通过眼内注射磁性微球诱导实验性青光眼

摘要

我们介绍一种通过将磁性微球注入大鼠眼内以诱导眼内压（IOP）升高的方法，用于模拟青光眼。该方法可引起显著的眼压升高，并导致广泛的神经元死亡。本方案操作简便，无需重复注射，且可产生稳定、持久的眼压升高。

摘要

深入了解青光眼的病理生理机制并开发新型治疗方法，依赖于良好的动物疾病模型。本文介绍一种通过向大鼠眼前房注射磁性微球来升高眼内压（IOP）的实验方案。利用磁性颗粒可使操作者将微球引导至虹膜角膜角，从而有效阻塞小梁网的房水流出通路。该方法可导致持久的眼内压升高，并最终引起神经节细胞层（GCL）的神经元死亡以及视神经病变，这与青光眼患者的临床表现一致。该技术操作简便，无需特殊设备、专业外科技能或长时间训练即可掌握。此外，眼压升高效果稳定，通常无需像其他使用塑料微球的模型那样重复注射。同时，我们认为该方法也适用于小鼠眼球的建模。

引言

原发性青光眼是一种严重的致盲性眼病，全球约有6050万人受其影响¹，可导致显著的视力损害甚至失明²。对青光眼发病机制的研究以及新型治疗方法的开发，依赖于能够重现该疾病部分病理特征的优良疾病模型。

本文介绍一种基于 Samsel 等³ 方法建立的大鼠青光眼模型。该技术的总体目标是通过将磁性微球注射至前房，并利用磁环将其引导至虹膜角膜角，从而升高眼内压（IOP）。此过程阻碍房水外流，导致眼内压升高，进而引起神经元损伤和细胞丢失。本方案旨在尝试提供一种更为简便、可诱导的青光眼模型。

该方案相较于现有技术可能具有一些优势。目前已有的遗传性小鼠模型（如DBA/2J）无需人为干预即可自发产生疾病，但其疾病进展的起始时间可能难以预测⁴。相比之下，可诱导模型的优势在于研究人员可自主控制疾病诱导的时机；这类模型大多依赖于通过手术方式升高啮齿类动物的眼内压（IOP）。然而，这些方法本身也可能存在某些局限性，例如技术操作难度较高⁵，且可能需要多次手术操作以维持眼内压的升高状态⁶。

相比之下，本文详细介绍的可诱导方法是一种简单、有效且可重复的技术，能够产生稳定而显著的压力升高，且几乎无需重复注射。此外，该方法不需要昂贵的设备，仅需基本的外科手术技能即可操作。本实验方案可能适用于希望在实验室中建立一种技术要求较低的可诱导性青光眼模型的读者。

方案

伦理声明所有动物实验均按照机构动物护理和使用委员会（IACUC）的规定进行，并依据英国政府内政部指南获得批准（http://goo.gl/FLkirW，最后访问于10^th 2014年6月）以及眼科与视觉研究中动物使用ARVO声明（http://goo.gl/4LFOjD，最后访问于10^th 2014年6月

