Ex Utero 电穿孔与小鼠海马组织的器官型切片培养

摘要

本文介绍了一种用于研究海马发育过程中特定基因调控机制的实验方案。通过采用 子宫外 电穿孔与器官型脑片培养技术可实现单个细胞中目的基因表达的上调或下调，并追踪其在发育过程中的命运。

摘要

小鼠遗传学为研究特定基因在发育过程中的作用提供了强有力的工具。通过免疫组织化学和分子生物学方法分析其表型，可获得有关潜在靶基因及信号通路的信息。为进一步阐明特定的调控机制，需要一种能够仅对特定组织中的少量细胞进行基因操作的系统，例如通过特定基因的过表达、敲除或重新引入，并追踪这些细胞在发育过程中的命运。为实现这一目标 子宫外 海马结构（尤其是齿状回）的电穿孔结合脑片组织培养提供了这样一种工具。利用该系统产生嵌合性基因缺失，可确定目的基因是否自主性地调控发育过程，例如前体细胞增殖或神经元分化。此外，该系统还便于通过重新引入被删除的基因或其下游靶基因来挽救表型。相比之下 在子宫内 电穿孔 子宫外 该方法提高了成功靶向海马齿状回等脑深层区域的效率。总体而言 子宫外 电穿孔与器官型脑片培养为在模拟内源性条件的半天然环境中研究调控机制提供了有力工具。

引言

海马体在记忆、学习以及情绪行为中发挥着重要作用。其主要功能之一是将短期记忆巩固为长期记忆，这一过程需要神经系统的高度可塑性。海马体的齿状回是信息输入的主要门户，也是成年期持续发生神经发生的两个脑区之一^1,2。海马结构的发育主要发生在胚胎发育晚期，尤其是出生后的前3至4周³。在齿状回的早期发育过程中，会建立一个干细胞库，该干细胞库对于出生后及成年期的神经发生至关重要⁴。发育中的神经元会经历多个阶段，从干细胞开始，经过多个前体细胞阶段，最终发育为未成熟神经元，再成为成熟神经元，这一过程贯穿出生后及成年期的神经发生。在神经发生的各个阶段，特定基因的表达是必需的，以支持新生神经元的成熟及其整合到海马神经环路中^5,6。

利用小鼠遗传学结合免疫组织化学表型分析以及分子生物学方法，能够确定其中许多基因的表达模式和功能。此外，微阵列分析以及染色质免疫共沉淀（ChIP）技术也提供了有关这些基因潜在直接或间接靶基因的信息^7,8。然而，关于海马发育调控机制，特别是齿状回发育过程中的许多问题仍待解决。为了进一步了解特定基因的调控方式，需要一种能够通过下调或上调目的基因和/或其靶基因来操控少量细胞，并追踪这些细胞在发育过程中命运的技术体系。在体电穿孔技术可用于递送shRNA、目的基因的cDNA或Cre重组酶，从而实现上述目标。为确保目的DNA或小RNA的表达....

方案

注意：所有动物实验均依照德国法律进行，并已获得图宾根市政府部门的批准。

1. 微量移液器、溶液和膜的制备

1. 玻璃微电极的制备
   1. 使用微电极拉制仪，按照以下程序拉制玻璃微电极：加热温度：540，拉力：125，速度：20，延迟：140。针尖长度约为5.5 cm。
   2. 使用微磨机对针尖进行斜面打磨，获得约4 mm的合适尖端尺寸。将微电极存放于盒子或15 cm的培养皿中，以防止尖端受损。
2. 溶液的配制
   1. 质粒DNA溶液
      1. 根据制造商提供的操作说明，使用无内毒素大提试剂盒制备含有目标cDNA构建体的质粒DNA。
      2. 将质粒DNA溶液用无内毒素的Tris-EDTA缓冲液调整至终浓度为3 µg/µl（不加GFP spike载体）或4 µg/µl（加入1 µg GFP spike载体），并加入Fast Green染料至终浓度为0.05%。
   2. 层粘连蛋白储存液
      1. 将1 mg层粘连蛋白溶于无菌水中，定容至1 ml。分装为100 µl每份，于-80 °C保存。
   3. 聚-L-赖氨酸储存液
      1. 将50 mg聚-L-赖氨酸溶于50 ml无菌水中，配制成终浓度为1 mg/ml的溶液。....

