评估可传播性海绵状脑病的物种屏障 体外 朊蛋白转化检测

摘要

测量朊病毒疾病跨物种传播屏障具有挑战性，通常需要通过动物攻毒实验或生化检测来完成。本文介绍了一种 体外 可预测物种屏障的朊病毒蛋白转化实验

摘要

研究可传播性海绵状脑病（TSEs，即朊病毒病）的跨物种传播具有挑战性，因为这类研究通常依赖于耗时且昂贵的体内动物攻毒实验。目前已开发出多种体外检测方法，用于测量朊病毒的物种屏障，从而减少动物使用，并比动物生物测定法更快地获得结果。本文介绍了快速体外朊病毒转化检测方法——转化效率比（CER）检测的实验方案。在该检测中，从未感染宿主脑组织中提取的细胞型朊蛋白（PrP^C）分别在pH 7.4和pH 3.5条件下变性，以制备两种底物。当pH 7.4的底物与TSE病原体共同孵育时，PrP^C转化为蛋白酶K（PK）抗性状态的量受到原始宿主对TSE病原体物种屏障的影响。相比之下，在pH 3.5的底物中，任何TSE病原体均可诱导PrP^C发生错误折叠。通过比较两种底物中PK抗性朊病毒蛋白的含量，可评估宿主的物种屏障。我们证明，CER检测能够准确预测实验小鼠已知的朊病毒物种屏障；并举例展示了一些初步结果，提示美洲山猫（Lynx rufus）可能对白尾鹿（Odocoileus virginianus）的慢性消耗性疾病病原体具有易感性。

引言

可传播性海绵状脑病（TSEs，即朊病毒病）是一组具有较长潜伏期的致命性神经退行性疾病，可影响多种动物和人类。TSEs 的假定致病因子是一种宿主朊病毒蛋白（PrP）的错误折叠异构体，它能够通过模板导向的方式将正常的细胞型 PrP（PrP^C）转化为具有感染性、与疾病相关的构象（PrP^TSE），并在感染宿主的中枢神经系统组织中积累¹。传染性哺乳动物朊病毒通常以种属特异性的方式在宿主之间传播，由此提出了“TSE 种间屏障”的概念，用以限制跨物种传播事件²。目前对朊病毒种间屏障的生物学决定因素尚不完全清楚。传染性 PrP^TSE 与宿主 PrP^C 之间的氨基酸序列相似性可显著影响转化是否发生^3-5，但仍不足以解释所有在活体（in vivo）中观察到的朊病毒传播现象^6,7。

因此，对TSE种间屏障的表征在很大程度上依赖于动物攻毒实验：将某一物种的易感动物暴露于另一物种的朊病毒，并通过测定发病潜伏期和攻击率来评估传播效率。表达异源物种PrP^C的小鼠也常用于此类研究⁸。然而，转基因小鼠制备的成本高昂、朊病毒生物测定周期漫长，以及动物使用涉及的伦理问题，均制约了TSE种间屏障的实验研究。评估人类对TSE的种间屏障通常依赖于表达人源PrP^C的....

方案

在美国地质调查局国家野生动物健康中心开展的动物实验均遵循美国国立卫生研究院实验室动物福利办公室的指南，并根据机构动物护理和使用委员会协议 #EP080716 进行。来自猎人捕获动物的组织样本由威斯康星州或密歇根州自然资源部赠送。

1. 溶液配制

注意：以下列出的溶液是制备下文第2节中CER检测底物所必需的。每种溶液均需从较高浓度的储备液配制；各化学物质名称后括号内将注明推荐的储备液浓度。所有溶液均需在制备底物时新鲜配制，并在使用前于4 °C保存。

1. 配制裂解缓冲液：在 10 mM Tris（推荐使用 pH 7.5 的 1 M Tris 储存液）中，加入以下成分配制成溶液：100 mM 氯化钠（NaCl，1 M 储存液）、10 mM 乙二胺四乙酸（EDTA，pH 8.0 的 500 mM 储存液）、0.5% NP-40（10% 储存液）、0.5% 脱氧胆酸钠（DOC，10% 储存液）。
2. 配制转化缓冲液：在 1× 磷酸盐缓冲液（PBS，10× 储存液，pH 7.4）中，加入 0.05% 十二烷基硫酸钠（SDS，10% 储存液）和 0.5% Triton X-100（10% 储存液）配制成溶液。
3. 配制变性溶液：用 1× PBS（10× 储存液）配制两份 3 M 盐酸胍（GdnHCl，8 M 储存液）溶液。使用浓盐酸（HCl）将其中一....