1. 诱导眼压升高

1. 通过向布朗挪威大鼠前房单侧注射顺磁性微球以升高眼内压（IOP），诱导实验性青光眼，该方法基于Samsel的实验方案 等³ 其他有色大鼠品系可能也适用，但需由使用者首先进行验证。
2. 将250–300 g的雌性退役Brown Norway大鼠饲养于恒定低光照环境（40–60 lux）中，以尽量减少眼内压（IOP）的昼夜波动⁷，可自由获取食物和水 随意.
3. 在清醒动物中测量基线眼内压⁸ 在麻醉和微珠注射之前，使用经校准用于大鼠眼睛的回弹式眼压计⁹眼压（IOP）取五次测量读数的平均值。
4. 以37.5 mg/kg氯胺酮和0.25 mg/kg盐酸美托咪啶腹腔注射麻醉大鼠。在应用聚维碘酮（见步骤1.5）和微珠注射（见步骤1.8）前，通过检测动物后肢足底反射确认麻醉深度。给予0.5%盐酸丙帕卡因进行镇痛。
   注意：任何步骤中均不得散大瞳孔。这有助于微珠更好地沉降到虹膜角膜角，并防止其与晶状体粘连。对未手术的对侧眼使用眼膏，以防止角膜干燥。
5. 用5%聚维酮碘冲洗手术眼 水¹⁰ 注射前5分钟。
6. 5分钟后，使用无菌纱布吸除聚维酮碘，并用0.9%无菌生理盐水冲洗眼睛。麻醉期间需定期滴加无菌生理盐水以保持眼部湿润。
7. 将环形磁铁放置在眼睛周围。
8. 使用33 G斜面针头，向眼前房注入25 μl含有30 mg/ml经γ射线辐照灭菌的8 μm磁性微球的Hank’s平衡盐溶液（HBSS）。
   1. 为制备磁珠，用1 ml HBSS重悬后，在10,000 × g离心5分钟，重复洗涤3次，最后配制成30 mg/ml的溶液。全程保持无菌条件。
   2. 注射时需小心避免将针头刺入虹膜，以尽量降低虹膜损伤的风险。可通过将针头沿角膜表面切线方向进针，尽可能与虹膜平行，以防止上述情况发生。此操作也有助于减少注射部位微珠的流失。
      注意：注射微珠时应快速进行，以确保其在虹膜角膜角周围均匀分布，这对于升高眼内压（IOP）至关重要。此外，应将微珠、针头和磁环分别存放，以防止微珠聚集形成团块，导致难以装入注射器和注射，同时避免针头被磁化。
9. 注射后将针头留置1分钟，以确保微珠沉降至虹膜角膜角，阻塞小梁网的房水引流。待微珠初步沉积后，轻微倾斜针头，使少量房水渗出，以尽量减少眼内压的短暂升高。手术结束时，依次用磷酸盐缓冲液（PBS）、70%乙醇和蒸馏水冲洗针头，以确保其可在后续不同操作中继续使用。 或者，如果具备合适规格的针头和注射器组合，也可使用一次性针头。可选： 可使用修针器对针头进行磨锐以延长其使用寿命。
10. 在此阶段，如有必要，可移除磁铁，并用其将磁珠引导至覆盖不完全的区域。
11. 注射后将磁铁保留在眼部周围10分钟，以确保微珠充分沉降至虹膜角膜角。
12. 使用0.25 mg/kg盐酸阿替美唑进行麻醉逆转。
13. 局部使用氯霉素或其他抗生素软膏（如庆大霉素或土霉素）以预防感染，并使用0.5%盐酸丙帕卡因进行镇痛。将动物置于加热垫上恢复，直至其恢复活动能力，随后转移至保温箱，并提供额外营养，例如食物补充剂或湿润的常规饲料，直至完全恢复。术后24小时若动物表现出疼痛迹象，应给予全身性或局部镇痛治疗。若症状经治疗后仍持续存在，应实施人道终点处死。
14. 使用对侧眼作为未手术对照。
15. 在注射微球后每2-3天测量一次眼压，此后继续每2-3天测量一次，使用经校准适用于大鼠眼睛的回弹式眼压计进行测量⁹.
16. 纳入研究的眼睛需符合以下标准：1）眼内压（IOP）较对侧对照眼升高5 mmHg以上；2）眼内压不超过60 mmHg。
17. 眼压已恢复至基线水平的眼（通常在注射后1周内恢复）不应纳入研究。然而，若需要，可对未出现高眼压的眼再次注射微珠。
18. 以 CO₂ 处死动物₂ 实验结束时实施窒息处死。
19. 解剖眼球和视神经，并在4%多聚甲醛（PFA）中固定过夜，以进行后续组织学分析。

