本研究的目的是 该方案旨在建立一种可用于肥大细胞分泌功能基因组学分析的方法。该方法基于对与目的基因共转染的荧光报告基因释放量的定量评估，并结合实时检测 分泌颗粒形态的分析。
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摘要
摘要
肥大细胞（Mast Cells, MC）是免疫系统的分泌性细胞，通过释放预先形成和新合成的过敏性、炎症性及免疫调节性介质来执行其生理与病理功能。MC 的介质作用于多种组织和器官，最终引发过敏反应和免疫应答。MC 介质的合成、储存和释放受到高度调控。预先形成的介质被包裹在胞质分泌颗粒 (SG) 中，这些颗粒与质膜融合，并通过调控性胞吐作用释放其内容物。本文介绍了一种实验方案，该方案基于目的基因与一种靶向 SG 并随内源性 SG 介质以调控方式共同释放的报告基因共表达。该方案可实现对 MC SG 的高分辨率四维共聚焦分析，实时监测其从生物合成到触发胞吐的全过程。因此，利用该方案筛选目的基因对其表型和功能的影响，有助于解析调控 MC SG 生物合成与胞吐的分子机制，并鉴定其中涉及的调控因子。从而为进一步理解肥大细胞在生理与疾病状态下的细胞机制提供新的见解。
引言
肥大细胞（MC）是一类免疫细胞，最广为人知的是其在过敏和炎症反应中的作用，例如关节炎、哮喘、嗜酸性食管炎、慢性皮炎以及过敏性休克1,2，也参与包括冠状动脉疾病3,5和癌症3,4在内的其他多种病理过程。此外，肥大细胞在先天性和适应性免疫中均发挥重要作用，既可在宿主防御细菌和寄生虫感染中发挥作用，也可通过抑制免疫反应来调节免疫应答，例如诱导同种异体移植物耐受5,6。
肥大细胞（MCs）起源于骨髓，由CD34+/CD117+多能祖细胞发育而来7。已定向分化的骨髓肥大细胞 祖细胞被释放入血流，并迁移至外周组织，主要定位于结缔组织和上皮表面8。在周围微环境中细胞因子的影响下，最终完成成熟和终末分化8,9。
肥大细胞（MC）可被变应原（抗原，Ag）激活，该变应原的初次接触可诱导机体产生免疫球蛋白E（IgE）类抗体。当此类IgE与肥大细胞表面的FcεRI受体结合后，若再次接触相同抗原，则可导致细胞表面结合的IgE发生交联，从而引起FcεRI受体聚集，启动信号转导级联反应，最终导致细胞脱颗粒[综述见10,11]。肥大细胞亦可通过非IgE依赖途径被激活，例如由神经肽5,12、毒素13、细菌和病毒抗原14,15、一类带正电荷的多肽（统称为碱性促分泌物）、免疫细胞及细胞因子5,13,12,16,17所激活。此外，肥大细胞还可被其自身释放的多种介质激活，从而进一步放大炎症反应。
MCs 含有大量分泌颗粒（SGs），其中包含免疫调节介质，如血管活性胺（例如组胺和啮齿类动物中的5-羟色胺）、蛋白聚糖、蛋白酶（如类胰蛋白酶和糜蛋白酶）、血管内皮生长因子以及多种细胞因子和趋化因子 8,9这些介质处于“即刻释放”状态，一旦肥大细胞（MCs）被适当刺激物激活，便会通过调节性胞吐（脱颗粒）在数秒至数分钟内迅速释放这些介质。 18,19随后，这一初始事件会引发 从头合成 花生四烯酸代谢物、多种细胞因子和趋化因子的合成与释放 20,21,22新合成产物的释放与SG释放无关。这些介质共同引发早期和晚期的炎症及过敏反应。因此，阐明肥大细胞活化与脱颗粒的机制具有重要的理论和临床意义。
原代和培养的肥大细胞（MC）难以进行遗传操作，这阻碍了对肥大细胞脱颗粒机制的深入研究，导致该机制至今仍不明确。为解决这一问题，我们开发了一种基于报告基因的检测方法，将感兴趣的基因与单体红色荧光蛋白（mRFP）融合的神经肽Y（NPY）共同转染入黏膜肥大细胞系大鼠嗜碱性白血病细胞（RBL）-2H3（以下简称RBL）或骨髓来源的肥大细胞 （BMMCs）30，其中NPY-mRFP作为分泌颗粒（SG）的报告分子。
