鸡胚尿囊绒毛膜（CAM）缺乏免疫功能且高度血管化，使其成为肿瘤生长和血管生成的天然体内模型。在本方案中，我们描述了一种利用CAM实验培养三维、血管化肝细胞癌（HCC）肿瘤的可靠方法。
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本文内容
摘要
摘要
鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）在受精后第7天开始发育，至第12天趋于成熟。CAM天然缺乏免疫功能且高度血管化，是进行肿瘤移植的理想体系。此外，CAM含有纤连蛋白、层粘连蛋白、胶原蛋白、整合素α(v)β3以及基质金属蛋白酶-2（MMP-2）等细胞外基质蛋白，使其成为研究肿瘤侵袭与转移的有利模型。长期以来，科研人员利用CAM的生理特性，将其作为血管生成研究的模型。近年来，CAM实验已被改良并用于 体内 用于多种癌症的异种移植模型系统，弥合了基础研究与临床应用之间的鸿沟 体外 工作以及更复杂的动物癌症模型。CAM 检测可在生物学相关性强、兼具成本与时间效益的系统中研究肿瘤生长、抗肿瘤治疗及促肿瘤分子通路。本文中，我们描述了肝细胞癌（HCC）的 CAM 异种移植模型的建立，其胚胎存活率高达 93%，且肿瘤成瘤率可靠，可形成三维、带血管化的肿瘤。
引言
肝细胞癌（HCC）是第3位rd 全球癌症死亡的主要原因1目前，仅有30%的肝细胞癌患者符合潜在根治性手术治疗的条件2，且全身化疗无效3因此，迫切需要开发新型肝细胞癌（HCC）治疗方法，并建立适合高效筛选新药的模型系统。鸡胚尿囊膜（CAM）实验是一种可重复、成本低、速度快的中等通量检测潜在抗肿瘤药物的方法。 体内.
CAM 检测已被广泛用于研究血管生成4。该方法还已成功发展为多种癌症的肿瘤异种移植模型，包括胶质母细胞瘤5、胰腺癌6、黑色素瘤7-9和骨肉瘤10-11。in ovo12 和ex ovo13 技术均已在文献中得到应用，不同实验方案之间存在细节差异。CAM 异种移植模型面临的一个主要挑战是在对鸡蛋进行操作后，胚胎死亡率相对较高，已有报道的鸡胚死亡率范围为 25% 至 50%11-14。
在本文中，我们描述了一种新型方法的开发过程 在卵内 一种可稳定生成三维、血管化肿瘤的肝细胞癌异种移植模型，其组织学特征与未分化肝细胞癌相似。我们采用的方案最初由 Ossowski 报道 等.14 并实现了高达93%的鸡胚存活率，且肿瘤移植成功率极高。
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方案
1. 卵的孵化
- 获取8日龄的无特定病原体的鸡胚蛋。
- 将鸡胚蛋放入旋转蛋盘中，有标记的一端朝上，并将旋转蛋盘放入孵卵器内。在36 °C和50%湿度条件下孵育48小时 。
2. 放下 CAM 并打开鸡蛋
- 从培养箱中收集鸡蛋。将鸡蛋放入蛋架中，有标记的一面朝上，并移至超净工作台。
- 关闭房间和超净台的照明灯。
- 轻轻将鸡蛋有标记的一端贴在照蛋仪上，以观察绒毛尿囊膜（CAM）的血管系统以及气室。
注意：照蛋仪是一种光源，用于观察发育中的胚胎及其相关的气室和血管系统。 - 在两条主要血管之间用铅笔做一标记。
- 打开灯光，使用无菌图钉在气室上方的蛋尖（有标记的一端）打一个孔，再在铅笔标记处打另一个孔。图钉不要完全穿透蛋壳；通常打约 3 mm 深的孔即可。
- 关闭灯光。挤压安全吸球，将其开口端紧压在气室上方的孔上，施加负压，使空气被吸入铅笔标记处的孔中，从而使该处的绒毛尿囊膜（CAM）与蛋壳分离。
- 使用照蛋仪检查气室是否已从蛋的标记端移动至铅笔标记的孔处。若未移动，可用图钉将两个孔稍加深，然后再次使用安全吸球施加负压。
