背根神经节神经元和区分脂肪干细胞：一种在体外共培养模型来研究周围神经再生

周围神经损伤是常见的发生在每年的一个主要年轻约9000例，英国和就业人口^1。尽管显微神经修复技术，功能恢复正常是不可能实现的与造成损害的手的感觉，减少运动功能和频繁的疼痛和不耐低温^2。这种伤害对病人深刻而持久的影响，他们进行日常活动，用了不到60％的恢复工作³能力。

损伤后，表型和神经元的形态和雪旺细胞（SC），以创造一个合适的环境，以允许轴突出芽变化。如果横断，神经分为近端和远端树桩;近端残端是从再生过程发生，而远端残端点经历沃勒变性于是SC分离从受伤的轴突，脱分化和增殖。这是对消除髓鞘碎片和准备远端残端神经再生成^4,5根本。轴突出芽被生产在远端残端释放的SC神经营养因子和趋化因子的支持，并通过基底层留下以下沃勒变性^6,7导向。 SC对准旁边的再生轴突形成Büngner的乐队，其中援助轴突生长朝着靶器官，减少神经内膜管外的分支。以下再支配，SC形成新的髓鞘包裹再生轴突，但感觉及运动功能仅部分恢复^8。

背根神经节（DRG）是位于脊柱的椎间孔结构，含有该感官神经元细胞支配周围器官。当解离，它们可以作为一个合适的体外模埃尔神经再生⁹的研究^{- 11，}包括髓鞘形成调查。特别是成年DRG神经元模拟体内的特点，这些细胞，并提供了一个强大的工具来研究周围神经修复组织工程的新战略。

共培养物表示一个动态系统，它模拟在体外两个（或多个）细胞类型中特定的相互作用的体内环境。其中的一个细胞共培养模型的一个优点是灵活性和高的控制，可以在细胞外环境中发挥。 DRG神经元已被经常使用在共培养系统的SC以模仿在周围神经系统^10,12的两种细胞类型之间发生的实际相互作用^{- 14。}由此表明了SC分泌胞外基质（ECM）蛋白和生长因子，能显着提高DRG神经元的存活能力和萌芽突起^15,16。然而，SC需要的时间长的期间的增殖，尽管在细胞培养技术的进步，但仍难以产生细胞用于组织工程应用的一个适当的数目。此外，一个健康的神经的牺牲是必要收获自体SC。因此，在采购SC的差为组织工程和在神经再生的体外测试重要。在此视图中，ASC可以被认为是有价值的替代的组织工程化构建体的发展，以用于外周神经修复^17,18。先前的工作证明了这些细胞分化成的SC状的ASC的能力，表达特性胶质标记物，如S-100，P75，胶质纤维酸性蛋白^{（GFAP）19，}以及髓磷脂蛋白零^（P0）20 。的胶质生长因子，如脑源性神经营养因子的分泌（BDNF），神经生长因子（NGF）和神经胶质细胞源性神经营养因子（GDNF），也观察到^21,22。因此，SC-像ASC可用作外周神经再生的启动子，如在体外证明既和体内研究^{23 - 26。}此外，ASC可以通过在更高的数目相比于其它干细胞类型的微创程序收获;干细胞的脂肪组织中的频率为100至1000倍，比在骨髓²⁷更高，并且它们具有较高的增殖率相比，SC和骨髓间充质干细胞。

这项工作的目的是提供一个详细的协议分别进行分离DRG神经元和ASC高效率的收获，后者分化为SC样细胞。因此这两种细胞类型的共培养将提供可用于未来的研究上的DRG网元的能力非常实用的系统urons发芽轴突和不同的支架用于神经组织工程髓鞘的形成机制。