NPY 既往已被证明可在其他系统中重现内源性分泌颗粒（SG）标志物的行为。此外，由于 mRFP 荧光对 pH 不敏感，表达 NPY-mRFP 可实现对酸性分泌颗粒的可视化，并利用 96 孔板和荧光酶标仪对胞吐作用进行定量评估。我们已证实，NPY-mRFP 可被递送至 RBL 细胞和 BMMC 的酸性分泌颗粒中，并以受调控的方式与内源性分泌颗粒内容物一同释放出细胞。 货物（即β-己糖胺酶和5-羟色胺 30,32 本方案提供了一种基于高分辨率成像的方法学，可用于筛选目的基因对RBL细胞中嗜碱性粒细胞颗粒（SG）特征及脱颗粒表型与功能的影响。 32具体而言，该方案可实现对肥大细胞（MC）分泌颗粒（SGs）的实时追踪，并可在不同条件下定量分析其面积或体积大小、数量、组装动力学、沿细胞骨架的运动以及最终与质膜的融合过程。例如，在不同干扰条件下，用DNP特异性IgE致敏细胞，并通过多价抗原（DNP偶联血清白蛋白）触发细胞反应即，对目的基因进行敲低、过表达野生型或突变型基因，或进行药理学干预，并与对照细胞进行比较。
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方案
1. RBL 细胞培养基的制备
- 将500 ml低糖Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）与56 ml胎牛血清（终浓度为10% FBS）混合，然后加入5.5 ml青霉素-链霉素溶液（终浓度约为1% PEST）。
- 使用孔径为0.22 μm的500–1,000 ml瓶顶式真空滤器过滤培养基，并于4 °C保存。
2. RBL 细胞的培养
- 在37 °C、5% CO2的湿化环境中，于培养板或培养瓶中培养RBL细胞。在10 cm培养板中生长的RBL细胞应添加10 ml培养基，形成约107个细胞/板的融合单层。
- 当细胞层接近融合时，以较低密度重新接种 细胞。
- 使用连接真空泵的无菌巴斯德吸管从培养板/瓶中移除培养基。
- 用预热（37 °C）的0.25%胰蛋白酶/EDTA溶液冲洗细胞单层，使其完全覆盖单层（体积取决于培养板/瓶的大小；10 cm板使用2 ml）。此步骤将使细胞脱离。
- 或者，先用磷酸盐缓冲盐水（PBS）冲洗细胞单层，移除PBS后加入预热（37 °C）的胰蛋白酶/EDTA溶液。此方法可更快地使细胞脱离。
- 将培养板/瓶置于37 °C培养箱中（不超过10分钟）。
- 在光学显微镜下观察细胞，检查其是否已脱离。若10分钟后细胞仍未脱离，可轻轻敲击培养板/瓶。
- 向培养板/瓶中加入培养基以重悬细胞（培养基体积应至少为胰蛋白酶溶液体积的2倍）。
- 在25 °C下以200 g离心3分钟，使细胞沉淀。
- 将细胞重悬于培养基中。按1:10比例稀释后接种至新的培养皿中。培养48–72小时，直至细胞融合度达到约90%。
- 重复相同操作（第2.2.1–2.2.8节）最多3个月（30代）。
3. 转染培养基的制备。
- 配制100 mM K-Pipes缓冲液（pH 7）和1 mM Ca溶液2+ 乙酸盐和100 mM的Mg溶液2+ 乙酸盐
- 将100 mM的K-Pipes（pH 7）溶液用DMEM培养基稀释至20 mM，加入1 mM的Ca2+ 乙酸盐至终浓度10 μM和100 mM的Mg溶液2+ 乙酸盐至终浓度为 2 mM。
- 称重 谷氨酸钾加入溶液中，使其终浓度为 128 mM，充分混匀，4 °C 保存备用。其余溶液（即，K-管道，Ca2+ 乙酸盐，Mg2+ 乙酸盐在 -20 °C 下保存。
4. RBL 细胞的转染
- 使用连接真空泵的无菌巴斯德吸管从培养板或培养瓶中移除培养基。
- 用预热（37 °C）的胰蛋白酶/EDTA溶液冲洗细胞单层，确保完全覆盖细胞层。将培养板或培养瓶置于37 °C培养箱中孵育（不超过10分钟）。使用光学显微镜检查细胞是否已脱落。
- 向培养板或培养瓶中加入培养基以重悬细胞（培养基体积应至少为胰蛋白酶溶液体积的2倍以上）。
- 使用血细胞计数板对细胞数量进行计数。