结果

转录因子 Bcl11b 的缺失会导致前体细胞增殖和神经元分化受损，从而引起齿状回体积减小和细胞数量减少。此外，突变神经元无法整合到海马神经环路中，导致学习和记忆能力受损⁸。为探究 Bcl11b 在这些过程中所涉及的调控机制，采用了子宫外电穿孔技术（ex utero electroporation）。

为了探究Bcl11b是否以细胞自主性方式调控神经元细胞分化，通过在E15.5时将GFP-Cre重组酶构建体或单独的GFP质粒经体外（ex utero）电穿孔导入Bcl11b^flox/flox小鼠海马组织，随后进行长达电穿孔后18天的器官型脑片培养，从而在组织中产生Bcl11b的嵌合性缺失¹¹（图2A、B；该图已根据文献⁸修改）。为确定Bcl11b是否以细胞自主性方式调控颗粒细胞的分化，使用特异性识别NeuroD及GFP的抗体进行了免疫荧光染色。NeuroD在有丝分裂阶段2b/3期.......

讨论

海马体在学习和记忆中具有重要功能。齿状回是成年期仍持续发生神经发生的两个脑区之一，另一个为侧脑室下区。出生后及成年期的海马神经发生过程相似，均涉及多种共同因子。明确这些因子的调控机制，将有助于理解神经退行性疾病，进而推动新疗法和预防措施的开发。要获得此类信息，需要一种能够在原位环境中对单个细胞进行操控并观察的系统，正如所展示的那样 子宫外 电穿孔结合脑片器官型培养

ex utero 电穿孔技术最初成功应用于皮层发育的研究^11,16。据我们所知，探讨 Bcl11b 在海马发育中作用的研究是首次描述将 DNA 通过 ex utero 电穿孔技术导入齿状回组织的方法⁸。本实验方案基于 Polleux 团队研究皮层发育所发表的方法^11,12。为了成功将该方法应用于齿状回的研究，必须对电极的大小和位置进行调整。将负极置于靠近注射部位的皮层区域，正极置于对侧耳下方，从而改变电穿孔的极性，成功将 DNA 导入齿状回细胞中。正确放置电极并施加 0.06 至 0.08 mA 的电流.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Flaming/Brown 微量移液器拉制仪	Sutter Instruments Company (USA)	P-97
精细玻璃移液管	Warner Instruments	G100F-4
微电极研磨仪	Narishige, Japan	EG-44
麻醉支架装置	Harvard Apparatus	PY2 34-0412
Halovet 蒸发麻醉器	Harvard Apparatus	PY2 34-0398
Fluovac 麻醉系统	Harvard Apparatus	PY2 34-0387
IMS Fluosorber 气体吸附装置	Harvard Apparatus	PY2 34-0415
麻醉诱导室	Harvard Apparatus	PY2 34-0460
电穿孔仪	BEX Company	CUY21 EDIT
带盘状电极的镊子	BEX Company	LF650P3	适用于 E15.5 的 3 mm 电极
带盘状电极的镊子	BEX Company	LF650P5	适用于 E18.5 的 5 mm 电极
Picospritzer III 微量压力注射仪	Parker Hannifin Corporation	P/N 052-0500-900
HM 650 V 振动切片机，230 V	Thermo Scientific	920120
解剖显微镜	Carl Zeiss Microscopy Gmbh	Stemi SV8
倒置显微镜	Leica	Leica DM IL LED
共聚焦显微镜	Leica	Sp5II
6 孔板	BD Falcon	#353502
6 孔板	CELLSTAR	#657160
组织培养小室	BD Falcon	#353090
快绿染料	Sigma	F7252
层粘连蛋白	Sigma	#L2020
聚-L-赖氨酸	Sigma	#P5899
弹簧剪	Fine Science Tools	15003-08
超精细邦氏剪	Fine Science Tools	14084-08
镊子	Dumont #55	11255-20 Inox
HBSS 10 倍浓缩液	Life Technology	14180-046
BME	Life Technology	41010-26