注：所有涉及动物的实验中，进行了根据英国动物（科学程序）法，1986。

1.实验装置

1. 在此之前开始组织和细胞的收获，检查所有的工具都是无菌的。无论是必要的，高压灭菌一双敏锐的手术剪，非常细镊子和罚款标准镊子。还采用UV杀菌，乙醇暴露或蒸汽消毒适当的细胞接种前消毒每个基板。
2. 干细胞采集和分化制备传媒
   1. 制备干细胞的生长培养基 ，含有最低必需培养基（α-MEM），补充有10％胎牛血清（FBS），200毫摩尔L-谷氨酰胺和1％青霉素-链霉素（PS）。
   2. 通过在2.436毫升无菌二甲亚砜中溶解10毫克福斯克林的制备福斯克林的10mM储备溶液。使用14微米的最终浓度。</ li>
   3. 通过在1.43毫升无菌二甲亚砜中溶解50毫克制备视黄酸的35毫克/毫升的储备溶液。使用在350纳克/毫升的最终浓度。
   4. 通过在100μl蒸馏水的无菌水将10微克的冻干粉末的制备血小板衍生的生长因子（PDGF）股（100微克/毫升）。使用在5毫微克/毫升的最终浓度。
   5. 通过在500μl蒸馏水的无菌水中溶解为50μg冻干粉末制备碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的股票（100微克/毫升）。使用以10毫微克/毫升的最终浓度。
   6. 制备干细胞的分化培养基 ，含有补充了14μM福斯克林，126纳克/毫升的胶质生长因子2（GGF-2），5纳克/毫升血小板衍生的生长因子（PDGF），和10毫微克的干细胞生长培养基/毫升碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）。
3. 对于神经元的收获和分离制备的媒体和股票的解决方案
   1. 准备BottenstEIN和佐藤（BS）中^28，加入1％PS和1％N2补充火腿的F12培养基。计算出所需的每孔500μl的终体积（如果使用24孔板）。
   2. 在1.25％重量/体积浓度准备胶原酶IV类股在火腿的F12培养基。过滤器 - 消毒在-20℃下为200微升等分试样的溶液，并存储。
   3. 以2.5％重量/体积浓度的Ham的F12培养基制备牛胰蛋白酶的股票，在-20℃下为200微升等份过滤消毒和储存。
   4. 制备的神经生长因子（NGF），为200微升原液以5微克/毫升的过滤灭菌的1毫克的F12培养基和存储/ ml的无脂肪酸的牛血清白蛋白（BSA）溶液中的浓度在-20℃下等分。重组后，不要过滤NGF。
4. 在情况下，没有表面改性已经在RT被执行时，涂层盖玻片/板用聚-D-赖氨酸（0.1mg / ml的15分钟）和/或层粘连蛋白（2-10微克/ ^平方厘米为2小时，在37℃），以支持神经元附着和神经突长出适当。
5. 使用之前，请务必热身水浴媒体在37℃。

2.脂肪干细胞（ASC）采收和分化成表型SC

1. ASC收获成年雄性SD大鼠内脏和腹股沟脂肪
   1. 在此之前开始，准备一个管10-15毫升汉克斯“平衡盐溶液（HBSS）辅以PS解决方案和存储在冰上直到脂肪收获1％V / V。
   2. 终止大鼠颈椎脱位和斩首。剃鼠，并通过腹部皮肤做一个切口，露出内脏，避免出血。去除内脏脂肪包裹胃肠蠕动（通常特点是脂肪黄色的一致性），并从周围的成年雄​​性SD大鼠睾丸在腹股沟的脂肪。转让日Ë脂肪含有HBSS冰上管。
   3. 在生物安全柜（Ⅱ类）切碎用剪刀和无菌刀片直到细一致性脂肪到达，并将其传输到含有15毫升的0.2％的管重量/体积的胶原酶I型溶液新鲜制备和过滤灭菌的当天。
   4. 传送管在水浴中于37℃和离开的脂肪组织在酶的存在下消化30分钟-1下连续搅拌小时。密切监测消化和停止之前组织完全分离，这将提高细胞活力和细胞产量。通过100微米的细胞滤网过滤南屯离解的组织。
      注：良好组织消化将导致脂肪，可见由眼睛的均匀一致性时轻轻摇动试管，获得为米色外观。
   5. 通过加入含胎牛血清15毫升干细胞生​​长培养基，在37℃和离心机的中和该酶在160 g下10分钟的溶液中，以便收集所述基质血管级分，包括干细胞，在管的底部。
   6. 在这个阶段，将沉淀可以在1ml的红血细胞被重悬于裂解缓冲液以除去血细胞污染。再悬浮和移液1分钟后，加入10ml新鲜的干细胞生长培养基并离心，在160 g下10分钟。
   7. 小心地从管吸出上清液，注意所沉积的细胞沉淀在底部。重悬的细胞在10ml的干细胞的生长培养基中，将其转移到75cm ²的培养瓶中，并培育在37℃，5％的CO _2。维持细胞在亚汇合的水平，直到通道1-2，改变培养基每3天。
2. ASC分化为SC型
   1. 在通道1-2，从75cm ²的烧瓶中取出干细胞生长培养基，并将其用10ml含有1mMβ巯基乙醇新鲜编写，J新鲜培养基替换红色和过滤灭菌的当天。孵育所述细胞在37℃，5％CO ₂的24小时。在这个阶段，重要的是，将细胞接种在开始分化前的低密度（30％）。
   2. 小心用HBSS，抽吸洗涤细胞，并将其与含有350毫微克/毫升的维甲酸10毫升介质的替换。孵育所述细胞在37℃，5％CO ₂的72小时。尽量减少细胞培养基暴露于光。
   3. 后3天，用HBSS，吸小心洗细胞，并将其用10毫升干细胞分化培养基替换（见步骤1.2.6）。维持细胞在亚汇合的水平，改变培养基每3天。
      注：关注中2周的潜伏期中，ASC分化为SC样ASC，表达自己的特征表型（主要表现在Kingham的等^5）。然后，他们可以使用，直到第10代，而不在行为²⁹显着的变化。

