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方法文章

评估可传播性海绵状脑病的物种屏障 体外 朊蛋白转化检测

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DOI：

10.3791/52522

⸱

2015年3月10日

 ,  ,  ,  , 
1USGS National Wildlife Health Center, 2Department of Soil Science, University of Wisconsin–Madison, 3Laboratory of Immunology, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, 4Merial Veterinary Scholars Program, School of Veterinary Medicine, University of Wisconsin–Madison, 5Department of Neurology, University of British Columbia

本文内容

摘要

测量朊病毒疾病跨物种传播屏障具有挑战性，通常需要通过动物攻毒实验或生化检测来完成。本文介绍了一种 体外 可预测物种屏障的朊病毒蛋白转化实验

摘要

研究可传播性海绵状脑病（TSEs，即朊病毒病）的跨物种传播具有挑战性，因为这类研究通常依赖于耗时且昂贵的体内动物攻毒实验。目前已开发出多种体外检测方法，用于测量朊病毒的物种屏障，从而减少动物使用，并比动物生物测定法更快地获得结果。本文介绍了快速体外朊病毒转化检测方法——转化效率比（CER）检测的实验方案。在该检测中，从未感染宿主脑组织中提取的细胞型朊蛋白（PrPC）分别在pH 7.4和pH 3.5条件下变性，以制备两种底物。当pH 7.4的底物与TSE病原体共同孵育时，PrPC转化为蛋白酶K（PK）抗性状态的量受到原始宿主对TSE病原体物种屏障的影响。相比之下，在pH 3.5的底物中，任何TSE病原体均可诱导PrPC发生错误折叠。通过比较两种底物中PK抗性朊病毒蛋白的含量，可评估宿主的物种屏障。我们证明，CER检测能够准确预测实验小鼠已知的朊病毒物种屏障；并举例展示了一些初步结果，提示美洲山猫（Lynx rufus）可能对白尾鹿（Odocoileus virginianus）的慢性消耗性疾病病原体具有易感性。

引言

可传播性海绵状脑病（TSEs，即朊病毒病）是一组具有较长潜伏期的致命性神经退行性疾病，可影响多种动物和人类。TSEs 的假定致病因子是一种宿主朊病毒蛋白（PrP）的错误折叠异构体，它能够通过模板导向的方式将正常的细胞型 PrP（PrPC）转化为具有感染性、与疾病相关的构象（PrPTSE），并在感染宿主的中枢神经系统组织中积累1。传染性哺乳动物朊病毒通常以种属特异性的方式在宿主之间传播，由此提出了“TSE 种间屏障”的概念，用以限制跨物种传播事件2。目前对朊病毒种间屏障的生物学决定因素尚不完全清楚。传染性 PrPTSE 与宿主 PrPC 之间的氨基酸序列相似性可显著影响转化是否发生3-5，但仍不足以解释所有在活体（in vivo）中观察到的朊病毒传播现象6,7。

因此，对TSE种间屏障的表征在很大程度上依赖于动物攻毒实验：将某一物种的易感动物暴露于另一物种的朊病毒，并通过测定发病潜伏期和攻击率来评估传播效率。表达异源物种PrPC的小鼠也常用于此类研究8。然而，转基因小鼠制备的成本高昂、朊病毒生物测定周期漫长，以及动物使用涉及的伦理问题，均制约了TSE种间屏障的实验研究。评估人类对TSE的种间屏障通常依赖于表达人源PrPC的基因工程小鼠。这类小鼠感染人源TSE后潜伏期较长，往往需要对人源PrPC分子进行改造才能实现快速发病9。在这些小鼠中，非人源TSE的潜伏期可能超过小鼠正常寿命，导致阴性结果的解读困难。非人灵长类动物也曾被用作研究人类种间屏障的替代模型，但此类研究同样面临其他动物实验所共有的挑战，且非人灵长类动物可能无法精确重现人类宿主中的疾病进程。

动物生物测定法仍是衡量一个物种对TSE易感性的“金标准”方法，但这些活体动物研究存在的障碍、成本及伦理问题已促使人们探索替代方法。已有多种 体外 基于检测宿主PrP转化的检测方法C 转化为蛋白酶K（PK）抗性状态（PrPres）在被PrP接种时TSE，已开发并用于研究TSE物种屏障10-12. 示例 体外 检测方法包括无细胞转化检测、蛋白质错误折叠循环扩增（PMCA）以及转化效率比率（CER）检测10-14尽管这些检测方法均未考虑自然感染后影响物种屏障的外周因素，但它们均可用于识别对TSEs具有潜在易感性的宿主。