结果

CER 检测的成功应用在很大程度上取决于转化反应中所用底物对的质量。因此，在制备 CER 底物对后，应进行质量控制性免疫印迹分析（图 2）。对两种底物均应取 10–25 μl 进行免疫印迹检测。每种底物中 PrP^C 均应易于检测到，且两种底物间的 PrP^C 水平应大致相同。免疫反应信号主要出现在 20 kDa 以上，但也可能观察到较小的条带。根据我们的经验，较小条带的出现具有物种依赖性。若观察到较低分子量的产物，应在两组底物对中均确认其存在。

必须用蛋白酶K（PK）处理底物，以确保CER底物不含内源性PrP^res（图2）。如果存在PrP^res，则用于制备底物的动物可能已感染或处于亚临床感染TSE状态。或者，底物中的PrP^C可能在变性或沉淀过程中错误折叠为抗PK的状态。无论原因为何，含有PrP^res的CER底物均不可用于转化实验。

.......

讨论

为成功完成本实验方案，应注意用于底物制备的未感染脑组织中的 PrP^C 水平（步骤 2.1.2）以及转化反应中的接种物与底物比例（步骤 4.4.2）。根据我们的经验，只要通过免疫印迹检测能够确认存在 PrP^C，脑组织在死亡后较长时间内仍可提取并用作 CER 底物（图 4）。事实上，在用于 CER 研究的猞猁脑组织中已观察到一定程度的自溶现象。尽管如此，源自这些脑组织的底物在孵育后仍能形成 PrP^res。我们推测，CER 检测方法的稳健性部分源于 CER 底物在 1.5 M GdnHCl 中的变性处理，该步骤可使多种蛋白酶失活。

种子与基质的比例可能需要通过实验确定，以获得可接受的 PrP^结果 通过免疫印迹检测信号。PrP 过多或过少^res 进行密度测定，高背景 PrP^res 对照样本中缺乏底物以及转化率不一致等情况均需对种子与底物的比例进行优化。实验中保持总体积为100 μl，采用的比例包括1:99 μl、2:98 μl.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
12% Bis-Tris SDS-PAGE 凝胶	Life Technologies	NP0342
0.5 mm 氧化锆珠	下一步进展	ZROB05	其他类型的珠子也同样有效
抗体	多家供应商		选择适当的初级和次级抗体用于PrP免疫印迹检测res 从目标物种
珠磨机	下一步进展	BBY24M
离心	贝克曼库尔特	369434	带温度控制的高速运转
锥形管	任何品牌
棉签	Uline	S-18991
杯状角声波破碎仪	热系统-超声波	W-380	Heat Systems-Ultrasonics, Inc. 现为 Qsonica, LLC
密度测定软件程序	UVP	Vision Works LS 图像采集与分析软件	其他程序（如 NIH ImageJ）也可使用
Dounce 匀浆器	Kimble Chase	885300
滚轴混合器	Labnet International	H5600
乙二胺四乙酸	Boston Bioproducts	P-770	危险化学品：眼部刺激
8 M 盐酸胍	赛默飞世尔科技	24115	危险化学品：急性毒性，皮肤刺激，眼睛刺激
加热块	Fisher Scientific	11-718
盐酸	Sigma-Aldrich	435570	危险化学品：强酸
4x 十二烷基硫酸锂上样缓冲液	Life Technologies	NP0008	危险化学品：皮肤 && 呼吸道刺激，严重眼损伤，易燃固体
甲醇	Fisher Scientific	A454-4	危险化学品：急性毒性，易燃液体
微量离心管	任何品牌
微型离心机	Labnet International	C1301
N-月桂酰基-肌氨酸（Sarkosyl）	Sigma-Aldrich	L-5125	危险化学品：急性毒性，皮肤刺激，眼损伤
Nonidet P-40	Amresco	M158	危险化学品：皮肤刺激，眼损伤
SDS-PAGE 凝胶系统	Life Technologies	NuPAGE 电泳系统	其他 SDS-PAGE 系统也可使用
PCR管（低吸附）	Axygen	PCR-02-L-C
研钵匀浆器	Fisher Scientific	03-392-106
pH计	Sentron	SI600
聚偏二氟乙烯膜	Millipore	IPVH00010
蛋白酶K	Promega	V3021	危险化学品：皮肤 &以及眼刺激、呼吸致敏、器官毒性
SDS-PAGE 样品用还原剂，10x	Life Technologies	NP0009
氯化钠	Fisher Scientific	7647-14-5
脱氧胆酸钠	Sigma-Aldrich	D6750	危险化学品：急性毒性
十二烷基硫酸钠	赛默飞世尔科技	28364	危险化学品：急性毒性，皮肤刺激，眼损伤，易燃固体
氢氧化钠	Sigma-Aldrich	S5881	危险化学品；强碱
注射器	BD 生物科学	各种	使用与待均质底物体积相匹配的注射器尺寸
注射器针头	BD 生物科学	各种
热振荡器（PCR管振荡器）	杭州All Sheng仪器有限公司	MS-100
Tris 碱	Bio Basic	77-86-1	危险化学品：可引起皮肤、眼睛、呼吸道刺激
Triton X-100	Integra Chemical Company	T756.30.30	危险化学品：急性毒性，眼刺激
涡旋振荡器	Fisher Scientific	12-812