1. 终止大鼠颈椎脱位和斩首。剃大鼠和解除皮肤暴露脊柱。使用锋利的剪刀，excide脊柱服用局限于器官和血管的格外小心。转移脊柱中使用培养皿的生物安全柜（Ⅱ类）和除去任何背侧部分。
2. 划分成两半沿使用无菌和锋利的外科剪刀，以暴露脊髓组织的纵向轴线的脊柱。在这一点上，是有帮助的切脊柱在下面的肋条笼形件的水平两个较小的段，以使其更容易的DRG神经元的收获过程中处理。用细镊子，轻轻取出所有的脊髓组织，注重不拉并取出DRG根源。通过这种方式，背根神经节和根部将脊椎管内露出，仍包裹在列。观察DRG为白色丝状COMI直接从运河纳克出来。
3. 通过使用非常细镊子，深入到椎运河和注意勿损伤神经节的根部拔出从脊椎管整个DRG根（不仅仅是DRG）。转移DRG到含有3-4毫升补充有1％的PS的Ham的F12培养基的小培养皿（60 ^平方毫米）。如果使用不同的动物，使用不同的菜肴。
4. 在解剖显微镜下，清洁任何过量使用无菌镊子和手术刀，以减少神经胶质细胞污染周围的神经节神经根的DRG。转移DRG成小培养皿（35 ^平方毫米）1.8毫升新鲜的F12培养基。
5. 加入200微升的1.25％重量/体积的胶原酶IV型储液（0.125％终浓度）孵育的DRG，在37℃，5％CO ₂下1小时。小心吸用玻璃吸管的媒体，要注意不要抽吸或损坏DRG。加入新鲜的F12培养基水嫩mented用0.125％重量/体积的胶原酶IV型酶孵育1小时，如前所述。
6. 吸出中，轻轻地洗F12培养基DRG。添加然后1.8毫升F12培养基和200μl的胰蛋白酶（最终浓度为0.25％重量/体积），并孵育在37℃，5％CO ₂的30分钟。
7. 去除胰蛋白酶和加入1 ml F12培养基中添加500微升FBS的逮捕酶促反应。吸出培养基，并轻轻洗F12培养基的DRG为3次，以除去血清的痕迹。
8. 加入2毫升新鲜F12培养基并小心地用培养基转移DRG入15ml管中，使用玻璃吸管。轻轻吹打上下（约8-10倍）与玻璃吸管（塑料尖端可以作为替代）解离的DRG神经元。
9. 允许沉淀沉降在管的底部，并收集在一个新的管中的介质。加入2毫升新鲜F12培养基含有该沉淀的管，并重复米器的机械解离与玻璃吸管。重复此步骤，直至停牌变得均匀（约3-4倍），并收集在新管所有分离的DRG。这种方法减少了应力从机械解离导出，提高了神经元的存活力。
10. 过滤所得的悬浮液均质化到一个新的15ml试管用100微米的细胞过滤网来去除未离解的神经元和其他杂物。在这个阶段，这可能是方便的第一过滤细胞悬浮到50ml试管中，然后将溶液转移到用玻璃吸管的小管中。离心该悬浮液在110 g下5分钟。
11. 通过加入500微升30％BSA溶液，以500μl的F12培养基中制备15％的牛血清白蛋白（BSA）。慢慢吸管将溶液倒15毫升管的壁以创建一个渐进蛋白路径。在这个阶段，它是有帮助的，以保持所述管以45°角和缓慢释放使用上的数字的BSA猎鹰管作为形成“轨道”的参考。
12. 吸从步骤3.10离开将500μl上清液在管的底部，并且重悬细胞沉淀在相同的培养基中。慢慢吸管沿预先制备在步骤3.11（使用对管作为参考的数字），并离心分离，在500 g下5分钟的蛋白路径的悬浮液中。
13. 吸出上清液，重悬在1ml改性BS培养基（或混合介质为将SC-状ASC / DRG共培养的沉淀，如在步骤4.5如下所述。
    注：重新悬浮DRG神经元的体积可以由所需的实际体积，这取决于所需的最终细胞浓度和样品的数量被接种。一只动物将提供足够的细胞用于24孔板实验。
14. 孵育接种的样品在37℃，5％CO ₂下2小时，以允许细胞附着和最后加入补充有神经生长发50ng / ml的新鲜BS培养基构造函数（NGF）。

