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方法文章

巨噬细胞胆固醇耗竭及其对吞噬作用的影响 新型隐球菌

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⸱

DOI：

10.3791/52432

⸱

2014年12月19日

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Genetics and Microbiology, Stony Brook University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种巨噬细胞感染的实验方案 新型隐球菌 还描述了一种从巨噬细胞中耗竭甾醇的方法。这些方案为研究真菌感染提供了指导 体外 并研究甾醇在这些感染中的作用。

摘要

隐球菌病是由隐球菌属的致病性真菌引起的一种危及生命的感染 隐球菌通过吸入孢子发生感染，孢子可在深部肺组织中复制。孢子被吞噬细胞吞噬后 隐球菌 被巨噬细胞吞噬是该疾病能够扩散至中枢神经系统并引发致命性脑膜脑炎的途径之一。因此，研究这种关联性对于 隐球菌 巨噬细胞在感染进展中的作用对于理解感染进程至关重要。本研究描述了一种逐步研究巨噬细胞感染性的实验方案。 C. neoformans体外. 利用本实验方案，研究宿主固醇在宿主-病原体相互作用中的作用。使用不同浓度的甲基-β-环糊精（MCD）从鼠类网状肉瘤巨噬细胞样细胞系 J774A.1 中去除胆固醇。通过市售胆固醇定量试剂盒和薄层色谱法对胆固醇的去除进行确认和定量。将去除胆固醇的细胞用脂多糖（LPS）和干扰素γ（IFNγ）激活后，接种经抗体调理的病原体 新型隐球菌 以1:1的效应细胞与靶细胞比例孵育野生型H99细胞。感染细胞在孵育2小时后进行监测。 C. neoformans 并计算其吞噬指数。胆固醇耗竭导致吞噬指数显著降低。本研究所提供的实验方案为在实验室环境中模拟感染过程的起始、以及研究宿主脂质组成对感染性的影响提供了便捷的方法。

引言

吞噬作用是一种宿主细胞将胞外实体内化的过程。它是免疫系统防御病原体的重要武器，但该过程常被病原体所劫持，以实现其自身内化并在体内扩散1。吞噬作用由一系列信号事件介导，这些信号通过宿主细胞骨架的重排，导致病原体的附着与吞噬。所谓的“专职”吞噬细胞能够识别并结合入侵病原体表面的调理素，从而触发附着信号以及伪足的形成，伪足包裹病原体并形成吞噬体2。巨噬细胞即属于此类“专职”吞噬细胞。巨噬细胞是高度特化的细胞，执行多种保护性功能，包括识别并清除致病因子、修复受损组织以及调节炎症反应，其中大多数功能通过吞噬作用实现1,2。

Cryptococcus neoformans 是一种致病性酵母菌，可引起一种称为隐球菌病的严重疾病。Cryptococcus 的孢子被宿主吸入后，会导致肺部感染，通常无明显症状。据认为，人群暴露极为普遍；一项对布朗克斯-黎巴嫩医疗中心儿科传染病门诊61名儿童的调查显示，所有受检者体内均检测到针对 隐球菌多糖葡糖醛酸木甘露聚糖的抗体，其他研究也显示，在未感染和已感染人类免疫缺陷病毒（HIV）的成年人群中均存在较高的暴露率3,4。 肺泡巨噬细胞是应对肺部感染的第一道防线，在大多数情况下能够成功清除病原体。然而，在免疫功能低下个体（例如，HIV 和艾滋病患者）中，该酵母菌可在巨噬细胞内存活。在此类情况下，巨噬细胞可为病原体的复制提供生态位，并可能促进其向中枢神经系统（CNS）播散，导致疾病进展为致命性结局5–8。有研究认为，巨噬细胞甚至可能通过“特洛伊木马”模型将酵母菌直接带入脑膜，协助其穿越血脑屏障3,9–11。因此，深入了解吞噬作用的过程及其影响因素，尤其是在隐球菌感染中的作用机制，具有重要意义。