2. 使用TUNEL染色评估视网膜神经元损伤

1. 根据制造商说明书，使用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口标记（TUNEL）检测法对整体视网膜中的凋亡细胞进行定量。
2. 从眼球杯中分离视网膜，用含0.3% Triton X-100的磷酸盐缓冲液（T-PBS）清洗3次，每次5分钟。
3. 在3% T-PBS中对组织进行透化处理，持续2小时。
4. 将视网膜在平衡缓冲液中预平衡10分钟，随后在TUNEL反应液中37 °C孵育1小时。
5. 用0.3% T-PBS清洗组织3次，每次5分钟，再用含5 µM DAPI的0.3% T-PBS冲洗，最后封片于封片介质中。
6. 使用共聚焦显微镜对整个神经节细胞层进行成像，以20倍放大倍数采集厚度为10 µm的z轴堆栈图像。在每片整体视网膜的4个瓣状区域中，分别在靠近视神经、中周部以及远周部的位置各采集3幅图像，共获得12幅图像，覆盖约7,000个细胞。根据形态学标准区分非神经元细胞（内皮细胞和胶质细胞）与神经元细胞。
7. 仅使用DAPI通道选择成像区域，并对研究者设盲处理分组信息。

3. 使用甲苯胺蓝染色评估视神经损伤

1. 将视神经在4 °C下用Karnovsky’s溶液固定过夜。
2. 用1% (w/v) 四氧化锇处理样本2小时，然后在100%乙醇中脱水。
3. 将视神经在环氧丙烷中孵育30分钟，随后置于环氧丙烷:阿拉尔迪特（50:50）混合液中过夜。
4. 更换为100%阿拉尔迪特，并在60 °C下孵育过夜。
5. 切取半薄切片（厚度0.75 mm），用含1%甲苯胺蓝/硼砂（TB）的50%乙醇溶液染色，然后进行光学显微镜观察。

4. 统计分析

1. 使用适当的统计学软件包进行统计分析。可采用双因素方差分析（two-way ANOVA）结合Newman-Keul's事后检验，以计算眼内压（IOP）随时间变化的统计学显著性。
2. 以p值小于0.05为具有统计学意义。

结果

将磁珠注射至虹膜角膜角可一致地诱导眼压持续且显著升高（图1），在注射后第3天的首个时间点即可明显观察到。此外，眼压升高在整个实验过程中得以维持；尽管我们的实验时间进程在注射后18天结束，但已有其他研究报道眼压可长期持续升高³。在整个实验期间，对照组（未注射磁珠）眼睛的平均眼压为19.7 ± 0.3 mmHg，而注射磁珠眼睛的平均眼压为40.5 ± 2.8 mmHg（P <0.001）。此外，眼压峰值从22.8 ± 0.3 mmHg升高至49.9 ± 2.3 mmHg。

为了确定眼内压（IOP）升高是否导致视网膜神经节细胞死亡，我们对视网膜进行了TUNEL染色，并对横断面视神经切片进行了组织学分析（图2）。在视网膜中，我们观察到注射微珠并伴有眼内压升高的眼睛中TUNEL染色信号增加（图2A）。凋亡细胞核的数量大约增加了15倍，从对侧对照眼中1.6 ± 0.5个细胞上升至高眼压视网膜中的24.5 ± 0.5个细胞（图2B；P <0.05）。此外，在注射了磁性微珠但眼压未升高的眼睛中（可能是由于虹膜角膜角阻塞不完全），TUNEL阳性细胞数量与未注射的对照组相比无显著差异（P >0.05）。这表明细胞死亡与眼压升高相关，而非磁性微球的直接毒性所致。最后，我们分析了青光眼模型中的视神经病理变化，发现许多轴突中出现了甲苯胺蓝的聚集，提示这些细胞突起发生了退行性变（图2C）。

图1. 使用磁性微球升高眼内压。 将磁性微球注射至前房后，与对侧未注射的对照眼相比，眼内压（IOP）显著且明显升高。Y轴单位 = 毫米汞柱（mmHg）。数据 = 均值 ± 标准误（SEM）。* = P <0.001；N = 12。该图改编自 Foxton et al.，Am. J. Pathol. 182(4): 1379-1390。

