巨噬细胞胆固醇耗竭及其对吞噬作用的影响 新型隐球菌

摘要

本文介绍了一种巨噬细胞感染的实验方案 新型隐球菌 还描述了一种从巨噬细胞中耗竭甾醇的方法。这些方案为研究真菌感染提供了指导 体外 并研究甾醇在这些感染中的作用。

摘要

隐球菌病是由隐球菌属的致病性真菌引起的一种危及生命的感染 隐球菌通过吸入孢子发生感染，孢子可在深部肺组织中复制。孢子被吞噬细胞吞噬后 隐球菌 被巨噬细胞吞噬是该疾病能够扩散至中枢神经系统并引发致命性脑膜脑炎的途径之一。因此，研究这种关联性对于 隐球菌 巨噬细胞在感染进展中的作用对于理解感染进程至关重要。本研究描述了一种逐步研究巨噬细胞感染性的实验方案。 C. neoformans体外. 利用本实验方案，研究宿主固醇在宿主-病原体相互作用中的作用。使用不同浓度的甲基-β-环糊精（MCD）从鼠类网状肉瘤巨噬细胞样细胞系 J774A.1 中去除胆固醇。通过市售胆固醇定量试剂盒和薄层色谱法对胆固醇的去除进行确认和定量。将去除胆固醇的细胞用脂多糖（LPS）和干扰素γ（IFNγ）激活后，接种经抗体调理的病原体 新型隐球菌 以1:1的效应细胞与靶细胞比例孵育野生型H99细胞。感染细胞在孵育2小时后进行监测。 C. neoformans 并计算其吞噬指数。胆固醇耗竭导致吞噬指数显著降低。本研究所提供的实验方案为在实验室环境中模拟感染过程的起始、以及研究宿主脂质组成对感染性的影响提供了便捷的方法。

引言

吞噬作用是一种宿主细胞将胞外实体内化的过程。它是免疫系统防御病原体的重要武器，但该过程常被病原体所劫持，以实现其自身内化并在体内扩散¹。吞噬作用由一系列信号事件介导，这些信号通过宿主细胞骨架的重排，导致病原体的附着与吞噬。所谓的“专职”吞噬细胞能够识别并结合入侵病原体表面的调理素，从而触发附着信号以及伪足的形成，伪足包裹病原体并形成吞噬体²。巨噬细胞即属于此类“专职”吞噬细胞。巨噬细胞是高度特化的细胞，执行多种保护性功能，包括识别并清除致病因子、修复受损组织以及调节炎症反应，其中大多数功能通过吞噬作用实现^1,2。

Cryptococcus neoformans 是一种致病性酵母菌，可引起一种称为隐球菌病的严重疾病。Cryptococcus 的孢子被宿主吸入后，会导致肺部感染，通常无明显症状。据认为，人群暴露极为普遍；一项对布朗克斯-黎巴嫩医疗中心儿科传染病门诊61名儿童的调查显示，所有受检者体内均检测到针对 隐球菌多糖葡糖醛酸木甘露聚糖的抗体，其他研究也显示，在未感染和已感染人类免疫缺陷病毒（HIV）的成年人群中均存在较高的暴露率^3,4。 肺泡巨噬细胞是应对肺部感染的第一道防线，在大多数情况下能够成功清除病原体。然而，在免疫功能低下个体（例如，HIV 和艾滋病患者）中，该酵母菌可在巨噬细胞内存活。在此类情况下....

方案

1. 使用 MβCD 对 J774A.1 细胞进行胆固醇耗竭

1. 在无菌生物安全柜中，将 10⁵ 个 J774A.1 类似巨噬细胞接种至 96 孔细胞培养板的每孔中，每孔加入 200 μl 添加了 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素/链霉素（P/S）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）。于 37 °C、5% CO₂ 条件下过夜培养。
2. 移除细胞单层上的培养基，并用经过滤或高压灭菌的 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞两次。
3. 每孔加入 200 μl 所需浓度的 MβCD 溶液（10 mM 或 30 mM，溶于 PBS）或仅加入 1× PBS 作为对照，于 37 °C 振荡孵育 30 分钟。移除上清液并室温保存，随后立即使用市售试剂盒进行定量分析。
4. 用 1× PBS 或无血清 DMEM 洗涤细胞两至三次，随后继续进行感染实验，或使用去离子 H₂O 吹打两至三次以裂解细胞，用于薄层色谱分析或试剂盒检测。
   注意：胆固醇耗竭后可使用市售胆固醇定量试剂盒。详见材料部分。请严格按照制造商说明书操作。

2. 薄层色谱法（TLC）观察胆固醇含量

1. 用丙酮清洗薄层色谱（TLC）槽两次，再用石油醚:乙醚:乙酸（体积比65:30:1）溶液清洗一次。用石油醚:乙醚:乙酸（体积比65:30:1）溶液饱和T....

结果

胆固醇耗竭

按照Amplex Red胆固醇检测试剂盒的制造商说明书，对方案第1.3步中保留的上清液进行分析，结果显示经MβCD处理的样本中胆固醇浓度高于1x PBS对照组。胆固醇的耗竭程度取决于细胞类型及所用MβCD浓度。对于使用10 mM MβCD处理的J774细胞，观察到约50%的胆固醇被耗竭。耗竭率可通过第1.4步中获得的上清液和细胞裂解液的测定值进行计算（图1）。

使用薄层色谱法（TLC）分析细胞裂解液，结果显示，经MβCD浓度递增处理的细胞中，胆固醇染色明显减弱（图2A）。TLC的密度测定分析结果与定量检测呈现相似趋势（图2B）。Bligh-Dyer法可获得总脂质的粗提物，为利用胆固醇标准品准确识别目标条带，必须确保脂质充分分离。

感染

完成感染操作后，细胞仍保持贴壁且完整。不同处理组之间的细胞形态未发生变化。未暴露于.......