- 以200 × g离心3分钟，沉淀1.5 × 107个细胞（温度为25 °C）。弃去上清液，加入280 µl转染培养基。将反应混合物转移至4 mm电穿孔杯中。
- 加入20 μg NPY-mRFP质粒以及30 μg对照空质粒或待测质粒。反应混合物的终体积应为300 μl。
- 立即置于冰上10分钟。用纸巾擦干电穿孔杯外壁残留水分，随后在300 V条件下进行9毫秒的电穿孔。
- 对于胞吐作用的检测，立即将细胞重新接种至含有300 μl培养基的24孔组织培养板中。每孔加入8 μl反应混合物（含4 × 105个细胞）。另设若干孔加入4 × 105个未转染细胞作为对照。为每次转染的每种处理条件准备足够数量的孔，确保至少有双重复孔。
- 对于延时显微成像，立即将细胞重新接种至含80 μl培养基的8孔硼硅酸盐玻璃底共聚焦培养板中。每孔加入1.5 μl反应混合物（含7.5 × 104个细胞）。（尽量避免使用盖玻片边缘的孔，中心区域的孔更易于成像）。
注意：重要的是，并非所有细胞都会对刺激产生反应，且延时显微成像有时会因焦点丢失和8孔硼硅酸盐玻璃底共聚焦培养板的漂移 而中断。因此，为每次转染的每种处理条件至少准备8个孔。 - 为使细胞对FcεRI介导的激活敏感化，向培养基中加入1 µg/ml的小鼠DNP特异性单克隆IgE（将细胞与IgE孵育至少2小时）。
- 转染后18–24小时，使用荧光显微镜确认细胞是否表达质粒。mRFP荧光的激发和发射波长分别为：λEx 584 nm，λEm 607 nm。NPY-mRFP应出现在与分泌颗粒（SGs）相对应的囊泡结构中。 若第二个目的基因融合了荧光标签，则使用荧光显微镜确认两种质粒在同一细胞中的共表达。例如，若待测基因为GFP融合蛋白，GFP荧光的激发和发射波长分别为：λEx 488 nm，λEm 507 nm。GFP标记的蛋白应出现在表达NPY-mRFP的同一细胞中。
- 如需进行胞吐作用检测，请进入步骤5；如需进行延时显微成像，请进入步骤6。
5. 测定 NPY-mRFP 胞吐作用
- 台氏缓冲液的配制：
- 在去离子水中配制含有54 mM KCl、20 mM MgCl2、2.74 M NaCl 和 8 mM NaH2PO4 的溶液。充分混匀后于4 °C保存。此步骤用于配制20倍浓度的台氏缓冲液（20x Tyrode buffer）。
- 在去离子水中配制含有20 mM Hepes（pH 7）、1.8 mM CaCl2、1 mg/ml BSA、5.6 mM 葡萄糖以及1:20稀释的20x台氏缓冲液的溶液，并充分混匀。此步骤用于配制1倍浓度的台氏缓冲液（1x Tyrode buffer）。
- 将1x台氏缓冲液分装后于-20 °C保存。避免反复冻融。
- 从24孔板中移除培养基，用台氏缓冲液洗涤3次。向对照孔中加入200 μl台氏缓冲液，以制备未刺激的细胞。
- 每孔加入10 μl 20倍浓度的激活试剂[（例如 1,000 ng/ml DNP-BSA 或 DNP-HSA（抗原）、200 µM Ca2+离子载体（例如 A23187），或20 µM Ca2+ 离子载体与1,000 nM 12-O- 十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯（TPA）的组合）]。若试剂储存于DMSO中，则将其用含1% DMSO的台氏缓冲液稀释至20倍浓度。 于37 °C孵育30分钟。
- 小心将各孔上清液转移至96孔板中，置于冰上并避光保存。（上清液中含有从细胞释放的嵌合肽NPY-mRFP）。
- 向每孔加入含0.5% Triton X-100的200 μl台氏缓冲液，于37 °C孵育10分钟。（此步骤对制备含有未释放NPY-mRFP的细胞裂解液至关重要）。收集细胞裂解液并转移至96孔板中，置于冰上并避光保存。
- 使用荧光酶标仪检测细胞上清液和细胞裂解液的荧光强度，激发滤光片为590 nm（带宽20 nm），发射滤光片为635 nm（带宽35 nm）。