- 打开灯光。一手握住鸡蛋，启动装有 15/16 英寸切割片的电动磨削工具，在蛋壳上做两条横向切割，深度仅需切穿蛋壳，但不可深至触及下陷的绒毛尿囊膜（CAM）。每条切口长约 2 cm，相距约 1 cm。切口宽度应足以让直径为 1 cm 的硅胶环通过，但窄于标准透明胶带的宽度。
- 接着，用切割片轻轻接触蛋壳，在两条横向切口之间及其末端处做一条纵向切口。
- 将无菌镊子滑入蛋壳碎片下方，并与蛋壳表面平行。用镊子夹住蛋壳碎片，完整地将其取出。
- 用透明胶带覆盖新开的窗口，注意将一端折回自身，以便后续易于移除。
- 将鸡蛋放回培养箱中的蛋托内（**不可**放入旋转蛋架），直至接种时使用。
3. 接种
- 将基底膜蛋白混合物（如Matrigel）置于冰上（防止聚合），并放入生物安全柜中。
- 使用2 mM EDTA消化细胞（每T75培养瓶4–5 ml），并将培养瓶置于组织培养孵箱中5分钟。
- 将脱落的细胞重悬于培养基中，用血细胞计数板和台盼蓝进行计数。根据细胞系的不同，每例鸡胚尿囊膜（CAM）移植使用500,000至2,000,000个细胞。应在预实验中优化合适的细胞数量。
- 计算所需细胞数量对应的体积，于500 × g离心5分钟。
- 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于40 µl PBS++和20 µl基底膜蛋白混合物中。
注意：此时可根据实验需要，将药物或其他待测试剂加入细胞与基底膜混合物的悬液中进行处理。或者，也可在移植后将试剂滴加到细胞与基底膜混合物的悬液上。 - 从孵箱中取出装有鸡胚的蛋架，放入超净工作台中。
- 撕去窗口上的封口胶带，用灭菌镊子从冻存管盖中取出一个1 mm硅胶环，并通过窗口投入鸡胚上。
- 用移液器将60 µl含PBS++和基底膜混合物的细胞悬液直接滴加到位于尿囊膜上的硅胶环中央。
- 重新封好窗口胶带，并将蛋架放回孵箱。此时移动鸡胚需格外小心，以免硅胶环或细胞悬液发生移位。
- 让肿瘤生长5至7天。
4. 收集肿瘤组织
- 将垫巾置于超净台内。根据组织学需要准备35 × 10 mm培养皿和多聚甲醛容器。在每个35 × 10 mm培养皿中加入1 mL PBS++。
- 在超净台内放置生物危害废弃物袋。取无菌解剖剪，将尖端从靠近标记端的孔插入鸡蛋内。
- 沿鸡蛋全长纵向剪开。
注意：绒毛尿囊膜（CAM）及带环的肿瘤应附着在带有窗口的上半部分蛋壳上。 - 使用解剖剪和镊子将肿瘤从绒毛尿囊膜（CAM）上分离，并将肿瘤放入35 × 10 mm培养皿中。测量并称重肿瘤。将固定后的肿瘤置于多聚甲醛中，随后进行石蜡包埋，用于组织学和免疫组织化学实验。
5. （可选）：肿瘤细胞解离
- 使用解剖剪在35 × 10 mm培养皿中将肿瘤组织剪碎。将剪碎的肿瘤倒入15 ml离心管中，并用移液器尽可能去除PBS++。
- 加入2 ml胶原酶（1 mg/ml，溶于PBS++中），将离心管反复翻转数次，于37 °C孵育至少30分钟（可长达数小时）。
- 向每根试管中加入 5 ml 培养基，通过上下吹打 20 - 40 次充分重悬细胞。充分吹打对于实现完全的细胞解离至关重要。
- 让沉淀静置沉降，将上清液转移至新离心管中。以500 × g离心5分钟。弃去上清液，保留解离的细胞沉淀。
注意：此时，细胞沉淀可用于多种实验（流式细胞术、裂解后用于蛋白质印迹、RNA 提取） 等等）。总肿瘤细胞数也可通过血细胞计数板和台盼蓝染色获得。注意，较小的椭圆形细胞为来自CAM的鸡细胞，不应计为肿瘤细胞。若将肿瘤从CAM上仔细分离，应仅有极少数量的非肿瘤（CAM）细胞污染。
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结果