在其他病原体系统中的前期研究表明，胆固醇及其形成的脂筏在吞噬作用中具有重要作用12–15。胆固醇是哺乳动物细胞中最丰富的脂质成分，占哺乳动物细胞膜的25%至50%16。研究发现，它可通过改变细胞膜的刚性来调节膜的生物物理特性17。胆固醇与鞘脂共同在细胞膜内形成称为脂筏的脂质微区。脂筏已被发现参与小窝（caveolae）的形成，并为某些类型的信号传导提供独立的结构域16–18。由于脂筏尺寸微小，体内（in vivo）研究较为困难。研究脂筏功能的一种有效方法是改变其组成成分。甲基-β-环糊精（Methyl-β-cyclodextrin, MβCD）是一种可从哺乳动物细胞膜中去除胆固醇的化合物，常被用于研究脂筏的作用18。

在本实验方案中，我们介绍了一种从宿主细胞膜中去除胆固醇，并定量分析胆固醇减少对宿主细胞体外吞噬C. neoformans能力影响的方法。该实验利用永生化的类似巨噬细胞的细胞系（J774A.1）作为感染模型，采用细胞培养技术进行操作。通过使用甲基-β-环糊精（MβCD）处理实现胆固醇的耗竭，MβCD具有一个对甾醇大小特异的疏水核心，可作为胆固醇的“受体”将其从细胞膜中提取出来19。胆固醇的耗竭程度通过商用试剂盒进行定量测定，并结合改良的Bligh-Dyer脂质提取法及薄层色谱法（TLC）进行定性分析20。通过用调理过的酵母菌与干扰素-γ和脂多糖混合物共同感染细胞系以激活巨噬细胞，从而检测吞噬作用。隐球菌（Cryptococcus）使用葡糖醛酸木甘露聚糖（GXM）抗体进行调理21–23。染色与显微镜实验使细胞可视化，并用于计算吞噬指数，以评估吞噬作用的程度。综上所述，本方案描述了一种将脂质组成改变与生理过程相结合的基础研究方法。

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方案

1. 使用 MβCD 对 J774A.1 细胞进行胆固醇耗竭

  1. 在无菌生物安全柜中，将 105 个 J774A.1 类似巨噬细胞接种至 96 孔细胞培养板的每孔中，每孔加入 200 μl 添加了 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素/链霉素（P/S）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）。于 37 °C、5% CO2 条件下过夜培养。
  2. 移除细胞单层上的培养基，并用经过滤或高压灭菌的 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞两次。
  3. 每孔加入 200 μl 所需浓度的 MβCD 溶液（10 mM 或 30 mM，溶于 PBS）或仅加入 1× PBS 作为对照，于 37 °C 振荡孵育 30 分钟。移除上清液并室温保存，随后立即使用市售试剂盒进行定量分析。
  4. 用 1× PBS 或无血清 DMEM 洗涤细胞两至三次，随后继续进行感染实验，或使用去离子 H2O 吹打两至三次以裂解细胞，用于薄层色谱分析或试剂盒检测。
    注意：胆固醇耗竭后可使用市售胆固醇定量试剂盒。详见材料部分。请严格按照制造商说明书操作。