本文介绍了CER检测的实验方案，该方案使用两种来源于正常脑组织匀浆的变性PrPC底物，在台式条件下进行朊病毒转化反应（图1）13。在pH 7.4条件下变性的底物中的PrPC，仅能在无种间屏障的情况下被反应中加入的PrPTSE种子转化为PrPres14。相比之下，在pH 3.5条件下变性的另一底物中的PrPC，可在与来自任何物种的PrPTSE共孵育后转化为PrPres，因此可作为转化反应的对照。pH 7.4底物中PrPC转化为PrPres的效率相对于pH 3.5底物的转化效率之比，可用于衡量种间屏障的强弱。我们发现，CER检测能够预测实验小鼠对多种TSE的已知种间屏障，并已将该检测方法用于评估包括大角羊在内的多种哺乳动物对慢性消耗性疾病（CWD）及其他TSE的种间屏障14,15。对于希望快速筛查TSE种间屏障或评估PrPC向PrPres转化能力的研究人员而言，该方法具有重要应用价值。

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方案

在美国地质调查局国家野生动物健康中心开展的动物实验均遵循美国国立卫生研究院实验室动物福利办公室的指南，并根据机构动物护理和使用委员会协议 #EP080716 进行。来自猎人捕获动物的组织样本由威斯康星州或密歇根州自然资源部赠送。

1. 溶液配制

注意：以下列出的溶液是制备下文第2节中CER检测底物所必需的。每种溶液均需从较高浓度的储备液配制；各化学物质名称后括号内将注明推荐的储备液浓度。所有溶液均需在制备底物时新鲜配制，并在使用前于4 °C保存。

  1. 配制裂解缓冲液：在 10 mM Tris（推荐使用 pH 7.5 的 1 M Tris 储存液）中，加入以下成分配制成溶液：100 mM 氯化钠（NaCl，1 M 储存液）、10 mM 乙二胺四乙酸（EDTA，pH 8.0 的 500 mM 储存液）、0.5% NP-40（10% 储存液）、0.5% 脱氧胆酸钠（DOC，10% 储存液）。
  2. 配制转化缓冲液：在 1× 磷酸盐缓冲液（PBS，10× 储存液，pH 7.4）中，加入 0.05% 十二烷基硫酸钠（SDS，10% 储存液）和 0.5% Triton X-100（10% 储存液）配制成溶液。
  3. 配制变性溶液：用 1× PBS（10× 储存液）配制两份 3 M 盐酸胍（GdnHCl，8 M 储存液）溶液。使用浓盐酸（HCl）将其中一份溶液的 pH 调整至 3.5 ± 0.05；另一份溶液应保持 pH 为 7.4 ± 0.05，必要时用浓 HCl 或氢氧化钠（NaOH）调节 pH。