本方案中关键步骤的代表性图片如下所示。图1A展示了使用照蛋灯观察发育中的胚胎、气室以及绒毛尿囊膜（CAM）血管系统的方法。图1B-1C显示了通过打两个孔并使用安全吸球施加负压使绒毛尿囊膜下陷的操作过程，图1D显示了一个成功下陷的绒毛尿囊膜，铅笔标记的孔下方出现一个较大的气泡。图1E和图1F展示了使用Dremel旋转工具在气泡上方的蛋壳上进行必要切割，以及打开蛋壳窗口后暴露出内部血管化的绒毛尿囊膜的情况。
利用人肝细胞癌细胞系 HUH7（图 2A-2B）和 PLC/PRF/5（图 2C-2D）成功培养出三维、具有血管化的肿瘤。由 HUH7 和 PLC/PRF/5 细胞生长形成的肿瘤在组织学上类似于未分化肝细胞癌（图 2E-2F），同时也类似于在小鼠异种移植模型中生长的 HUH7 和 PLC/PRF/5 肿瘤...
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讨论
本方案中有几个关键步骤最有可能解释胚胎存活率的提高以及肿瘤生长可靠性的增加。通过吸取气室使绒毛尿囊膜（CAM）脱离蛋壳的方法，相较于其他现有方法（如使用针头从蛋中移除蛋白、钝性分离等）更具微创性。使用无菌图钉创建本方法所需的两个小孔是该方案中最具挑战性的部分。施力过大可能导致图钉过度穿透，从而损伤CAM及其血管系统，甚至可能导致蛋壳开裂或蛋体破坏。通过在未受精的市售鸡蛋上实际练习使用图钉打孔，可显著减少首次操作CAM下拉时的失误。此外，使用乙醇或其他消毒溶液清洁蛋壳会降低胚胎活力，应避免使用。最后，在接种后使用无菌硅胶环将肿瘤细胞“圈定”于特定位置，有助于促进肿瘤生长，并有助于实现本方案中观察到的高肿瘤成瘤率。
在使用不同细胞系和/或药物时，该实验方案中关键步骤的某些部分很可能需要进行优化。建议接种细胞数量为50万至200万个，但某些细胞系可能需要更高或更低的接种密度，以形成良好且具有三维结构的肿瘤。接种细胞过少可能导致成瘤效果不佳；而接种过多则可能导致肿瘤过度生长，使肿瘤完全占据硅胶环，变得扁平，三维结构特征减弱，甚至可能突破环的边界。我们建议通过预实验确定特定细胞系的最佳接种密...
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披露
A.S. 获得Advaxis制药公司的资助，用于支持一项研究者发起的临床试验。
致谢
A.S. 部分得到了美国国立卫生研究院（NIH）国家牙科与颅面研究所（5R03DE021741-02）和国家癌症研究所（1K08CA154963-01A1）资助的支持。
霍华德·休斯医学研究所通过HHMI医学研究学者项目为M.L.提供了资金支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 优质孵化用鸡蛋 | Charles River | N/A | http://www.criver.com/files/pdfs/avian/av_c_spf_egg_price_list.aspx |
| 鸡蛋孵化箱 | GQF | Hova-Bator 2362N | |
| 旋转式蛋托 | GQF | 1611 Automatic Egg Turner | |
| 验蛋灯 | Lyon | Hi-Power 950-070 | |
| 配备15/16切割轮的Dremel 100旋转工具 | Dremel | 100-N/7 | |
| 无菌镊子、图钉、解剖剪、透明胶带 | |||
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | |
| 带外部螺纹和硅胶垫圈的冷冻管 | Corning | 430659 | |
| 产气荚膜梭菌来源的胶原酶 | Sigma | C9891 |
参考文献
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重印与许可