2. 薄层色谱法（TLC）观察胆固醇含量

  1. 用丙酮清洗薄层色谱（TLC）槽两次，再用石油醚:乙醚:乙酸（体积比65:30:1）溶液清洗一次。用石油醚:乙醚:乙酸（体积比65:30:1）溶液饱和TLC槽，并过夜放置。
    注意：有机溶剂必须始终在通风橱中使用，以避免吸入蒸气。操作时应始终佩戴手套和实验服。乙酸为强酸，使用时应谨慎。
  2. 在无菌生物安全柜中，将106个J774A.1类巨噬细胞接种至6孔细胞培养板的每孔中，每孔加入5 ml含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素（P/S）的预温DMEM培养基。于37 °C、5% CO2条件下孵育过夜。
  3. 通过执行步骤1.2–1.4进行巨噬细胞胆固醇耗竭，根据孔径增大，将原步骤中200 μl的体积替换为1 ml。
  4. 向每孔加入500 μl胰蛋白酶-EDTA溶液，于37 °C孵育3分钟，然后用细胞刮轻轻刮下细胞。
  5. 将细胞悬液转移至微量离心管中，并额外加入500 μl含10% FBS和1% P/S的预温DMEM培养基。
  6. 以300 × g离心5分钟，弃去上清液。
  7. 向细胞沉淀中加入500 μl含10% FBS和1% P/S的预温DMEM培养基，通过反复吹打小心重悬细胞。
  8. 取10 μl细胞悬液，使用血细胞计数板进行细胞计数。根据计数结果调整各样品的细胞浓度，使各组细胞数量相等后分装至玻璃离心管中。
    注意：在此步骤中，可选择将相同处理组的细胞合并，以获得浓度更高的最终脂质提取物。
  9. 于室温下以300 × g离心5分钟，弃去培养基。
  10. 加入2 ml甲醇并涡旋混匀。然后加入1 ml氯仿并再次涡旋。检查相态，确保溶液为单相体系。
    注意：样品管可在4 °C过夜保存。
  11. 于室温下以1,700 × g离心10分钟，将上清液转移至新离心管中。
  12. 加入1 ml氯仿，随后加入1 ml去离子水（dH2O），每次加入后涡旋30秒，共两次。于室温下以1,700 × g离心5分钟。
  13. 使用精密天平称量一个玻璃离心管的重量，用玻璃巴斯德吸管将下层有机相转移至已知重量的玻璃管中。
  14. 将脂质在离心式浓缩仪中干燥至完全干燥（约2小时）。称量含干燥脂质的玻璃管重量，计算干燥脂质的净重。
    注意：干燥后的脂质可在-20 °C保存，直至进行薄层色谱分析。
  15. 将干燥脂质溶于适量氯仿中，以标准化脂质浓度（通常为20–50 µl），取20 µl稀释后的样品点样于硅胶TLC板上。同时将20 μg胆固醇溶于20 μl氯仿作为标准品点样。
  16. 将干燥的TLC板放入已饱和的TLC槽中，待溶剂前沿上升至距板边缘约1 cm处时取出，置于空气中干燥约5分钟。
  17. 通过将TLC板置于碘蒸气显色缸中观察脂质条带的迁移情况。取出后在通风橱中放置约10–15分钟，使斑点逐渐褪色。
    注意：碘具有吸入毒性，操作时必须在通风橱中进行。
  18. 配制中性脂染色液：将60 ml甲醇与60 ml去离子H2O混合，加入4 ml浓硫酸和630 mg氯化锰。
  19. 将TLC板小心缓慢地浸入盛有中性脂染色液的托盘中，取出时避免刮落硅胶层。
    注意：中性脂染色液可重复使用多次，因此可从托盘中回收并储存于瓶中以备后续使用。
  20. 将TLC板置于通风橱中室温下干燥，直至所有气泡完全消失。将板置于设定为160 °C的加热金属块上加热，炭化至所需颜色。
    注意：可使用如Vision Works LS等密度分析软件对炭化后的条带进行定量，以比较不同脂质样品。