2. 准备CER检测底物对

  1. 获取目标物种的健康非TSE感染性脑组织，并使用以下任一方法（Dounce匀浆器、珠磨法或研钵研杵）在裂解缓冲液中制备10%（重量/体积，w/v）的匀浆。通过注射器-针头匀浆法进一步细化所得匀浆，使用逐渐增加规格的针头，直至样品能轻松通过27 G针头被吸入和推出。
    1. 对于来自啮齿类及其他小型哺乳动物的样品，使用全脑进行匀浆制备；对于来自较大哺乳动物的样品，则使用延髓（脑干）组织制备匀浆。在确定脑匀浆用量时，所用体积不应超过步骤2.6中用于蛋白沉淀的离心机容量的50%。
    2. 若所获脑组织质量存疑，应在样品制备前通过SDS-PAGE16和免疫印迹17检测PrPC水平。
  2. 将脑匀浆分装至两个分别标记的塑料锥形管中，每管体积相等。向每管中加入GdnHCl（1 PBS中3 M溶液），pH分别为3.5或7.4，按1:1体积比加入脑匀浆中。
  3. 检测两种溶液的pH值。使用浓盐酸将pH 3.5的样品调节至pH ± 0.05；确保另一样品的pH保持在7.4 ± 0.05，必要时用HCl或NaOH调节。添加酸或碱时应谨慎，避免pH值超出范围。
  4. 将溶液在室温（RT）下置于翻转混合仪上旋转孵育5小时。
  5. 向各锥形管中的样品加入四倍体积的甲醇以沉淀蛋白质，涡旋混匀后于-20 °C孵育16–18小时。
  6. 在4 °C下以13,000 × g离心30分钟，沉淀样品。小心倾去并弃除上清液，让甲醇从沉淀中自然挥发。可用棉签辅助吸收附着在管壁内部的残留甲醇。注意不要使沉淀过度干燥，一旦甲醇不可见，立即进行下一步操作。
  7. 用转化缓冲液重悬蛋白沉淀。所用转化缓冲液的体积应等于步骤2.2中各管所加入的脑匀浆起始体积。
    注：用于重悬经pH 3.5和pH 7.4处理的样品所产生的蛋白沉淀的转化缓冲液，必须是上述步骤1.2中定义的溶液（含低浓度去垢剂且为生理pH）。
  8. 将样品在杯状超声仪中短暂超声处理（约30%最大功率下超声10秒），分装至标记的1.5 ml微量离心管中，每管0.5–1.0 ml。对每份样品取部分进行质量控制免疫印迹检测（步骤2.9）。其余分装样品储存于-80 °C，待进行CER实验时使用（第4节）。
  9. 在使用前对CER底物对进行质量控制（图2）。这些步骤可确保CER底物在转化研究中获得最佳结果。
    1. 确保两种底物中含有相近量的PrPC。通过SDS-PAGE16和免疫印迹17比较每种底物10–25 µl中的PrP水平。若pH 7.4和pH 3.5底物中的蛋白含量差异在约10%以内，则该对底物适用于CER研究。
      注：PrP免疫印迹不应显示明显的PrPC降解迹象。PrP免疫反应信号应主要位于>20 kDa区域。分子量低于此值的条带可能是降解产物。各底物对之间的条带模式应大致相同。
    2. 由于两种底物中的PrPC均应具有蛋白酶K（PK）敏感性，取每种底物10–25 µl，加入PK至终浓度为100 μg/ml，在37 °C、1,000 rpm条件下于温控振荡仪中消化1小时。通过SDS-PAGE16和免疫印迹17检测残留的PrP信号。若底物中存在PrPres，则不适用于CER研究。

3. 准备TSE致病因子种子

  1. 获取目标物种的TSE感染性脑组织，并按照上述2.1步骤所列方法，用1×PBS（pH 7.4）制备10%（w/v）的匀浆液。
    注意：朊病毒“种子”也可来源于中枢神经系统以外的其他TSE感染性组织，但目前尚未在已发表的文献中实验评估外周组织来源的“种子”对脑源性底物的转化效率。
  2. 将所得匀浆液分装至0.5 ml微量离心管中，每管100–300 µl，于-80 °C保存，待进行CER检测时使用。

4. CER 检测

注意：CER 检测涉及添加相对少量的 PrPTSE 将一种物种的（由“种子”提供）PrP 转入另一种物种过量的 PrP 中C （在未感染的脑组织“底物”中）来自另一物种的PrP，该PrP在pH 3.5或pH 7.4条件下已发生部分变性。经过长时间振荡孵育后，由模板驱动的PrP转化C 由 PrPTSE 通过PrP的密度测定信号来评估每个反应结果 蛋白酶K消化后经免疫印迹检测残留的PrPres 在先前于pH 3.5条件下变性的底物中的水平 与 7.4 提供了对物种屏障的度量。本实验方案的总体概述如下所示。 图1.