图 2. 通过向虹膜角膜角注射磁性微球升高眼内压（IOP），导致节细胞层（GCL）神经元死亡。（A） 对照眼（左）和青光眼（右）视网膜的代表性图像，经 TUNEL 染色标记凋亡细胞核（绿色；白色箭头）和 DAPI 染色（蓝色），显示随着 IOP 升高，凋亡细胞核数量增加。（B） GCL 中 TUNEL 阳性细胞的定量结果表明，IOP 升高的眼睛（中）比对照组（左）具有显著更多的凋亡细胞。相比之下，在注射微球但眼压未升高的眼睛（右）中，TUNEL 染色未见显著增加。数据 = 均值 ± 标准误（SEM）。* = P <0.05；N = 7–8。 （C） 视神经染色的代表性图像，显示青光眼组（右）受损轴突中亚甲基蓝沉积增加（黑色箭头），而对照组眼睛（左）无此现象。比例尺 = 50 μm。本图改编自 Foxton 等，Am. J. Pathol. 182(4): 1379–1390。

讨论

本文展示了一种通过将磁性微球注入大鼠眼前房以诱导眼内压（IOP）升高的方法。该方法操作简便，几乎无需复杂的外科技术，也无需长时间的练习与优化。此外，该方法效果显著，通常仅需一次微球注射即可引起明显且稳定的升压反应（重复注射率约为10%）。与现有的可诱导方法相比，该方法可能具有优势，例如相较于技术难度较高的巩膜上静脉硬化¹¹模型或激光光凝术方案⁶，后者往往需要多次操作以维持眼内压升高。

然而，为了确保该方法的成功，有一些关键的细微步骤需要注意。首先，使用环形磁铁将微珠吸引至虹膜角膜角是有帮助的。此步骤是对原始方案的改进，原始方案中微珠被注入前房后，需手动在眼球周围移动³。使用环形磁铁可使微珠在房角周围均匀沉降，从而减少手动重新分布的需要。其次，注射速度应较快——若注射过慢，微珠将主要积聚在房角的一侧，导致覆盖不全，可能无法引起眼压升高。尽管如此，该方法总体较为简便，使用者可轻松对方案进行修改，例如调整微珠颗粒的大小或体积，以尝试改变眼内压升高的程度。

然而，该方法的一个潜在缺点是，对高血压程度的控制较为有限，我们观察到约有5-10%的病例眼内压升高超过60 mmHg。眼内压过度升高可能对视网膜组织造成严重破坏，并使细胞死亡机制与生物学研究变得困难。然而，该方法可在视网膜和视神经中产生稳定的神经病理变化，且可通过药物进行干预¹²。这使得该模型在开发治疗青光眼的新疗法方面具有吸引力。此外，由于微珠被注入至虹膜角膜角，因此视轴保持通畅，便于对视网膜或视盘进行活体成像。我们预计该模型将被改进并应用于其他物种的后续研究中，包括小鼠。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
250 - 300 g 的雌性Brown Norway退役繁殖大鼠	Harlan 英国	203
Tonolab回弹式眼压计	Tiolat	TV02
氯胺酮（Ketaset）	Fort Dodge Animal Health	BN1000118	37.5 mg/kg
右美托咪定盐酸盐（Domitor）	Orion Pharma	140-999	0.25 mg/kg
聚维酮碘	Ecolab	BN4369LE10	5% in H2O
明氏生理盐水溶液	博士伦	PL00033/5017
环形磁体	超强磁铁	R-10-07-03-N
磁性微球	Bangs Laboratories	UMC4N/9692
HBSS	Invitrogen	14025
33 G 斜面针头	Hamilton	7747-01	定制针头
鲁尔接头注射器	Hamilton	80601
Antisedan（盐酸阿替美唑）	Orion Pharma	141-003	0.25 mg/kg
氯霉素软膏	Medicom	18956-0005
TUNEL染色试剂盒	Promega	G3250
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
Vectashield 封片剂	Vector Labs	H-1000