本研究比较了不同生产平台中目标人源重组蛋白的表达。我们重点探讨了基于传统发酵罐的培养系统和植物系统，分别描述了每种系统的建立过程，并根据已报道的结果，阐明了各平台固有的局限性和优势。
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方法文章
不同生物反应器中重组蛋白表达的比较分析：细菌、昆虫细胞与植物系统
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
基于植物的系统因其在灵活、低成本地生产高质量、具有生物活性的重组蛋白方面已得到充分证实的潜力，而被视为一种重要的生产平台。
本研究中，我们比较了目标人源重组蛋白在基于传统发酵罐的细胞培养系统（细菌和昆虫）与基于植物的表达系统（瞬时和稳定表达）中的表达情况。
针对每种平台，我们描述了其建立、优化及生产过程所需时间，最终产品的质量、产量，并评估了针对所选目标重组蛋白的初步生产成本。
总体而言，我们的结果表明，由于目标蛋白会在细菌中形成不溶性包涵体而积累，因此细菌不适合用于该蛋白的生产。相比之下，基于植物的表达系统是一种多功能平台，其生产所选蛋白的成本低于杆状病毒/昆虫细胞系统。特别是，稳定转基因品系表现出最高的终产物产量，而瞬时表达植物则具有最快的过程开发速度。然而，并非所有重组蛋白都适用于基于植物的表达系统，最佳生产平台应通过经验确定，采用逐案分析的方法，如本文所述。
引言
利用新兴的生物技术工具，重组蛋白可在异源表达系统中进行商业化大规模生产。选择异源表达系统时需考虑的关键因素包括：蛋白质量、功能活性、工艺速度、产量和成本。
在重组蛋白领域，药品市场正在迅速扩张，因此目前生产的大多数生物制药均为重组蛋白。蛋白质可在细菌、酵母、霉菌、哺乳动物、植物和昆虫的细胞培养体系中表达，也可在植物系统（通过稳定转化或瞬时转化）以及转基因动物中表达；每种表达系统都有其固有的优势和局限性，针对每一种目标重组蛋白，都必须仔细评估其最优的生产系统。
基于植物的表达平台正作为一种重要替代方案，用于安全且经济高效地生产重组蛋白，以取代传统的基于发酵罐的系统。尽管其下游加工成本与微生物和哺乳动物细胞相当，但植物系统在商业化生产中所需的前期投资较低，且通过大面积种植可实现规模经济效益，这是其关键优势。
我们评估了植物作为生物反应器表达人源谷氨酸脱羧酶65 kDa亚型（hGAD65）的可行性，hGAD65是1型自身免疫性糖尿病（T1D）的主要自身抗原之一。hGAD65目前被广泛用作疾病分类和监测疾病进展的标志物，其在T1D预防中的作用正在临床试验中进行研究。如果这些试验取得成功，全球对重组hGAD65的需求将急剧增加。
本文重点研究人谷氨酸脱羧酶65（hGAD65）的酶失活突变体hGAD65mut的表达，该突变....
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方案
1. 表达载体的构建
- 商业化重组克隆系统：
- 使用适当的引物扩增目的基因（hGAD65mut）的全长序列，引物设计需允许在基因5’端添加CACC接头，具体方法如前所述2。
- 根据定向克隆试剂盒说明书，将经凝胶纯化的扩增产物克隆至入门载体（与拓扑异构酶结合）中。反应体系总体积为6 µl，插入片段与载体的摩尔比为1.5:1，并加入1 µl盐溶液（0.2 M NaCl 和 0.01 M MgCl2）。室温（RT）孵育5分钟。
- 将整个反应体系转化至化学感受态E. coli细胞中，按照定向克隆试剂盒说明书操作，并使用试剂盒提供的M13正向和反向引物通过菌落PCR3筛选阳性克隆。从阳性克隆中提取质粒DNA，按照质粒DNA提取试剂盒说明书操作，并使用M13正向和反向引物对插入片段进行测序，以确认无突变发生3。
- 利用获得的入门克隆，通过Lambda重组酶Clonase II酶（LR）与特定的目的载体进行重组反应：用于在细菌细胞中表达重组蛋白的pDEST17（得到pDEST17.G65mut），用于植物（瞬时或稳定表达）的pK7WG2（得到pK7WG2.G65mut），以及用于杆状病毒/昆虫细胞系统的线性化病毒DNA（得到Baculo.G65mut）4。根据Clonase试剂盒说明书，将100 ng入门载体、150....
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结果
本文描述了一种在不同生产系统中异源表达目标重组蛋白的实验设计。首先重点建立了各个平台，通过确定目标蛋白在每种系统中表达的最优条件来完成平台的构建。
在三份重复的 E. coli 培养物中诱导表达目标蛋白 hGAD65mut。在 37 °C 条件下表达 3 小时后，通过离心收集菌体，并采用超声破碎法裂解细胞。经过一次离心步骤后，将可溶性蛋白与不溶性包涵体分离，初步分析表明 hGAD65mut 主要积累于不溶性包涵体中（数据未显示）。重组蛋白的溶解需要使用 6 M 尿素，但由于尿素具有强烈的变性作用，会干扰放射免疫分析（RIA），从而无法对 hGAD65mut 进行准确定量。已有多种策略被报道可用于减少包涵体的形成，其中包括在低温条件下培养微生物细胞11。本实验中，将培养物分别在 15 °C 和 20 °C 下生长，并在相同温度下诱导重组蛋白表达。如图 1A所示，在这两个温度下产生的 hGAD65mut 的溶解仍需依赖尿素（泳道 S2）。因此，在本实验条件下，低温并不能阻止 hGAD65mut 形成不溶性聚集体。.......
