本方案描述了一种使用基因修饰的可注射类器官进行细胞移植的技术。细胞类器官在微图案化培养板上培养，并通过聚plex纳米胶束导入基因后回收。该系统可在移植到宿主动物体内后，使细胞维持其固有功能的同时实现外源基因的长期表达。
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本文内容
摘要
摘要
为了提高细胞移植的治疗效果，开发了一种可注射的基因修饰球状体移植系统。该细胞球状体在涂有温敏性聚合物的微图案化培养板构成的培养系统中制备而成。在培养板上，对应于直径为100 µm的细胞黏附区域，以二维方式规则排列形成多个球状体，周围则被聚乙二醇（PEG）基质包被的非黏附区域所包围。通过降低培养板温度，可轻松将球状体以液体悬浮形式回收，并可通过足够大内径（大于27 G）的注射针头进行注射，且其结构保持良好。基因修饰通过使用原创的非病毒基因载体——聚复合物纳米胶束（polyplex nanomicelle）进行基因转染实现，该载体可在不破坏球状体结构的情况下将基因导入细胞。对于转染了表达荧光素酶基因的原代肝细胞球状体，在移植动物体内可持续获得荧光素酶表达，同时保留肝细胞功能，表现为白蛋白的表达。该系统可适用于多种细胞类型，包括间充质干细胞。
引言
细胞移植疗法因其在治疗多种难治性疾病方面的潜力而受到广泛关注。移植细胞所分泌的生物活性因子的活性及其半衰期，对于提高细胞移植系统的治疗效果至关重要。在移植前对细胞进行遗传修饰，是一种有效调控和操纵细胞功能（包括生物活性因子分泌）的技术。同时，维持有利于细胞存活的微环境，以避免细胞死亡或细胞活性丧失，也具有重要意义。三维（3D）球状体细胞培养能够良好地保持细胞间的相互作用，在此方面展现出良好前景，例如可增强原代肝细胞的白蛋白分泌，促进间充质干细胞（MSCs）的多向分化1-7。
本研究采用了一种新型的类球体培养与基因转染联合系统，作为基因修饰细胞移植的平台。为制备类球体细胞，使用了基于微图案化培养板的类球体培养系统。在这些培养板上，直径为100 µm的细胞黏附区域以二维方式规则排列，并由聚乙二醇（PEG）基质包被的非黏附区域包围3。通过接种适量的细胞，可形成与微图案化培养基底相对应、直径为100 µm的三维类球体阵列。
通过使用涂有温敏性聚合物聚异丙基丙烯酰胺（poly(iso-propylacrylamide), PIPAAm）的温敏细胞培养板，可在不破坏类球体三维结构的情况下将其回收8-10。微图案化结构构建于温敏板上（定制）。仅需降低培养板的温度，类球体即可从培养基质上脱离并分散于磷酸盐缓冲液（PBS）中。因此，可获得大量直径均一为100 µm的类球体，....
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方案
所有动物实验均经日本东京大学动物护理与使用委员会批准。
1. 细胞准备
- 对于原代肝细胞，按照改良的两步胶原酶消化法从大鼠分离肝细胞的方案进行操作13,14.
- 使用异氟烷吸入麻醉使 Sprague Dawley（SD）大鼠（雄性，5 周龄）麻醉。将大鼠置于连接麻醉机的麻醉舱内，以向舱内提供异氟烷。待大鼠入睡后取出，放置于操作台上，通过面罩通气。根据大鼠状态调节异氟烷流量，控制在约 0.4–0.7 L/min。 通过门静脉灌注5周龄雄性Sprague Dawley（SD）大鼠的肝脏，灌注液为特制溶液，其成分为8 g/L氯化钠（NaCl）、400 mg/L氯化钾（KCl）、78 mg/L磷酸二氢钠二水合物（NaH₂PO₄·2H₂O）2PO4·2H2O)，151 mg/L 磷酸氢二钠十二水合物（Na2HPO4·12H2O)、2.38 g/L 2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸（HEPES）、190 mg/L 乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸（EGTA）、350 mg/L 碳酸氢钠（NaHCO₃）3，以及 900 mg/L 葡萄糖。
- 通过肝脏循环胶原酶溶液。
注意：该溶液由500 mg/L胶原酶....
