探究肥大细胞分泌颗粒：从生物合成到胞吐作用

摘要

本研究的目的是 该方案旨在建立一种可用于肥大细胞分泌功能基因组学分析的方法。该方法基于对与目的基因共转染的荧光报告基因释放量的定量评估，并结合实时检测 分泌颗粒形态的分析。

摘要

肥大细胞（Mast Cells, MC）是免疫系统的分泌性细胞，通过释放预先形成和新合成的过敏性、炎症性及免疫调节性介质来执行其生理与病理功能。MC 的介质作用于多种组织和器官，最终引发过敏反应和免疫应答。MC 介质的合成、储存和释放受到高度调控。预先形成的介质被包裹在胞质分泌颗粒 (SG) 中，这些颗粒与质膜融合，并通过调控性胞吐作用释放其内容物。本文介绍了一种实验方案，该方案基于目的基因与一种靶向 SG 并随内源性 SG 介质以调控方式共同释放的报告基因共表达。该方案可实现对 MC SG 的高分辨率四维共聚焦分析，实时监测其从生物合成到触发胞吐的全过程。因此，利用该方案筛选目的基因对其表型和功能的影响，有助于解析调控 MC SG 生物合成与胞吐的分子机制，并鉴定其中涉及的调控因子。从而为进一步理解肥大细胞在生理与疾病状态下的细胞机制提供新的见解。

引言

肥大细胞（MC）是一类免疫细胞，最广为人知的是其在过敏和炎症反应中的作用，例如关节炎、哮喘、嗜酸性食管炎、慢性皮炎以及过敏性休克^1,2，也参与包括冠状动脉疾病^3,5和癌症^3,4在内的其他多种病理过程。此外，肥大细胞在先天性和适应性免疫中均发挥重要作用，既可在宿主防御细菌和寄生虫感染中发挥作用，也可通过抑制免疫反应来调节免疫应答，例如诱导同种异体移植物耐受^5,6。

肥大细胞（MCs）起源于骨髓，由CD34+/CD117+多能祖细胞发育而来⁷。已定向分化的骨髓肥大细胞 祖细胞被释放入血流，并迁移至外周组织，主要定位于结缔组织和上皮表面⁸。在周围微环境中细胞因子的影响下，最终完成成熟和终末分化^8,9。

肥大细胞（MC）可被变应原（抗原，Ag）激活，该变应原的初次接触可诱导机体产生免疫球蛋白E（IgE）类抗体。当此类IgE与肥大细胞表面的FcεRI受体结合后，若再次接触相同抗原，则可导致细胞表面结合的IgE发生交联，从而引起FcεRI受体聚集，启动信号转导级联反应，最终导致细胞脱颗粒[综述见^10,11]。肥大细胞亦可通过非IgE依赖途径被激活，例如由神经肽^5,12、毒素¹³、细菌和病毒抗原^14....

方案

1. RBL 细胞培养基的制备

1. 将500 ml低糖Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）与56 ml胎牛血清（终浓度为10% FBS）混合，然后加入5.5 ml青霉素-链霉素溶液（终浓度约为1% PEST）。
2. 使用孔径为0.22 μm的500–1,000 ml瓶顶式真空滤器过滤培养基，并于4 °C保存。

2. RBL 细胞的培养

1. 在37 °C、5% CO₂的湿化环境中，于培养板或培养瓶中培养RBL细胞。在10 cm培养板中生长的RBL细胞应添加10 ml培养基，形成约10⁷个细胞/板的融合单层。
2. 当细胞层接近融合时，以较低密度重新接种 细胞。
   1. 使用连接真空泵的无菌巴斯德吸管从培养板/瓶中移除培养基。
   2. 用预热（37 °C）的0.25%胰蛋白酶/EDTA溶液冲洗细胞单层，使其完全覆盖单层（体积取决于培养板/瓶的大小；10 cm板使用2 ml）。此步骤将使细胞脱离。
   3. 或者，先用磷酸盐缓冲盐水（PBS）冲洗细胞单层，移除PBS后加入预热（37 °C）的胰蛋白酶/EDTA溶液。此方法可更快地使细胞脱离。
   4. 将培养板/瓶置于37 °C培养箱中（不超过10分钟）。
   5. 在光学显微镜下观察细胞，检查其是否已脱离。若....

