培养的哺乳动物细胞中局部 Ca2+ 信号的成像

摘要

本文介绍了利用荧光显微镜对加载了Ca²⁺指示剂的完整哺乳动物细胞中由IP₃介导的局部Ca²⁺事件进行成像的技术，并提供了一种可自动识别和分析这些事件的算法。

摘要

细胞质 Ca²⁺ 离子几乎在所有细胞类型中调节着细胞活动的诸多方面，控制着从基因转录、电兴奋性到细胞增殖等广泛的生命过程。Ca²⁺的多样性和特异性²⁺ 信号源自Ca介导的机制²⁺ 信号在不同的时间和空间尺度上发挥作用，其范围从持续数分钟的全细胞振荡和波动，到局部瞬时的Ca²⁺ 微区（Ca²⁺ 持续数毫秒的钙火花）。电子倍增CCD（EMCCD）相机的最新进展现在使得局部钙信号的成像成为可能²⁺ 以128 × 128像素空间分辨率、在以下速率下采集信号 >500 帧/秒^-1 （帧/秒）。该方法具有高度并行性，可在单次实验中同时监测数百个通道或胞吐位点。然而，所产生的数据量巨大（约 每分钟1 Gb）使得局部Ca²⁺的视觉识别与分析²⁺ 事件变得不切实际。本文中，我们描述并演示了局部免疫沉淀（local IP）的获取、检测与分析步骤₃介导的 Ca²⁺ 完整哺乳动物细胞中加载Ca后的信号²⁺ 使用宽场落射荧光（WF）和全内反射荧光（TIRF）显微镜检测指标。此外，我们介绍了一种在开源软件环境 Python 中开发的算法，该算法可自动识别和分析这些局部 Ca²⁺ 信号。该算法可定位 Ca²⁺ 以亚像素分辨率进行释放；允许用户查看数据；并以兼容 Excel 的表格形式输出荧光比率信号的时间序列，以及相应的幅度和动力学数据。

引言

钙离子（Ca²⁺）广泛调控多种生物过程，包括基因表达、分泌以及突触可塑性的持久性变化¹。Ca²⁺ 能够以如此多样化的方式发挥作用，其机制之一在于细胞可产生不同空间和时间模式的 Ca²⁺ 信号。例如，细胞质中 [Ca²⁺] 的全局性升高可触发平滑肌组织的收缩²，而较小且局限性的瞬时升高（局部 Ca²⁺ 微区）则可促进对学习和记忆至关重要的基因表达³。

游离胞质[Ca²⁺] 在静息状态下维持在约 100 nM，但在 Ca²⁺ 内流后可迅速上升至数微摩尔²⁺ 进入细胞质中的 Ca²⁺-位于质膜上的可通透离子通道以及Ca²⁺的释放²⁺ 来自细胞内储存库。我们的实验室专注于研究肌醇1,4,5-三磷酸受体（IP₃R），可形成 Ca²⁺ 位于内质网（ER）膜上的释放通道。当IP结合后₃ 和 Ca²⁺ 到受体的胞质激活位点，IP₃R通道开放以释放Ca²⁺ 滞留于内质网腔内。Ca²⁺的释放²⁺ 可能仍空间性地局限于一小簇 IP₃Rs 以生成细胞质局部的 Ca 微区²⁺ (Ca²⁺ 喷雾⁴）或根据邻近的免疫沉淀（IP）簇的接近程度₃Rs 可能通过募集多个钙火花位点，以钙信号传导的方式在细胞内传播²⁺诱导的 Ca²⁺-释放（CICR）^5,6.

荧光小分子Ca指示剂的引入²⁺ 罗杰·蔡斯开发的指示剂染料⁷，结合先进的显微成像技术，极大地促进了我们对Ca²⁺ 信号传导。显微镜所用相机的最新进展如今已能够对瞬时局部Ca²⁺ 事件（如钙火花）的成像达到前所未有的空间和时间分辨率。目前可用的EMCCD相机能够以128 × 128像素进行成像 >500 帧/秒^-1 （fps），新一代互补金属氧化物半导体（CMOS）相机提供了更高的像素分辨率，以及更快的成像速度，但代价是噪声水平略有升高。结合全内反射（TIRF）显微镜技术，现在已能够对单个Ca²⁺ 通道事件^8,9。该方法可同时对数百个通道/事件进行成像，同时生成大规模数据集（约 每分钟1Gb的数据量使得手动处理、视觉识别和分析变得不切实际，因而对自动化算法的开发提出了迫切需求。

此处，我们介绍用于成像局部 Ca²⁺ 使用荧光 Ca 指示剂在完整哺乳动物细胞中检测信号²⁺ 指示剂。我们进一步展示了一种在开源环境 Python 中开发的算法，该算法可自动识别和分析局部 Ca²⁺ 通过全内反射荧光显微镜（TIRF）和传统的宽场落射荧光显微镜（WF）成像的事件。尽管我们在IP的背景下描述这些方法₃生成的 Ca²⁺ 信号，它们易于用于研究胞质中[Ca²⁺] 来源于多种Ca²⁺位于细胞表面膜或细胞内细胞器中的可通透离子通道^8-10.