3. 用C. neoformans (H99)感染巨噬细胞

  1. 在无菌生物安全柜中，接种105 每孔加入200 μl含10% FBS和1% P/S的DMEM培养基，接种巨噬细胞样细胞至96孔细胞培养板，每孔细胞数量一致。于37 °C、5% CO₂条件下培养。2, 5% CO2 过夜
    注意：也可在玻璃底共聚焦培养皿中进行感染，以便于成像；所有试剂用量保持不变。
  2. 培养一种培养物 C. neoformans （H99）通过将一株从划线平板上获得的单菌落接种于10 ml YNB培养基中，并在30 °C条件下振荡培养过夜。
  3. 洗涤并计数 C. neoformans (H99) 细胞
    1. 离心 C. neoformans 4 °C、1,700 × g 条件下离心培养过夜 10 分钟。
    2. 移除培养基并弃去。用 5 ml 1× PBS 清洗细胞。在 4 °C 下以 1,700 × g 离心 10 分钟。
    3. 移除 PBS，加入 5 ml 过滤后的 1×PBS 洗涤。在 4 °C 下以 1,700 × g 离心 10 分钟。重复此步骤 2 次。
    4. 移除 PBS，加入 5 ml 1×PBS 重悬。
    5. 在 PBS 中进行系列稀释，以获得洗涤后菌液的 1:500 稀释度。
      1. 将100 μl原始样品加入900 μl 1x PBS中，得到1:10的稀释液。
      2. 将100 μl 1:10稀释的样本加入900 μl 1x PBS中，得到1:100的稀释液。
      3. 将200 μl 1:100稀释的样品加入800 μl 1x PBS中，得到1:500的稀释液
    6. 取10 μl 1:500稀释液，用血细胞计数板计数以计算细胞数量。
  4. 制备用于激活巨噬细胞和调理作用的工作溶液 C. neoformans
    1. 将LPS和IFNγ的储存液按1:100稀释，取10 μl加入990 μl中。
      注意：LPS 和 IFNγ 可用于增强吞噬细胞的摄取能力，但并非吞噬作用所必需。若需研究巨噬细胞的杀真菌活性，应在感染前于 37 °C 振荡条件下活化过夜。
    2. 每份样品中加入 7.5 μl 稀释后的 LPS、1.25 μl 稀释后的 IFNγ、1.25 μl GXM 抗体以及相应体积的 C. neoformans 培养物提供 1.25 x 105 细胞。用含10% FBS和1% P/S的DMEM将体积补至250 μl乘以样本数量。
    3. 涡旋并振荡孵育溶液，在 37 °C 下孵育 20 分钟。
      注意：胆固醇耗竭（步骤 1.2 - 1.4）可与调理作用步骤同时进行。务必在混合工作液之前处理巨噬细胞，因为调理后的细胞在步骤 3.4.3 孵育后应于 20 分钟内尽快使用。
  5. 感染巨噬细胞
    1. 用无血清DMEM洗涤巨噬细胞两次，并加入200 μl的调理化颗粒 C. neoformans 每孔加入工作液。
    2. 37 °C 下孵育 2 小时。
  6. 固定与染色细胞
    1. 吸除培养基，用 DMEM 洗涤细胞 2 次。
    2. 将细胞单层室温干燥10分钟，加入200 μl预冷的甲醇固定细胞。
    3. 室温孵育15分钟，去除残留的甲醇。
    4. 加入200 μl 10倍稀释的吉姆萨染液，室温孵育5分钟。
    5. 用去离子水洗涤2 - 3次，敞口过夜干燥。
      注意：染色后可于次日或最多一周内进行成像。
  7. 可视化与计数
    1. 使用显微镜，每个数据点计数300个细胞（若为相同处理的两个样本，则每孔计数150个），并记录感染的巨噬细胞数量及吞噬的病原体数量 隐球菌 细胞.
      注意：为确保每个数据点取样均匀，每种条件使用2个培养板，每板选择3个无重叠的区域，每区域计数50个细胞。
    2. 通过将感染的巨噬细胞百分比乘以平均感染数量来计算吞噬指数 C. neoformans 每个巨噬细胞。通过将数值表示为1×PBS处理对照组的百分比来标准化吞噬指数。经过多次试验后，计算吞噬指数的平均值及平均值的标准差，以确定其变化趋势。采用学生t检验确定显著性差异。
    3. 在1,000倍或400倍放大倍数下拍摄细胞显微照片。

