培养的哺乳动物细胞中局部 Ca2+ 信号的成像

摘要

本文介绍了利用荧光显微镜对加载了Ca²⁺指示剂的完整哺乳动物细胞中由IP₃介导的局部Ca²⁺事件进行成像的技术，并提供了一种可自动识别和分析这些事件的算法。

摘要

细胞质 Ca²⁺ 离子几乎在所有细胞类型中调节着细胞活动的诸多方面，控制着从基因转录、电兴奋性到细胞增殖等广泛的生命过程。Ca²⁺的多样性和特异性²⁺ 信号源自Ca介导的机制²⁺ 信号在不同的时间和空间尺度上发挥作用，其范围从持续数分钟的全细胞振荡和波动，到局部瞬时的Ca²⁺ 微区（Ca²⁺ 持续数毫秒的钙火花）。电子倍增CCD（EMCCD）相机的最新进展现在使得局部钙信号的成像成为可能²⁺ 以128 × 128像素空间分辨率、在以下速率下采集信号 >500 帧/秒^-1 （帧/秒）。该方法具有高度并行性，可在单次实验中同时监测数百个通道或胞吐位点。然而，所产生的数据量巨大（约 每分钟1 Gb）使得局部Ca²⁺的视觉识别与分析²⁺ 事件变得不切实际。本文中，我们描述并演示了局部免疫沉淀（local IP）的获取、检测与分析步骤₃介导的 Ca²⁺ 完整哺乳动物细胞中加载Ca后的信号²⁺ 使用宽场落射荧光（WF）和全内反射荧光（TIRF）显微镜检测指标。此外，我们介绍了一种在开源软件环境 Python 中开发的算法，该算法可自动识别和分析这些局部 Ca²⁺ 信号。该算法可定位 Ca²⁺ 以亚像素分辨率进行释放；允许用户查看数据；并以兼容 Excel 的表格形式输出荧光比率信号的时间序列，以及相应的幅度和动力学数据。

引言

钙离子（Ca²⁺）广泛调控多种生物过程，包括基因表达、分泌以及突触可塑性的持久性变化¹。Ca²⁺ 能够以如此多样化的方式发挥作用，其机制之一在于细胞可产生不同空间和时间模式的 Ca²⁺ 信号。例如，细胞质中 [Ca²⁺] 的全局性升高可触发平滑肌组织的收缩²，而较小且局限性的瞬时升高（局部 Ca²⁺ 微区）则可促进对学习和记忆至关重要的基因表达³。

游离胞质[Ca²⁺] 在静息状态下维持在约 100 nM，但在 Ca²⁺ 内流后可迅速上升至数微摩尔²⁺ 进入细胞质中的 Ca²⁺-位于质膜上的可通透离子通道以及Ca²⁺的释放²⁺ 来自细胞内储存库。我们的实验室专注于研究肌醇1,4,5-三磷酸受体（IP₃R），可形成 Ca²⁺ 位于内质网（ER）膜上的释放通道。当IP结合后₃ 和 Ca²⁺ 到受体的胞质激活位点，IP₃R通道开放以释放Ca²⁺ 滞留于内质网腔内。Ca²⁺的释放²⁺ 可能仍空间性地局限于一小簇 IP₃Rs 以生成细胞质局部的 Ca 微....

方案

我们介绍了在人神经母细胞瘤 SH-SY5Y 细胞中成像局部 Ca²⁺ 事件的详细步骤。这些步骤可经调整后用于多种细胞类型的细胞内 Ca²⁺ 信号成像^8-10。

1. 细胞准备

1. 根据细胞供应商网站上列出的说明培养待成像的细胞。
2. 成像前数天，使用 1 ml 0.25% 胰蛋白酶/EDTA（2–3 分钟）收获在组织培养瓶中生长的细胞。细胞脱落后，加入等体积的培养基以中和胰蛋白酶活性。
3. 使用血细胞计数板进行细胞计数，并将细胞以每皿 3–7 × 10⁴ 个细胞的密度接种至玻璃底成像培养皿中。当细胞达到 60% 汇合度时（2–3 天），选择用于成像实验。

2. 溶液与试剂的配制

1. 配制含 Ca²⁺ 的 HEPES 缓冲盐溶液（Ca²⁺-HBSS），成分为（mM）：135 NaCl、5.4 KCl、2 CaCl₂、1 MgCl₂、10 HEPES 和 10 葡萄糖；用 NaOH 调节至室温（RT）下 pH = 7.4。配制不含葡萄糖的 Ca²⁺-HBSS 并于 4 °C 保存；使用前立即向溶液中加入葡萄糖。
2. 将荧光 Ca<....

结果

图1A 显示了负载 ci-IP₃ 的人源神经母细胞瘤 SH-SY5Y 细胞中静息状态下 Cal-520 荧光的明场（WF）图像。对这些细胞施加持续 100 毫秒的紫外光脉冲以光释放 i-IP₃，可在特定位置诱导瞬时的 Ca²⁺ 释放“蓬松信号”（puffs）（如 图1A 中白色圆圈所示）。在这些位点测得的荧光轨迹显示，由于 IP₃R 的瞬时开放，信号迅速上升，随后因 Ca²⁺ 从释放位点缓慢扩散而呈现显著更慢的下降相（图1B 和 图1C）。图1B 中以红色高亮的事件是算法判定为起源于所选位点的 Ca²⁺ 信号；未高亮的事件则代表从邻近位点扩散而来的污染性 Ca²⁺ 信号。

为了实现对局部 Ca²⁺ 信号更高分辨率的成像，可进一步用慢速 Ca<.......

讨论

本文介绍了利用荧光 Ca²⁺ 探针在培养的哺乳动物细胞中成像局部 Ca²⁺ 事件的实验方案。此外，还介绍了一种具有直观用户界面的算法，可自动识别和分析所获取的数据。此处描述的实验流程使用荧光 Ca²⁺ 探针 Cal-520，但其他多种 Ca²⁺ 敏感染料（如 Fluo-3、Fluo-4、Fluo-8 和 Oregon Green BAPTA-1）也能有效用于 Ca²⁺ 微区的成像。需要注意的是，应选用这些探针的高亲和力版本（K_d 约为 200–400 nM）来成像局部 Ca²⁺ 微区，且这些探针的最佳负载条件需针对每种待研究的细胞类型通过实验经验确定。由于 Ca²⁺ 探针本身会结合 Ca²⁺，因而具有 Ca²⁺ 缓冲作用；探针浓度过高可能干扰所记录的 Ca²⁺ 信号，或导致探针被隔离至细胞内细胞器中，尽管本文所述的负载条件是一个良好的起始点。总体而言，对局部 Ca²⁺ 事件进行.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
人神经母细胞瘤 SH-SY5Y 细胞	ATCC	CRL-2266
Cal-520/AM	AAT Bioquest 公司	21130
ci-IP3 (D-23-O-异丙叉基-6-O-(2-硝基-4,5-二甲氧基)苄基-myo-肌醇 1,4,5-三磷酸六(丙氧基甲基)酯	SiChem	cag-iso-2-145-10
DMSO/20% 普流罗尼克 F127	Invitrogen	P-3000MP
EGTA/AM	Invitrogen	E-1219
35 mm 玻底成像培养皿	MatTek	P35G-1.5-14-C