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讨论
本研究比较了三种不同平台表达一种重组人源蛋白的效果：细菌细胞、杆状病毒/昆虫细胞和植物。进一步利用三种广泛应用的植物表达技术对基于植物的表达平台进行了深入探索（即，瞬时表达系统（基于MagnICON和pK7WG2）和稳定表达系统。本实验选用的目标蛋白hGAD65mut此前已在不同表达系统中进行过表达13，其产生和功能易于检测和测量14.
细菌细胞不是一种有效的生产平台，因为即使在低温培养条件下，hGAD65mut 仍会形成包涵体，因此需要繁琐的溶解和复性步骤才能获得其天然构象。事实上，该平台在表达复杂重组蛋白时的主要缺陷在于最终产物的正确构象难以形成。
杆状病毒/昆虫细胞表达系统可实现免疫反应性重组蛋白的高效表达，但该表达系统的主要局限在于培养昆虫细胞所需的培养基成本较高。据估算，在此生产平台上生产1克hGAD65mut的总成本可达700欧元（按需使用9升昆虫细胞培养基计算）。该表达系统的另一局限是昆虫细胞培养需在无菌条件下进行，要求操作人员具备无菌操作技能。为确保.......
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披露
作者声明，本文发表不存在利益冲突。
致谢
本工作得到了COST行动“分子农业：植物作为高价值蛋白质生产平台”FA0804的支持。作者感谢Anatoli Giritch博士和Yuri Gleba教授为研究目的提供MagnICON载体。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 酵母提取物 | Sigma | Y1333 | |
| 胰蛋白胨 | Formedium | TRP03 | |
| 细菌级琼脂 | Applichem | A0949 | |
| Sf-900 II SFM 培养基 | Gibco | 10902-088 | |
| Grace’s 昆虫培养基（未添加补充物） | Gibco | 11595-030 | |
| Cellfectin II 试剂 | Invitrogen | 10362-100 | |
| 含维生素的 MS 培养基 | Duchefa Biochemie | M0222 | |
| 蔗糖 | Duchefa Biochemie | S0809 | |
| 植物琼脂 | Duchefa Biochemie | P1001 | |
| 氨苄青霉素钠 | Duchefa Biochemie | A0104 | 有毒 |
| 硫酸庆大霉素 | Duchefa Biochemie | G0124 | 有毒 |
| 更昔洛韦 | Invitrogen | I2562-023 | |
| 羧苄青霉素二钠 | Duchefa Biochemie | C0109 | 有毒 |
| 硫酸卡那霉素 | Sigma | K4000 | 有毒 |
| 利福平 | Duchefa Biochemie | R0146 | 有毒 – DMSO 中 25 mg/ml 储存液 |
| 硫酸链霉素 | Duchefa Biochemie | S0148 | 有毒 |
| 盐酸双氢链霉素 | Duchefa Biochemie | S0188 | |
| IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷） | Sigma | I5502 | 有毒 |
| MES 水合物 | Sigma | M8250 | |
| MgCl2 | Biochemical | 436994U | |
| 乙酰丁香酮 | Sigma | D134406 | 有毒 – DMSO 中 0.1 M 储存液 |
| 注射器（1 ml） | Terumo | ||
| MgSO4 | Fluka | 63136 | |
| BAP（6-苄氨基嘌呤） | Sigma | B3408 | 有毒 |
| NAA（萘乙酸） | Duchefa Biochemie | N0903 | 刺激性 |
| 头孢噻肟 | Mylan Generics | ||
| Trizma 碱 | Sigma | T1503 | 用 1 N HCl 调节 pH 以制备 Tris-HCl 缓冲液 |
| HCl | Sigma | H1758 | 腐蚀性 |
| NaCl | Sigma | S3014 | 1 M 储存液 |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S7907 | |
| KH2PO4 | Sigma | P9791 | |
| PMSF（苯甲基磺酰氟） | Sigma | P7626 | 腐蚀性，有毒 |
| 尿素 | Sigma | U5378 | |
| β-巯基乙醇 | Sigma | M3148 | 有毒 |
| Tween-20 | Sigma | P5927 | |
| Hepes | Sigma | H3375 | |
| DTT（二硫苏糖醇） | Sigma | D0632 | 有毒 – 1 M 储存液，-20 °C 保存 |
| CHAPS | Duchefa Biochemie | C1374 | 有毒 |
| 植物蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma | P9599 | 避免反复冻融 |
| SDS（十二烷基硫酸钠） | Sigma | L3771 | 易燃，有毒，腐蚀性 – 10% 储存液 |
| 甘油 | Sigma | G5516 | |
| 考马斯亮蓝 R-250 | Sigma | B7920 | |
| 异丙醇 | Sigma | 24137 | 易燃 |
| 乙酸 | Sigma | 27221 | 腐蚀性 |
| 抗谷氨酸脱羧酶 65/67 抗体 | Sigma | G5163 | 避免反复冻融 |
| 辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗兔抗体 | Sigma | A6154 | 避免反复冻融 |
| Sf9 细胞 | Life Technologies | 11496 | |
| BL21 感受态 E. coli | New England Biolabs | C2530H | |
| 蛋白 A Sepharose | Sigma | P2545 | |
| 细胞培养板 | Sigma | CLS3516 | |
| 放射免疫分析试剂盒 | Techno Genetics | 12650805 | 放射性物质 |
参考文献
- Hampe, C. S., Hammerle, L. P., Falorni, A., Robertson, J., Lernmark, A. Site-directed mutagenesis of K396R of the 65 kDa glutamic acid decarboxylase active site obliterates enzyme activity but not antibody binding. FEBS Lett. 488 (3), 185-189 (2001).
- Avesani, L., et al.
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