方案

我们介绍了在人神经母细胞瘤 SH-SY5Y 细胞中成像局部 Ca²⁺ 事件的详细步骤。这些步骤可经调整后用于多种细胞类型的细胞内 Ca²⁺ 信号成像^8-10。

1. 细胞准备

1. 根据细胞供应商网站上列出的说明培养待成像的细胞。
2. 成像前数天，使用 1 ml 0.25% 胰蛋白酶/EDTA（2–3 分钟）收获在组织培养瓶中生长的细胞。细胞脱落后，加入等体积的培养基以中和胰蛋白酶活性。
3. 使用血细胞计数板进行细胞计数，并将细胞以每皿 3–7 × 10⁴ 个细胞的密度接种至玻璃底成像培养皿中。当细胞达到 60% 汇合度时（2–3 天），选择用于成像实验。

2. 溶液与试剂的配制

1. 配制含 Ca²⁺ 的 HEPES 缓冲盐溶液（Ca²⁺-HBSS），成分为（mM）：135 NaCl、5.4 KCl、2 CaCl₂、1 MgCl₂、10 HEPES 和 10 葡萄糖；用 NaOH 调节至室温（RT）下 pH = 7.4。配制不含葡萄糖的 Ca²⁺-HBSS 并于 4 °C 保存；使用前立即向溶液中加入葡萄糖。
2. 将荧光 Ca²⁺ 指示剂 Cal-520（1 mM）、ci-IP₃（200 µM）和 EGTA（100 mM）的膜通透性形式溶于含 20% 普流罗尼克 F-127 的二甲基亚砜（DMSO）中。将这些试剂分装至微量离心管中，避光避湿，于 -20 °C 保存。

3. 使用膜通透性Cal-520、ci-IP₃和EGTA负载细胞

1. 通过将膜通透性 Cal-520 和 ci-IP₃ 的储备液稀释至 Ca²⁺-HBSS 中，分别配制终浓度为 5 µM 和 1 µM 的“上样缓冲液”。
2. 吸除培养基，并用 Ca²⁺-HBSS 替换培养基，重复冲洗细胞三次。
3. 移除 Ca²⁺-HBSS，将细胞置于上样缓冲液中，在室温避光条件下孵育 60 分钟。
4. 移除上样缓冲液，并用 Ca²⁺-HBSS 替换培养基，重复冲洗细胞三次。
   1. 如需要，可在本步骤中通过将 EGTA/AM 储备液稀释至 Ca²⁺-HBSS 中终浓度为 5 µM，对细胞进行染色，随后在室温避光条件下孵育 30–60 分钟。完成此孵育后，在进入步骤 3.5 前，用 Ca²⁺-HBSS 冲洗细胞三次。
5. 将细胞在 Ca²⁺-HBSS 中孵育 30 分钟，以使已加载的试剂完成去酯化。
6. 成像前立即用“新鲜”的 Ca²⁺-HBSS 替换原有 Ca²⁺-HBSS，以去除在最终孵育期间可能泄漏到浴液中的染料。

4. Ca²⁺ 成像采集

1. 在100X APO TIRF物镜（NA 1.49）上滴加一小滴浸油。
2. 将成像培养皿安装在倒置显微镜的载物台上，使用透射光将细胞调至焦点。务必固定好成像培养皿，以防止记录过程中发生移动。
3. 使用488 nm激光照射细胞，以激发Cal-520，并利用高速EMCCD相机收集发射荧光（λ >510 nm）。
   注意：显微镜操作软件允许用户移动聚焦透镜，从而将激光束导入物镜后孔径的边缘（用于TIRF激发）或更中心的位置（用于“宽场（WF）”激发）。
4. 通过EMCCD软件，将成像区域从完整的512 × 512像素缩小，以达到捕获局部Ca²⁺事件所需的时间分辨率。
   注意：例如，中心四象限采集256 × 256像素可将采集速率提高至66帧/秒。还可使用EMCCD相机的“隔离裁剪模式（Isolated Crop Mode）”功能进一步将帧率提升至500帧/秒。
5. 设置软件自动记录数秒的基础活动，随后向细胞施加一次紫外闪光，并继续记录10–30秒。
   注意：紫外闪光通过显微镜后端口的紫外反射二向色镜引入，光源为氙弧灯。紫外闪光的持续时间和强度需根据经验调整，以诱发理想频率的局部Ca²⁺事件。
6. 将文件保存为图像序列，用于离线分析。

5. 自动化 Ca²⁺ 图像分析

注意：可以使用多种商业软件包来查看、处理和分析所采集的数据。然而，我们开发了一种算法，可快速自动识别和分析局部 Ca²⁺ 信号。该算法中所用空间和时间滤波器的详细描述、ΔF/F₀ 的生成以及信号识别与分析程序，参见文献¹¹。该算法基于开源软件平台 Python 开发，可通过电子邮件联系通讯作者（ismith@uci.edu）获取该算法程序、示例实验数据及详细的用户操作说明。