讨论

在使用本实验方案时，接种哺乳动物细胞和调理化新型隐球菌（C. neoformans）细胞过程中获得准确的细胞计数至关重要。这可以最大限度地减少实验重复之间的差异，并确保在整个研究过程中效应细胞与靶细胞保持准确的1:1比例。此外，必须协调好胆固醇耗竭与感染步骤的时间，以避免调理后的酵母细胞或经处理的巨噬细胞在实验步骤之间于室温下静置。过长的等待时间可能导致抗体调理作用丧失，或在感染开始前胆固醇水平重新恢复。若实验操作精确，数据分析将有助于明确胆固醇在吞噬作用中的作用。

该技术的局限性使得无法得出关于胆固醇耗竭降低类似巨噬细胞吞噬指数的具体机制的任何结论，目前尚不清楚该效应是直接由胆固醇引起，还是由次级机制所致。后续研究可进一步探讨脂筏的其他组分，例如鞘脂类或已知参与吞噬作用的蛋白质，如 Fcγ 受体和补体受体 3 ²。通过修改本技术，分别单独使用抗体调理或补体调理，可能有助于区分胆固醇在上述两条已知通路中所起的作用。还需注意的是，MβCD 是基于胆固醇的疏水性和分子大小来提取胆固醇的，因此结构大小相似的甾醇也可能被耗竭，并在薄层色谱（TLC）中.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
II 级 A2 型生物安全柜	Labconco	3460009
J774A.1 细胞系	ATCC	TIB-67	冷冻状态送达。请参阅 ATCC 提供的细胞培养说明。
Dulbecco’s 改良伊格尔培养基（DMEM）	Gibco	11995-065	4 °C 保存，使用前升温至 37 °C
HI 优质胎牛血清（Performance Plus）	Gibco	10082-147	-20 °C 冷冻保存，添加至 DMEM 前需解冻
青霉素-链霉素溶液（10,000 U/ml）	Gibco	15140-122	用于补充 DMEM 培养基
Isotemp 细胞培养箱	Fisher Scientific		型号 # 3530
96 孔培养板	Corning Inc. Costar	3595
10x 磷酸盐缓冲液（PBS）	Fisher Scientific BioReagents	BP3994	使用前稀释为 1x，并过滤或高压灭菌。
甲基-β-环糊精	Sigma Life Science	C4555-10G	用 1x PBS 溶解，配制 10 mM 和 30 mM 浓度的溶液
轨道摇床	Labline
Amplex Red 胆固醇检测试剂盒	Life Technologies Molecular Probes	A12216	胆固醇检测所需全部试剂均包含于试剂盒内。请遵循制造商说明书操作。
96 孔黑色检测板	Corning Inc. Costar	3603
FilterMax 微孔板读板仪	Molecular Devices		型号 F5
TLC 展开槽	Sigma-Aldrich	Z126195-1EA
氯仿	Sigma-Aldrich	650498-4L
甲醇	Sigma-Aldrich	34860-2L-R
TLC 滤纸	Whatman	3030917	根据 TLC 展开槽尺寸裁剪使用
通风橱			符合 AIHA/ANSI 标准的任意通风橱
6 孔板	Corning Inc. Costar	3506
胰蛋白酶-EDTA 溶液	Gibco	25300-054
细胞刮刀	Corning Inc. Costar	3010
血细胞计数板	Hausser Scientific	1490
离心机	Beckman Coulter		型号 Alegra x-30R
涡旋混合器	Fisher Scientific	12-812
天平	Mettler Toledo		型号 # MS104S，可精确至 0.1 mg
玻璃巴斯德吸管	Fisherbrand	13-678-20A
胆固醇	Avanti Polar Lipids	700000
SpeedVac 浓缩仪	Thermo Scientific		型号 # SPD2010
石油醚	Fisher Scientific	E139-1
乙醚	Sigma-Aldrich	309966
乙酸	Sigma-Aldrich	320099
带浓缩区的 TLC 硅胶 60 板	Analytical Chromatograhy Millipore	1.11845.0001
碘片	Sigma-Aldrich	376558-50G
硫酸	Sigma-Aldrich	320501
氯化锰	Sigma-Aldrich	244589
UVP EC3 成像系统	Ultra-Violet Products Ltd.		使用 Vision Works LS 软件进行密度测定分析
共聚焦玻璃底培养皿	MatTek	P35G-1.5-10C	www.glassbottomdishes.com
新型隐球菌（H99）			来自杜克大学医学中心
YNB 培养基	BD	239210	请参阅制造商提供的配制说明。使用 20 g/L 的葡萄糖浓度。
脂多糖（LPS）	Sigma	L4391-1MG	用 1x PBS 溶解，配制成 1 mg/ml 储存液。-20 °C 保存。
干扰素-γ	Sigma	I4777	用 1x PBS 溶解，配制成 0.1 mg/ml 储存液
荚膜多糖抗体（抗-GXM）			由 Arturo Casadevall 实验室惠赠，浓度为 1.98 mg/ml
吉姆萨染液	MP Biomedicals	194591	将 0.8 g 吉姆萨染料溶于 25 ml 甘油中，60 °C 加热 1 小时。加入 25 ml 甲醇，室温陈化至少 1 个月后使用。
显微镜	Zeiss		Observer.D1 显微镜，配备 AxioCam MRm 相机用于图像采集