4. 台盼蓝染色法检测

  1. 在无菌生物安全柜中，将 106 个类巨噬细胞以每孔 5 ml 的体积接种于 6 孔细胞培养板中，培养基为添加了 10% 胎牛血清和 1% 青霉素/链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）。于 37 °C、5% CO2 条件下过夜培养。
  2. 通过执行步骤 1.2 - 1.4 耗竭巨噬细胞中的胆固醇，根据孔径增大相应将 200 μl 替换为 2 ml。
    注意：务必设置以 1x PBS 处理的对照组，以及在任何处理前即刮取细胞的对照组。
  3. 向每孔加入 500 μl 的 1x PBS，用细胞刮轻轻刮取细胞。将细胞转移至微量离心管中，并通过轻柔吹打重悬细胞。
  4. 取 10 μl 细胞悬液，加入 1 μl 的 4% 台盼蓝染色液。
  5. 使用血细胞计数板计数细胞，并按以下公式计算细胞活力：% 活力 = [1 - (蓝色细胞数 / 总细胞数)] × 100。将数值归一化至未经处理的对照组。经过多次实验后，计算平均值和标准差以分析细胞活力的变化趋势。采用学生 t 检验判断差异的显著性。

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结果

胆固醇耗竭

按照Amplex Red胆固醇检测试剂盒的制造商说明书，对方案第1.3步中保留的上清液进行分析，结果显示经MβCD处理的样本中胆固醇浓度高于1x PBS对照组。胆固醇的耗竭程度取决于细胞类型及所用MβCD浓度。对于使用10 mM MβCD处理的J774细胞，观察到约50%的胆固醇被耗竭。耗竭率可通过第1.4步中获得的上清液和细胞裂解液的测定值进行计算（图1）。

使用薄层色谱法（TLC）分析细胞裂解液，结果显示，经MβCD浓度递增处理的细胞中，胆固醇染色明显减弱（图2A）。TLC的密度测定分析结果与定量检测呈现相似趋势（图2B）。Bligh-Dyer法可获得总脂质的粗提物，为利用胆固醇标准品准确识别目标条带，必须确保脂质充分分离。

感染

完成感染操作后，细胞仍保持贴壁且完整。不同处理组之间的细胞形态未发生变化。未暴露于...

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讨论

在使用本实验方案时，接种哺乳动物细胞和调理化新型隐球菌（C. neoformans）细胞过程中获得准确的细胞计数至关重要。这可以最大限度地减少实验重复之间的差异，并确保在整个研究过程中效应细胞与靶细胞保持准确的1:1比例。此外，必须协调好胆固醇耗竭与感染步骤的时间，以避免调理后的酵母细胞或经处理的巨噬细胞在实验步骤之间于室温下静置。过长的等待时间可能导致抗体调理作用丧失，或在感染开始前胆固醇水平重新恢复。若实验操作精确，数据分析将有助于明确胆固醇在吞噬作用中的作用。