的SC-像ASC和DRG神经元4.直接共培养

1. 如在步骤中描述2.2.3维持在培养中在亚汇合水平SC状的ASC。之前DRG收获二十四小时后，吸出干细胞的分化培养基和用HBSS洗涤细胞。抽吸和孵化在3ml胰蛋白酶在37℃，5％CO ₂下3分钟。
2. 检查在光学显微镜的所有细胞从烧瓶已脱离下。轻轻拍打瓶以帮助脱离。加7毫升培养基以停止胰蛋白酶反应，收集细胞悬浮液在一个15毫升管和离心机在110 g下5分钟。
3. 吸出上清液和重悬细胞沉淀在5毫升的干细胞分化培养基。计数使用血球细胞，并根据所要求的最终浓度稀释的细胞悬浮液。理想的是，播种20000 SC状ASC /厘米²将保证细胞的汇合层。
4. 种子对SC-状ASC上的基板，并培育在37℃，5％CO ₂的24小时，以允许细胞附着。
5. 经过24小时培养后，吸出培养基，并如在步骤3.14和3.15中所述的细胞的顶部添加DRG神经元。培养基改变为含50％的干细胞分化的培养基和BS培养基的50％的混合介质。此外，减少在最终的混合介质中的FBS的浓度为1-2.5％有助于避免污染来自DRG离解衍生卫星细胞的增殖。
6. 孵育共培养的样品，在37℃，5％的CO ₂和在培养维持为将来的测试所需的时间。

分离的DRG神经元的文化代表了一个合适的体外模型神经再生的研究。然而，未经处理的基材不提供一个合适的环境DRG附件和延伸突起的。 SC状的ASC是能够产生的生长因子和趋化因子19，其可以提高DRG神经元的萌芽神经突的能力，当他们被释放在培养液中。因此，SC-像ASC在培养系统中的存在可以在调节DRG功能中发挥重要作用。

这个协议（ 图1）示出了执行的SC-像ASC和DRG神经元，在此期间，神经元细胞得到与先前接种的SC状的ASC直接接触的直接共培养的过程。与此过程相关的主要困难是从不同的动物收获DRG神经元的数量的高可变性。出于这个原因，结果可能是，有时难以COMPARe和一个应特别注意的播种过程期间，以获得总是在每个实验可比较的细胞密度支付。的协议已被优化，以减少从使用的BSA梯度（步骤3.11）的背根神经节神经元的解离其余卫星细胞中的至少数。另外，胞嘧啶阿拉伯糖（ARA-C）的补充可以被添加到BS介质，为了进一步最小化卫星细胞群，如由Kingham的等 11。然而，在治疗时间的选择必须是与DRG和SC状ASC活力，也受ARA-C的补充剂在培养基中的存在小心平衡。因此，它是很难做到一个卫星的无细胞系统。