- 计算NPY-mRFP释放百分比：
注意：荧光检测仪测量的是任意荧光单位（AFU）。AFU数值取决于仪器及其灵敏度，以及转染效率。- 以未转染的RBL细胞的自发荧光作为空白对照。将每个上清液的AFU值除以总荧光值（上清液AFU + 对应裂解液AFU），再乘以100。
6. 胞吐作用的延时显微镜观察
- 在8孔腔室硼硅酸盐盖玻片系统中，每孔接种7.5 × 104个转染细胞。培养18-24小时后，吸除各孔中的培养基，并用Tyrode缓冲液洗涤3次。
- 向每个腔室中加入72 μl Tyrode缓冲液。将激活试剂用Tyrode缓冲液稀释至10倍浓度。
- 使用配备加热腔室（37 °C）、CO2控制器（4.8%）以及40X或63X物镜的共聚焦荧光显微镜。开启显微镜系统：汞灯、计算机和激光器。实验开始前，确保加热腔室已达到设定温度。
- 将腔室放入加热腔室内，确保安装正确且稳固。
- 根据所用荧光染料开启荧光光源，观察转染细胞。一旦目标细胞进入视野，立即关闭荧光以减少光漂白和细胞毒性。该视野应包含约2-3个转染细胞，细胞应充分铺展但彼此不接触。
- 调节激光功率（根据显微镜型号），以最大限度减少噪声、过饱和及细胞毒性；调节增益和偏移以优化信噪比。采用快速扫描以缩短激光照射时间（平均为2）。
- 将针孔尺寸调至最大，有助于降低激光功率并长时间保持图像聚焦。如需进行三维重建，可将针孔尺寸设为1艾里单位（AU），以获得最佳信噪比，并沿z轴连续采集光学切片厚度≤0.7 μm的二维共聚焦光学切片。
- 设置每次图像采集的时间间隔为15-30秒，总采集时长为15 分钟，开始图像采集。采集5 分钟后暂停时间序列，立即加入8 μl 10倍浓度的刺激剂，随后继续采集。
- 保存图像，使用去卷积软件进行去卷积处理，并利用Imaris软件将图像堆栈重建为三维图像及动态视频。
7. 图像分析
- 将共聚焦荧光显微镜获得的去卷积时间序列图像数据导入 Imaris 软件。该软件可读取超过 40 种显微镜文件格式。如果软件无法读取文件，请先将文件转换为 tif 格式后再导入。
- 若要在已打开的数据集末尾添加时间点，请点击编辑 -> 添加时间点，并导入新的数据集。
- 使用表面向导选项创建 mRFP 通道的表面。选择默认算法，指定 NPY-mRFP 通道。勾选平滑选项以降低噪声。为避免丢失微小细节，将区域细节级别调至 0.05 μm。
- 设置强度阈值，系统将显示新的灰色表面。进入“设置”界面，将显示样式从“中心点”切换为“表面”。
- 在所选对象的属性中，进入统计标签页，选择详细标签页，并选取特定数值，如荧光强度、体积等。
- 检查数据，确认其与图像内容一致。例如，两个或多个相邻颗粒可能被测量为一个较大的颗粒。在量化平均颗粒大小时，应将合并颗粒的大小除以实际颗粒数量。
- 将所需数据集导出为 Excel 文件并进行数据分析。
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结果
由于肥大细胞（MCs）的转染效率较低，基因操作不太可能对通过内源性分泌颗粒介质测量的平均分泌读数产生影响。然而，通过在相同细胞中建立报告基因NPY-mRFP与共转染质粒的完全共表达，监测NPY-mRFP即可特异性地监测表达目标基因的细胞群体。因此，与传统方法相比，该检测方法的优势在于能够选择性地监测经过基因操作的细胞（图1）。
事实上，利用该检测方法，我们筛选了调控囊泡运输的基因，包括可溶性 NSF（N-乙基马来酰亚胺敏感融合蛋白）附着蛋白受体（SNARE）蛋白以及44个Rab GTP酶家族成员。我们鉴定出调控应激颗粒（SG）大小、数量、货物组成及胞吐作用的基因23。
我们鉴定了30种Rab蛋白，这些蛋白在抗原（Ag）刺激或Ca2+离子载体与佛波酯TPA联合作用（Ion/TPA）下，能够改变RBL细胞的胞吐作用（即，抑制或促进）23。共聚焦成像揭示了可导致细胞形态或分泌颗粒（SG）发生显著表型变化的SNARE蛋...