  1. 将未感染的 CER 底物对（实验需要等体积的、分别在 pH 3.5 和 pH 7.4 条件下预先变性的底物）以及 TSE 感染的种子溶液置于冰床上缓慢解冻（解冻时间约为 1 小时）。
  2. 完全解冻后，用 27 G 针头反复抽吸并推出每种底物溶液数次，以重新均质化。将每种 TSE 感染的种子溶液短暂超声处理 10 秒，功率约为最大功率的 30%。在准备转化反应期间，始终保持所有溶液处于冰上。
  3. 为每种待测的 TSE 病原体标记 5 个独立的低吸附、薄壁 PCR 管。
  4. 在这些 PCR 管中进行转化反应，向 95 μl 的（a）pH 7.4 条件下制备的 CER 底物和（b）pH 3.5 条件下制备的 CER 底物中各加入 5 μl 的 10% TSE 感染种子溶液。
    1. 对于每个实验样品，需在分别于 pH 3.5 和 pH 7.4 条件下预先变性的 CER 底物对中平行进行反应。
    2. 通过经验确定 TSE 病原体种子与未感染脑组织底物之间的最佳比例。常用的种子：底物比例保持总反应体积为 100 μl，包括 1:99 μl、2:98 μl 和 5:95 μl。对于大多数应用，5:95 μl 的种子：底物体积比是合适的，本实验方案中采用此比例。
  5. 为每种待测的 TSE 病原体准备三个对照样品，具体如下：（a）向 95 μl 转化缓冲液中加入 5 μl 的 10% TSE 感染种子溶液，作为输入 PrPres 的对照；向 95 μl 分别在（b）pH 3.5 和（c）pH 7.4 条件下制备的底物中各加入 5 μl 转化缓冲液，作为非特异性、非模板依赖性转化的对照。
  6. 将每个样品在其密闭的 PCR 管中短暂涡旋震荡，使种子与底物充分混合。随后在低速台式小型离心机中瞬时离心，以去除附着在 PCR 管盖内的反应混合液体积。
  7. 将装有样品的独立标记 PCR 管放入可容纳 PCR 管的台式恒温振荡器中，在 37 °C、1,000 rpm 条件下振荡 24 小时。
  8. 振荡结束后，加入 Sarkosyl 至终浓度为 2%（w/v），并加入蛋白酶 K（PK）至终浓度为 100 μg/ml。在恒温振荡器中以 1,000 rpm、37 °C 消化 1 小时。
    注：转化反应后加入 Sarkosyl 有助于 PK 对 PrPC 的消化。在未加种子的对照样品中（步骤 4.5），加入 Sarkosyl 可几乎完全消除假阳性信号。
  9. 加入 SDS-PAGE 上样缓冲液，将样品在 95°C 加热 5 分钟，随后通过 SDS-PAGE16 分离各样品中残留的 PrPres，并进行免疫印迹分析17。
    注：加入上样缓冲液并加热后，样品可立即进行后续处理，也可在免疫印迹前储存于 -20 °C 或 -80 °C。本文所有数据均使用 Novex NuPAGE 凝胶及转膜系统获得。CER 实验中的各个样品根据制造商说明书加入上样缓冲液和还原剂，随后在 95 °C 加热 5 分钟，每样取 30 μl 上样至 12% bis-tris 预制凝胶中。
  10. 计算转化效率比值（CER），作为衡量种间屏障的指标。通过密度测定法17测量 PrPres 的水平，将 pH 7.4 样品的总密度除以 pH 3.5 样品的总密度，再乘以 100，得到百分比形式的结果。
  11. 汇总独立实验重复的数据，计算给定 TSE 病原体作用下某物种的平均 CER ± 标准差。

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结果

CER 检测的成功应用在很大程度上取决于转化反应中所用底物对的质量。因此，在制备 CER 底物对后，应进行质量控制性免疫印迹分析（图 2）。对两种底物均应取 10–25 μl 进行免疫印迹检测。每种底物中 PrPC 均应易于检测到，且两种底物间的 PrPC 水平应大致相同。免疫反应信号主要出现在 20 kDa 以上，但也可能观察到较小的条带。根据我们的经验，较小条带的出现具有物种依赖性。若观察到较低分子量的产物，应在两组底物对中均确认其存在。

必须用蛋白酶K（PK）处理底物，以确保CER底物不含内源性PrPres（图2）。如果存在PrPres，则用于制备底物的动物可能已感染或处于亚临床感染TSE状态。或者，底物中的PrPC可能在变性或沉淀过程中错误折叠为抗PK的状态。无论原因为何，含有PrPres的CER底物均不可用于转化实验。

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讨论

为成功完成本实验方案，应注意用于底物制备的未感染脑组织中的 PrPC 水平（步骤 2.1.2）以及转化反应中的接种物与底物比例（步骤 4.4.2）。根据我们的经验，只要通过免疫印迹检测能够确认存在 PrPC，脑组织在死亡后较长时间内仍可提取并用作 CER 底物（图 4）。事实上，在用于 CER 研究的猞猁脑组织中已观察到一定程度的自溶现象。尽管如此，源自这些脑组织的底物在孵育后仍能形成 PrPres。我们推测，CER 检测方法的稳健性部分源于 CER 底物在 1.5 M GdnHCl 中的变性处理，该步骤可使多种蛋白酶失活。