1. 将待导入自定义算法的文件转换为多平面 .tiff 文件格式。
2. 找到包含分析算法的文件夹，双击运行 run.exe。
3. 选择要分析的 .tiff 文件。
4. 在弹出的对话框中选择分析参数。样本数据的默认参数参见图2A。
5. 通过将光标移动到视野中不含细胞的区域（参见图2B），或通过“设置黑电平”提示手动输入黑电平值，确定需从图像堆栈中偏移的黑电平。
6. 软件分析完成后，观察屏幕上显示的四个窗口（图2C-F）。C 为正在分析细胞的静息荧光单色图像。叠加在该图像上的白色方块为事件位置，由拟合事件的二维高斯函数的质心位置确定。
7. 单击每个事件位置，或按光标键在事件间切换。此时，窗口 D 将更新显示各位置经背景扣除、高斯平滑处理后的荧光比值变化（ΔF/F₀）。
   注：红色高亮的事件被判定为源自该特定位点，而非来自邻近位点活动的“串扰”信号。下方蓝色轨迹表示所选位点的荧光信号超过检测阈值的位置，而黑色线条标识源自该特定位点的事件（对应于红色高亮事件）。
8. 单击红色高亮事件，以更新窗口 E 和窗口 F。窗口 E 显示该事件的时间演化过程，窗口 F 显示该事件在其持续时间内的平均空间分布，以及拟合的高斯函数的空间分布。
9. 手动审查已识别的事件，以排除伪影干扰。通过右键单击红色高亮事件删除此类伪影事件。
   注：据我们经验，单个 IP₃R 通道介导的 Ca²⁺ 流产生的信号 ΔF/F₀ 约为 0.11，因此任何明显小于此值的“事件”很可能是假阳性。
10. 通过选择“保存至 Excel”导出数据，或通过围绕感兴趣细胞绘制区域并选择“保存细胞”以单个细胞为单位导出数据。
    注：数据将保存至与原始图像堆栈相同的文件夹中。

结果

图1A 显示了负载 ci-IP₃ 的人源神经母细胞瘤 SH-SY5Y 细胞中静息状态下 Cal-520 荧光的明场（WF）图像。对这些细胞施加持续 100 毫秒的紫外光脉冲以光释放 i-IP₃，可在特定位置诱导瞬时的 Ca²⁺ 释放“蓬松信号”（puffs）（如 图1A 中白色圆圈所示）。在这些位点测得的荧光轨迹显示，由于 IP₃R 的瞬时开放，信号迅速上升，随后因 Ca²⁺ 从释放位点缓慢扩散而呈现显著更慢的下降相（图1B 和 图1C）。图1B 中以红色高亮的事件是算法判定为起源于所选位点的 Ca²⁺ 信号；未高亮的事件则代表从邻近位点扩散而来的污染性 Ca²⁺ 信号。

为了实现对局部 Ca²⁺ 信号更高分辨率的成像，可进一步用慢速 Ca<...

讨论

本文介绍了利用荧光 Ca²⁺ 探针在培养的哺乳动物细胞中成像局部 Ca²⁺ 事件的实验方案。此外，还介绍了一种具有直观用户界面的算法，可自动识别和分析所获取的数据。此处描述的实验流程使用荧光 Ca²⁺ 探针 Cal-520，但其他多种 Ca²⁺ 敏感染料（如 Fluo-3、Fluo-4、Fluo-8 和 Oregon Green BAPTA-1）也能有效用于 Ca²⁺ 微区的成像。需要注意的是，应选用这些探针的高亲和力版本（K_d 约为 200–400 nM）来成像局部 Ca²⁺ 微区，且这些探针的最佳负载条件需针对每种待研究的细胞类型通过实验经验确定。由于 Ca²⁺ 探针本身会结合 Ca²⁺，因而具有 Ca²⁺ 缓冲作用；探针浓度过高可能干扰所记录的 Ca²⁺ 信号，或导致探针被隔离至细胞内细胞器中，尽管本文所述的负载条件是一个良好的起始点。总体而言，对局部 Ca²⁺ 事件进行...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
人神经母细胞瘤 SH-SY5Y 细胞	ATCC	CRL-2266
Cal-520/AM	AAT Bioquest 公司	21130
ci-IP3 (D-23-O-异丙叉基-6-O-(2-硝基-4,5-二甲氧基)苄基-myo-肌醇 1,4,5-三磷酸六(丙氧基甲基)酯	SiChem	cag-iso-2-145-10
DMSO/20% 普流罗尼克 F127	Invitrogen	P-3000MP
EGTA/AM	Invitrogen	E-1219
35 mm 玻底成像培养皿	MatTek	P35G-1.5-14-C