
引言
突触数量和结构的动态变化是发育、衰老以及多种神经退行性疾病的重要特征1-3。神经元接收和整合突触信息的能力依赖于树突形态以及突触连接的动态变化。事实上，树突棘数量与突触数量之间存在正相关关系，二者均影响认知功能4。因此，树突棘数量的减少与多种神经系统疾病中的认知功能障碍相关联也就不足为奇5-7，这促使研究者对树突棘的定量分析产生了极大兴趣。然而，树突棘密度的定量仍是一项耗时且繁琐的任务，难以提供有关突触在树突树上拓扑结构和分布情况的有用信息。幸运的是，染色方法（例如，高尔基-考克斯染色法和双皮质素（DCX）染色）结合先进的成像技术，可用于克服当前的技术障碍，可靠且高效地获得高分辨率的树突分支图像。虽然高尔基-考克斯染色法可用于评估所有神经元的树突分支状态8，但DCX可用于特异性标记新生成的神经元，尤其是在齿状回和脑室下区9，这一点尤为重要，因为神经发生在这两个脑区持续终生10,11。
染色后，采用两种成像方法评估树突特征：i）实时成像（RTI）和ii）扩展景深成像（EDFI）。RTI技术可用于追踪并量化单个树突节段及分支上分支的长度和分级顺序，从而估算每棵树突树所占据的总面积和体积。. 更具体而言，在RTI方法中，用户需持续识别片段并反复重新对焦，同时神经元追踪软件采集树突结构的x、y和z坐标，....
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方案
注意：实验均按照退伍军人事务帕洛阿尔托医疗保健系统动物研究委员会批准的伦理标准进行。
1. 高尔基-考克斯染色
- 大脑提取与染色
- 第1天，使用100 mg/kg氯胺酮和10 mg/kg赛拉嗪深度麻醉小鼠，随后通过放血法处死。
- 小心移除颅骨并解剖出脑组织。
- 首先去除颅骨顶部的皮肤，将弯剪置于小脑顶部，剪尖朝外，沿中央沟平行方向轻轻剪开颅骨，向嗅球方向移动。在两侧重复此操作。
- 使用手术镊提起颅骨，同时将其朝向嗅球方向翻转并折断。然后，将颅骨倒置，用解剖针切断视神经并松解脑组织。最后，用解剖针在枕骨大孔水平将脑组织与脊髓分离。
- 立即将脑组织浸入15 ml市售未稀释的高尔基-考克斯（Golgi-Cox）溶液中。将脑组织置于带盖的20 ml玻璃瓶内，加入高尔基溶液，于室温避光保存。
- 第2天，缓慢倒出溶液，加入15 ml新鲜的Golgi-Cox溶液。盖紧装有脑组织的瓶子，于避光条件下静置，继续孵育9天。
- 切片与包埋
- 第11天，将脑组织置于用ddH₂O配制的30%蔗糖溶液中2O 表示脱水。12 小时后更换为新配制的 30% 蔗糖溶液。将脑组织在 30% 蔗糖溶液中于 4 °C 孵育 3 天。 ....
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结果
使用Golgi-Cox染色或DCX染色方法，在野生型小鼠中分析了现存及新生齿状回颗粒细胞树突分支的程度（图1）。DCX阳性细胞的树突节段长度为13–36微米。采用Kolmogorov-Smirnov检验分析树突长度的正态分布情况（D = 0.1217，p <0.01，Liliefors p <0.001；图4和图5）。
在对分支级次中各节段长度的分析中，发现第一级分支的节段最长（38.38 ± 1.45 µm）。表面（111.98 ± 3.93 平方微米）和体积（27.93 ± 1.03 立方微米）也呈现出类似模式。 µm）。还检验了片段长度与其占据的表面积和/或体积之间的线性相关性。表面积（p = 0.001，r2 = 0.873）和体积（p = 0.001，r2 与每个树突节段的长度呈显著相关（= 0.621）。
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讨论
本文介绍了两种利用常规染色方法结合RTI和EDFI来定量分析成熟神经元和新生神经元树突分支程度的方法。获取神经元的高分辨率图像为检测神经退行性疾病的有害效应提供了极为有效的方法，同时也为评估针对海马神经元的治疗策略提供了手段。
尽管RTI方法被用于获取有关分支程度和拓扑结构的深入数据，但EDFI方法无法提供有关单个树突段或神经元树突结构复杂性的信息。然而，EDFI方法的优势在于无需购买昂贵的硬件设备，且耗时较少。
使用图像分析程序对视频文件进行扩展景深成像（EDFI）。借助高分辨率和高速摄像机，可采集每个视野厚度方向上大量图像，生成真实反映x、y和z三维空间信息的图像。EDFI方法的一个局限在于，在z轴不同焦平面上可能存在多个像素（相同的x和y坐标）同时处于聚焦状态。为此设想一种方法，通过为这些像素分配不同颜色，以在二维图像中精确呈现三维轮廓的范围。需要注意的是，EDFI方法也可用于细胞轮廓的分析。例如、突触、小胶质细胞和星形胶质细胞）。此外，该方法还可用于分析小胶质细胞在组织切片厚度方向上分布的范围
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披露
本文的出版费用由 MBF Bioscience 资助。
致谢
本研究得到了LuMind基金会、Research Down Syndrome基金会和阿尔茨海默病协会（AS）资助。CP部分得到了阿肯色州立大学护理与健康专业学院教师发展基金的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 改良高尔基-考克斯染色液 | Weill Cornell Medical College | NA | 4°C 保存至使用 |
| 1x 显影液（10x 储存液） | Weill Cornell Medical College | NA | 4°C 保存至使用 |
| 30% 蔗糖 | Sigma | CAS # 57-50-1 | 使用前新鲜配制 于 ddH2O 中 |
| 0.3% 明胶 | Sigma | CAS # 9000-70-8 | NA |
| 梯度乙醇溶液（20%、30%、40%、50%、80%、90%、95%、100%） | Sigma | CAS 603-003-00-5 | NA |
| 二甲苯 | Sigma | CAS # 1330-20-7 | NA |
| DPX 封片剂 | EMS | #13510 | NA |
| Superfrost (+) 白片 | Electron Microscopy Sciences | 71869-10 | NA |
| 盖玻片 22x50mm（VWR #48393-059） | VWR | #4811-703 | NA |
| DCX 抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-8066 | 4°C |
| DAB | Sigma | CAS 编号 91-95-2 | -20°C |
| OCT 包埋剂 | Tissue-tek | 4583 | NA |
| Tris | Sigma | CAS 编号 77-86-1 | NA |
| ABC Lite | Vector | PK4000 | NA |
| 显微镜 | Nikon | Eclipse 80i | |
| 数码相机 | Nikon | DS-Ri1 | |
| 12 位相机 | QImaging | 01 MBF2000RF-CLR-12 | |
| Neurolucida 系统 | MBF Bioscience | V.10 | |
| 图像合成编辑器 | Microsoft | 1.4.4.0 | |
| NIS 元素软件 | Nikon | F 3.0 | |
| Image Pro Plus | Mediacy | 版本 7.00 |
参考文献
- Bosch, M., Hayashi, Y. Structural plasticity of dendritic spines. Curr Opin Neurobiol. 22 (3), 383-388 (2012).
- Isaac, J. T. The synapse: center stage for many brain diseases. The Journal of Physiology. 587 (4), 727-729 (2009).
- Sheng, M., Sabatini, B. L., Südhof, T. ....
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重印与许可