该技术的局限性使得无法得出关于胆固醇耗竭降低类似巨噬细胞吞噬指数的具体机制的任何结论，目前尚不清楚该效应是直接由胆固醇引起，还是由次级机制所致。后续研究可进一步探讨脂筏的其他组分，例如鞘脂类或已知参与吞噬作用的蛋白质，如 Fcγ 受体和补体受体 3 2。通过修改本技术，分别单独使用抗体调理或补体调理，可能有助于区分胆固醇在上述两条已知通路中所起的作用。还需注意的是，MβCD 是基于胆固醇的疏水性和分子大小来提取胆固醇的，因此结构大小相似的甾醇也可能被耗竭，并在薄层色谱（TLC）中...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作获得了美国国立卫生研究院（NIH）资助项目AI56168、AI71142、AI87541和AI100631的支持，项目负责人为MDP。Maurizio Del Poeta是美国卫生保健研究基金会（Burroughs Wellcome Fund）传染病研究学者。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
II 级 A2 型生物安全柜Labconco3460009
J774A.1 细胞系ATCCTIB-67冷冻状态送达。请参阅 ATCC 提供的细胞培养说明。
Dulbecco’s 改良伊格尔培养基（DMEM）Gibco11995-0654 °C 保存，使用前升温至 37 °C
HI 优质胎牛血清（Performance Plus）Gibco10082-147-20 °C 冷冻保存，添加至 DMEM 前需解冻
青霉素-链霉素溶液（10,000 U/ml）Gibco15140-122用于补充 DMEM 培养基
Isotemp 细胞培养箱Fisher Scientific型号 # 3530
96 孔培养板Corning Inc. Costar3595
10x 磷酸盐缓冲液（PBS）Fisher Scientific BioReagentsBP3994使用前稀释为 1x，并过滤或高压灭菌。
甲基-β-环糊精Sigma Life ScienceC4555-10G用 1x PBS 溶解，配制 10 mM 和 30 mM 浓度的溶液
轨道摇床Labline
Amplex Red 胆固醇检测试剂盒Life Technologies Molecular ProbesA12216胆固醇检测所需全部试剂均包含于试剂盒内。请遵循制造商说明书操作。
96 孔黑色检测板Corning Inc. Costar3603
FilterMax 微孔板读板仪Molecular Devices型号 F5
TLC 展开槽Sigma-AldrichZ126195-1EA
氯仿Sigma-Aldrich650498-4L
甲醇Sigma-Aldrich34860-2L-R
TLC 滤纸Whatman3030917根据 TLC 展开槽尺寸裁剪使用
通风橱符合 AIHA/ANSI 标准的任意通风橱
6 孔板Corning Inc. Costar3506
胰蛋白酶-EDTA 溶液Gibco25300-054
细胞刮刀Corning Inc. Costar3010
血细胞计数板Hausser Scientific1490
离心机Beckman Coulter型号 Alegra x-30R
涡旋混合器Fisher Scientific12-812
天平Mettler Toledo型号 # MS104S，可精确至 0.1 mg
玻璃巴斯德吸管Fisherbrand13-678-20A
胆固醇Avanti Polar Lipids700000
SpeedVac 浓缩仪Thermo Scientific型号 # SPD2010
石油醚Fisher ScientificE139-1
乙醚Sigma-Aldrich309966
乙酸Sigma-Aldrich320099
带浓缩区的 TLC 硅胶 60 板Analytical Chromatograhy Millipore1.11845.0001
碘片Sigma-Aldrich376558-50G
硫酸Sigma-Aldrich320501
氯化锰Sigma-Aldrich244589
UVP EC3 成像系统Ultra-Violet Products Ltd.使用 Vision Works LS 软件进行密度测定分析
共聚焦玻璃底培养皿MatTekP35G-1.5-10Cwww.glassbottomdishes.com
新型隐球菌（H99）来自杜克大学医学中心
YNB 培养基BD239210请参阅制造商提供的配制说明。使用 20 g/L 的葡萄糖浓度。
脂多糖（LPS）SigmaL4391-1MG用 1x PBS 溶解，配制成 1 mg/ml 储存液。-20 °C 保存。
干扰素-γSigmaI4777用 1x PBS 溶解，配制成 0.1 mg/ml 储存液
荚膜多糖抗体（抗-GXM）由 Arturo Casadevall 实验室惠赠，浓度为 1.98 mg/ml
吉姆萨染液MP Biomedicals194591将 0.8 g 吉姆萨染料溶于 25 ml 甘油中，60 °C 加热 1 小时。加入 25 ml 甲醇，室温陈化至少 1 个月后使用。
显微镜ZeissObserver.D1 显微镜，配备 AxioCam MRm 相机用于图像采集

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