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讨论
我们介绍了一种创新策略，该策略通过使用报告基因对活细胞中分泌颗粒（SGs）进行时间延迟的三维成像，结合对肥大细胞（MCs）胞吐作用的定量分析以及四维（x, y, z, t）定量分析。该技术可用于筛选蛋白家族对MC功能的影响，例如监测SGs从高尔基体出芽开始，直至其成熟、获得胞吐能力并发生脱颗粒的全过程。将胞吐作用的定量测量与SGs的形态计量学和动力学特征分析相结合，可深入揭示被测蛋白调控MC功能的作用机制 。因此，利用该方法对靶基因进行遗传操作，可揭示MC的分泌颗粒储存和释放其内容物的新分子机制。值得注意的是，NPY也可作为其他分泌细胞中胞吐作用的报告分子，例如来源于人乳腺腺癌的MCF-7细胞系31、嗜铬细胞34以及胰岛β细胞35。
基因操作是目前研究功能网络最强大的工具。通过基因操作可以鉴定出网络中发挥关键作用的蛋白质，这些蛋白质的缺失会导致系统崩溃；而其他蛋白质的缺失则可能引起平行网络之间的串扰，或因存在冗余而无明显表型变化。然而，由于肥大细胞（MCs）的转染效率较低，在检测内源...
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披露
作者无经济利益冲突。
致谢
我们感谢 U. Ashery 博士惠赠 NPY-mRFP cDNA。感谢 M. J. Kofron、L. Mittleman、M. Shaharbani 和 Y. Zilberstein 博士在显微成像和图像分析方面提供的宝贵帮助。我们还感谢 Joseph Orly 博士对本文手稿的审阅。 本研究由以色列科学基金会（以色列科学与人文学院）资助 （项目编号 1139/12，授予 R.S-E.）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6046-500ML | 37℃预热 °使用前将水浴锅预热至 C |
| 胎牛血清 | GE医疗生命科学 | SH30071.01 | |
| 青霉素-链霉素 | Life technologies | ||
| 醋酸纤维素膜，孔径 0.22 μm | Sigma-Aldrich | CLS430769-1EA | |
| Corning 细胞培养处理培养皿 | Sigma-Aldrich | CLS430167 | |
| 胰蛋白酶/EDTA 溶液（TE） | 生命技术公司 | R001100 | 37℃预热 °使用前将水浴锅预热至 C |
| PIPES 二钾盐 | Sigma-Aldrich | 108321-27-3 | |
| 乙酸钙水合物 | Sigma-Aldrich | 114460-21-8 | |
| 四水合乙酸镁 | Sigma-Aldrich | M5661 | |
| L-谷氨酸钾盐一水合物（谷氨酸钾） | Sigma-Aldrich | G1501 | |
| 4 mm 电穿孔比色皿 | 细胞投影 | EP-104 | |
| 基因脉冲仪配脉冲控制器 &与电容 | Bio rad | ||
| 带孔盖玻片 | 赛默飞世尔科技 | 155411 | |
| 24孔，平底 | Sigma-Aldrich | CLS3524 | |
| 康宁96孔板 | Sigma-Aldrich | CLS3367 或 CLS390 | |
| 96孔板荧光读板仪 - Infinite 200 | Tecan | ||
| 钙离子载体 A23187 | Sigma-Aldrich | C7522 | 避免直接暴露于光线下 |
| 12-O-十四烷酰基-13-乙酸酯（TPA） | Calbiochem | P3766 | |
| 抗DNP单克隆IgE | Sigma-Aldrich | D8406 | |
| DNP-BSA / DNP-HAS | Sigma-Aldrich | A6661 | 避免直接暴露于光线下 |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| 共聚焦荧光显微镜 | |||
| Zeiss LSM 510 | |||
| Leica | SP5 | ||
| 尼康A1倒置显微镜 | |||
| Imaris 软件 | BITLANE | ||
| Microsoft Excel 或 Prism 或其他分析软件 | |||
| 其他试剂： | |||
| 氯化镁 | MERK | 5833 | |
| 氯化钠 | MERK | 6404 | |
| 氯化钙 | MERK | 2382 | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| 葡萄糖 | BDH Laboratories | 284515V | |
| 磷酸二氢钠 | MERK | 5345 | |
| 无菌水 |
参考文献
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