图2示出的SC-状的ASC用于DRG轴突使用未处理的和化学修饰的聚在共培养模型发芽的重要性-己内酯（PCL）薄膜作为底物。 DRG神经元迈ntained在培养中存在或不存在的SC状ASC 3天后，使用含有50％的BS培养基中，干细胞分化培养基的50％的混合溶液中，如在步骤4.5中所述。按照此期间，将细胞固定在4％多聚甲醛，并用β微管蛋白III（DRG神经元）和S100（SC状ASC）来研究细胞的形态，并研究DRG神经元的突出突起的能力。无轴突上观察到在不存在的SC状的ASC（ 图2A）未处理的表面，而突起形成在共培养系统（ 图2C）中的明显改善。平均来说，每单元体突起的数目显著从0中的干细胞的存在提高到3。这些结果确认还用扫描电子显微镜（SEM）分析，在图3所示给出。特别是，SEM图像显示，DRG神经元的萌芽神经突的能力优先发生结合具有SC，如ASC，如由黄色箭头如图3C所示。

应当指出的是，使用的层粘连蛋白修饰的底物（包括层粘连蛋白衍生肽）在含有DRG神经元培养系统已被频繁定义为合适的条件的神经元细胞培养物，具有对神经突形成和扩展的显着效果30 - 32 。然而，在图2D和图3D中所示的结果表明，化学和生物线索的组合，可以进一步提高DRG神经元的反应。

图1.制备直接DRG-SC状ASC共培养体系。DRG神经元和ASC分别从脊柱和成年发作的内脏和腹股沟脂肪衍生êSD大鼠。脂肪组织的通过酶反应的级联消化后，ASC分化成的SC样细胞和直到需要保持在亚汇合状态。 SC-像ASC是在之前的DRG收获每个基板24小时前的种子。在当天，DRG神经元被提取，并通过一系列的酶和机械作用解离。神经元，然后接种在先前接种的SC状的ASC的顶部和保持在培养直至测定（混合介质：含50％的干细胞分化培养基和改性BS培养基的50％）。 请按此查看大版本这个数字。

DRG神经元在不同的培养条件图2.荧光图像。（A）未经处理的PCL薄膜;（B）RGD改性PCL薄膜;（C）共培养与未经处理的PCL电影SC-像ASC;（D）共培养与RGD修饰PCL电影SC-像ASC。细胞维持在培养使用含有50％的改性的BS培养基和干细胞分化培养基的50％的混合溶液中3天。在此时间后，将细胞固定在4％多聚甲醛，透化在一个的Triton-X溶液，和非特异性结合位点用1％BSA封闭。那么神经细胞进行染色对β-III微管蛋白（FITC，绿色）和对S-100 SC-像ASC（AlexaFluor568;红色）抗体。最后细胞核用DAPI染色（蓝色）。使用荧光显微镜（Olympus BX60，日本）获得的图像。 （重新打印与许可德卢卡等 30。 请点击此处查看大图VERS离子这个数字。

DRG神经元在不同的培养条件下的图3的SEM图像（A）未处理的PCL膜（B）的 RGD修饰的PCL膜;（C）的共培养与未处理的PCL膜的SC状ASC;（D）的共培养与RGD修饰的PCL膜的SC-状的ASC。黄色箭头指示的SC-像ASC和背根神经节之间的接触点，证实它们在共培养系统中的直接相互作用。细胞维持在培养3天，并固定在2.5％戊二醛。以下脱水梯度乙醇系列（50％，70％，90％，100％），将细胞最后漂洗中六甲基二硅和安装在存根和金溅射SEM分析前干燥。使用SEM（蔡司EVO60，英国）以加速体积分别获取的图像踏歌的10kV的。 （重新打印与德卢卡等 30权限。 请点击此处查看该图的放大版本。

作者确认不存在与本出版物相关的利益冲突。