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结果
采用聚复合物纳米 micelle 或对照脂质转染试剂12，对由肝细胞或间充质干细胞（MSCs）形成的类球体进行表达海肾荧光素酶（Gaussia luciferase）的质粒DNA基因转染。在微图形化培养板上，与未转染的类球体相比，纳米micelle处理后的类球体结构几乎未发生改变；而使用对照试剂转染后一天，类球体结构则受到显著破坏（图3）。采用纳米micelle进行转染后，白蛋白的分泌以及外源基因（Gaussia 荧光素酶）的表达在近一个月内均保持稳定。然而，当使用对照试剂时，尽管外源基因的表达水平与纳米micelle组相似，但未检测到白蛋白的分泌（图4）12。
使用温敏型微图案化培养板进行类球体回收时，原代肝细胞和间充质干细胞在从冷却的培养板上回收后，其三维结构在悬浮状态下均得到了良好保持（图5）。当类球体通过足够大口径的注射针头（如23 G（400 µm）和27 G（220 µm）针头）时，其结构也得到了良好维持。
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讨论
在本实验方案中，基因导入和类球体回收步骤中维持类球体的三维结构至关重要。必须为细胞提供有利的微环境，以避免细胞死亡或细胞活性丧失。例如，白蛋白分泌作为肝细胞的一种典型固有功能，在肝细胞类球体中能够很好地保留；而在传统单层培养中的肝细胞，接种后数天内即迅速丧失其分泌能力12。对于间充质干细胞（MSCs），类球体显著提高了其向脂肪细胞或成骨细胞分化的效率，同时上调了参与脂肪生成和成骨生成的相关基因表达水平，并下调了维持MSC自我更新表型的基因4。
在基因导入方面，此前已测试了多种转染试剂，包括基于脂质的试剂（图3、4）和基于聚合物的试剂，例如聚乙烯亚胺。然而，所有这些试剂均未能在不破坏类球体结构的情况下实现成功的基因导入。特别是基于脂质的试剂，尽管在微图案化培养板上残留的细胞中也能实现高效的外源基因表达，但往往会导致类球体结构完全解体。这可能是因为基于脂质的试剂会引起显著的细胞膜不稳定，从而促进高水平的外源基因表达，但同时破坏了细胞间的相互作用，导致类球体结构瓦解。
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
我们衷心感谢池谷武史博士和技术人员 感谢日本东京东洋合成公司（Toyo Gosei）提供温敏型微图案化培养板及科学建议。我们还感谢小仓里美（Satomi Ogura）女士、铃木佐惠（Sae Suzuki）女士， Asuka Miyoshi 女士和 Katsue Morii 女士在动物实验方面的技术协助。本研究部分得到了日本学术振兴会（JSPS）科研费补助金、日本科学技术振兴机构（JST）创新中心（COI）计划和 S-创新计划，以及 JSPS 核心-核心计划 A 类：先进研究网络的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 青霉素-链霉素-谷氨酰胺（Pen-Strep-Glut） | GIBCO | ||
| 地塞米松（Dexamethasone） | 和光纯药工业（Wako Pure Chemical Industries） | 041-18861 | |
| 烟酰胺（Nicotinamide） | 和光纯药工业（Wako Pure Chemical Industries） | 141-01202 | |
| Hank’s 平衡盐溶液与L-抗坏血酸-2-磷酸（Asc-2P） | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| 人表皮生长因子（hEGF） | 东洋纺（Toyobo） | PT10015 | |
| Cell-able 多孔板 | 东洋合成（Toyo Gosei） | PP-12 | |
| 温敏型细胞培养板（Upcell) | CellSeed 公司（CellSeed Inc） | 微图案结构构建于温敏型培养板上（由东洋合成定制生产） | |
| 脂质体转染试剂（FuGENE HD） | Promega | E2311 | |
| 海肾荧光素酶检测系统（Renilla Luciferase Assay System） | Promega | E2810 | |
| pGL4 荧光素酶报告载体（pGL4 Luciferase Reporter Vector） | Promega | E6651 | |
| 表达高丝氨酸荧光素酶的质粒DNA（pDNA expressing Gaussia luciferase） | 新英格兰生物实验室（New England BioLabs） | N8082S | |
| 表达小鼠促红细胞生成素的载体（Mouse erhthropoietin-expressing vector） | Origene | MC208445 | |
| pCAG-GS | 由理化研究所（RIKEN）发育生物学中心多能细胞研究实验室惠赠 | ||
| Escherichia coli DH5α 感受态细胞 | 宝生物工程（Takara） | 9057 | |
| 无内毒素质粒DNA纯化系统（Endotoxin-free plasmid DNA purification system） | 日水遗传（Nippon Genetics） | NucleoBond Xtra EF | |
| 胶原酶（Collagenase） | 和光纯药工业（Wako Pure Chemical Industries） | 639-00951 | |
| 胰蛋白酶抑制剂（Trypsin inhibitor） | GIBCO | R-007-100 | |
| 发光仪（Luminometer） | Promega | GloMax™ 96 微孔板发光仪（GloMax 96 Microplate Luminometer） | |
| IVIS 成像系统（IVIS Imaging System） | Xenogen Corp. | Xenogen IVIS Spectrum 活体成像系统（in vivo imaging system） | |
| 血液分析仪（Blood sample analyzer） | 希森美康（Sysmex） | pocH-100i 自动血液分析仪（Automated Hematology Analyzer） |
参考文献
- Landry, J., Bernier, D., Ouellet, C., Goyette, R., Marceau, N. Spheroidal aggregate culture of rat liver cells: histotypic reorganization, biomatrix deposition, and maintenance of functional activities. J Cell Biol. 101 (3), 914-923 (1985).
- Yuasa, C., Tomita, Y., Shono, M., Ishimura, K., Ichihara, A.
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重印与许可