种子与基质的比例可能需要通过实验确定，以获得可接受的 PrP结果 通过免疫印迹检测信号。PrP 过多或过少res 进行密度测定，高背景 PrPres 对照样本中缺乏底物以及转化率不一致等情况均需对种子与底物的比例进行优化。实验中保持总体积为100 μl，采用的比例包括1:99 μl、2:98 μl...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢 John Olsen（威斯康星州自然资源部）、Tom Cooley、Daniel O'Brien 和 Steve Schmitt（密歇根州自然资源部）以及 Daniel Walsh 博士（美国地质调查局国家野生动物健康中心）在组织样本获取方面的协助。同时感谢威斯康星州卫生实验室提供的诊断检测服务，以及 Tonie Rocke 博士及其团队（美国地质调查局国家野生动物健康中心）提供设备使用支持。文中提及的任何贸易、产品或公司名称仅用于描述性目的，不意味着美国政府的认可。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
12% Bis-Tris SDS-PAGE 凝胶Life TechnologiesNP0342
0.5 mm 氧化锆珠下一步进展ZROB05其他类型的珠子也同样有效
抗体多家供应商选择适当的初级和次级抗体用于PrP免疫印迹检测res 从目标物种
珠磨机下一步进展BBY24M
离心贝克曼库尔特369434带温度控制的高速运转
锥形管任何品牌
棉签UlineS-18991
杯状角声波破碎仪热系统-超声波W-380Heat Systems-Ultrasonics, Inc. 现为 Qsonica, LLC
密度测定软件程序UVPVision Works LS 图像采集与分析软件其他程序（如 NIH ImageJ）也可使用
Dounce 匀浆器Kimble Chase885300
滚轴混合器Labnet InternationalH5600
乙二胺四乙酸Boston BioproductsP-770危险化学品：眼部刺激
8 M 盐酸胍赛默飞世尔科技24115危险化学品：急性毒性，皮肤刺激，眼睛刺激
加热块Fisher Scientific11-718
盐酸Sigma-Aldrich435570危险化学品：强酸
4x 十二烷基硫酸锂上样缓冲液Life TechnologiesNP0008危险化学品：皮肤 && 呼吸道刺激，严重眼损伤，易燃固体
甲醇Fisher ScientificA454-4危险化学品：急性毒性，易燃液体
微量离心管任何品牌
微型离心机Labnet InternationalC1301
N-月桂酰基-肌氨酸（Sarkosyl）Sigma-Aldrich L-5125危险化学品：急性毒性，皮肤刺激，眼损伤
Nonidet P-40AmrescoM158危险化学品：皮肤刺激，眼损伤
SDS-PAGE 凝胶系统Life TechnologiesNuPAGE 电泳系统其他 SDS-PAGE 系统也可使用
PCR管（低吸附）AxygenPCR-02-L-C
研钵匀浆器Fisher Scientific03-392-106
pH计SentronSI600
聚偏二氟乙烯膜MilliporeIPVH00010
蛋白酶KPromegaV3021危险化学品：皮肤 &以及眼刺激、呼吸致敏、器官毒性
SDS-PAGE 样品用还原剂，10xLife TechnologiesNP0009
氯化钠Fisher Scientific7647-14-5
脱氧胆酸钠Sigma-Aldrich D6750危险化学品：急性毒性
十二烷基硫酸钠赛默飞世尔科技28364危险化学品：急性毒性，皮肤刺激，眼损伤，易燃固体
氢氧化钠Sigma-AldrichS5881危险化学品；强碱
注射器BD 生物科学各种使用与待均质底物体积相匹配的注射器尺寸
注射器针头BD 生物科学各种
热振荡器（PCR管振荡器）杭州All Sheng仪器有限公司MS-100
Tris 碱Bio Basic77-86-1危险化学品：可引起皮肤、眼睛、呼吸道刺激
Triton X-100Integra Chemical CompanyT756.30.30危险化学品：急性毒性，眼刺激
涡旋振荡器Fisher Scientific12-812

参考文献

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