结果

由于肥大细胞（MCs）的转染效率较低，基因操作不太可能对通过内源性分泌颗粒介质测量的平均分泌读数产生影响。然而，通过在相同细胞中建立报告基因NPY-mRFP与共转染质粒的完全共表达，监测NPY-mRFP即可特异性地监测表达目标基因的细胞群体。因此，与传统方法相比，该检测方法的优势在于能够选择性地监测经过基因操作的细胞（图1）。

事实上，利用该检测方法，我们筛选了调控囊泡运输的基因，包括可溶性 NSF（N-乙基马来酰亚胺敏感融合蛋白）附着蛋白受体（SNARE）蛋白以及44个Rab GTP酶家族成员。我们鉴定出调控应激颗粒（SG）大小、数量、货物组成及胞吐作用的基因²³。

我们鉴定了30种Rab蛋白，这些蛋白在抗原（Ag）刺激或Ca²⁺离子载体与佛波酯TPA联合作用（Ion/TPA）下，能够改变RBL细胞的胞吐作用（即，抑制或促进）²³。共聚焦成像揭示了可导致细胞形态或分泌颗粒（SG）发生显著表型变化的SNARE蛋.......

讨论

我们介绍了一种创新策略，该策略通过使用报告基因对活细胞中分泌颗粒（SGs）进行时间延迟的三维成像，结合对肥大细胞（MCs）胞吐作用的定量分析以及四维（x, y, z, t）定量分析。该技术可用于筛选蛋白家族对MC功能的影响，例如监测SGs从高尔基体出芽开始，直至其成熟、获得胞吐能力并发生脱颗粒的全过程。将胞吐作用的定量测量与SGs的形态计量学和动力学特征分析相结合，可深入揭示被测蛋白调控MC功能的作用机制   。因此，利用该方法对靶基因进行遗传操作，可揭示MC的分泌颗粒储存和释放其内容物的新分子机制。值得注意的是，NPY也可作为其他分泌细胞中胞吐作用的报告分子，例如来源于人乳腺腺癌的MCF-7细胞系³¹、嗜铬细胞³⁴以及胰岛β细胞³⁵。

基因操作是目前研究功能网络最强大的工具。通过基因操作可以鉴定出网络中发挥关键作用的蛋白质，这些蛋白质的缺失会导致系统崩溃；而其他蛋白质的缺失则可能引起平行网络之间的串扰，或因存在冗余而无明显表型变化。然而，由于肥大细胞（MCs）的转染效率较低，在检测内源.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM	Sigma-Aldrich	D6046-500ML	37℃预热 °使用前将水浴锅预热至 C
胎牛血清	GE医疗生命科学	SH30071.01
青霉素-链霉素	Life technologies
醋酸纤维素膜，孔径 0.22 μm	Sigma-Aldrich	CLS430769-1EA
Corning 细胞培养处理培养皿	Sigma-Aldrich	CLS430167
胰蛋白酶/EDTA 溶液（TE）	生命技术公司	R001100	37℃预热 °使用前将水浴锅预热至 C
PIPES 二钾盐	Sigma-Aldrich	108321-27-3
乙酸钙水合物	Sigma-Aldrich	114460-21-8
四水合乙酸镁	Sigma-Aldrich	M5661
L-谷氨酸钾盐一水合物（谷氨酸钾）	Sigma-Aldrich	G1501
4 mm 电穿孔比色皿	细胞投影	EP-104
基因脉冲仪配脉冲控制器 &与电容	Bio rad
带孔盖玻片	赛默飞世尔科技	155411
24孔，平底	Sigma-Aldrich	CLS3524
康宁96孔板	Sigma-Aldrich	CLS3367 或 CLS390
96孔板荧光读板仪 - Infinite 200	Tecan
钙离子载体 A23187	Sigma-Aldrich	C7522	避免直接暴露于光线下
12-O-十四烷酰基-13-乙酸酯（TPA）	Calbiochem	P3766
抗DNP单克隆IgE	Sigma-Aldrich	D8406
DNP-BSA / DNP-HAS	Sigma-Aldrich	A6661	避免直接暴露于光线下
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
共聚焦荧光显微镜
Zeiss LSM 510
Leica	SP5
尼康A1倒置显微镜
Imaris 软件	BITLANE
Microsoft Excel 或 Prism 或其他分析软件
其他试剂：
氯化镁	MERK	5833
氯化钠	MERK	6404
氯化钙	MERK	2382
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A4503
葡萄糖	BDH Laboratories	284515V
磷酸二氢钠	MERK	5345
无菌水