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方法文章

Ex Utero 电穿孔与小鼠海马组织的器官型切片培养

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DOI：

10.3791/52550

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2015年3月4日

 ,  , 
1Institute of Molecular and Cellular Anatomy, University of Ulm

本文内容

摘要

本文介绍了一种用于研究海马发育过程中特定基因调控机制的实验方案。通过采用 子宫外 电穿孔与器官型脑片培养技术可实现单个细胞中目的基因表达的上调或下调，并追踪其在发育过程中的命运。

摘要

小鼠遗传学为研究特定基因在发育过程中的作用提供了强有力的工具。通过免疫组织化学和分子生物学方法分析其表型，可获得有关潜在靶基因及信号通路的信息。为进一步阐明特定的调控机制，需要一种能够仅对特定组织中的少量细胞进行基因操作的系统，例如通过特定基因的过表达、敲除或重新引入，并追踪这些细胞在发育过程中的命运。为实现这一目标 子宫外 海马结构（尤其是齿状回）的电穿孔结合脑片组织培养提供了这样一种工具。利用该系统产生嵌合性基因缺失，可确定目的基因是否自主性地调控发育过程，例如前体细胞增殖或神经元分化。此外，该系统还便于通过重新引入被删除的基因或其下游靶基因来挽救表型。相比之下 在子宫内 电穿孔 子宫外 该方法提高了成功靶向海马齿状回等脑深层区域的效率。总体而言 子宫外 电穿孔与器官型脑片培养为在模拟内源性条件的半天然环境中研究调控机制提供了有力工具。

引言

海马体在记忆、学习以及情绪行为中发挥着重要作用。其主要功能之一是将短期记忆巩固为长期记忆，这一过程需要神经系统的高度可塑性。海马体的齿状回是信息输入的主要门户，也是成年期持续发生神经发生的两个脑区之一1,2。海马结构的发育主要发生在胚胎发育晚期，尤其是出生后的前3至4周3。在齿状回的早期发育过程中，会建立一个干细胞库，该干细胞库对于出生后及成年期的神经发生至关重要4。发育中的神经元会经历多个阶段，从干细胞开始，经过多个前体细胞阶段，最终发育为未成熟神经元，再成为成熟神经元，这一过程贯穿出生后及成年期的神经发生。在神经发生的各个阶段，特定基因的表达是必需的，以支持新生神经元的成熟及其整合到海马神经环路中5,6。

利用小鼠遗传学结合免疫组织化学表型分析以及分子生物学方法，能够确定其中许多基因的表达模式和功能。此外，微阵列分析以及染色质免疫共沉淀（ChIP）技术也提供了有关这些基因潜在直接或间接靶基因的信息7,8。然而，关于海马发育调控机制，特别是齿状回发育过程中的许多问题仍待解决。为了进一步了解特定基因的调控方式，需要一种能够通过下调或上调目的基因和/或其靶基因来操控少量细胞，并追踪这些细胞在发育过程中命运的技术体系。在体电穿孔技术可用于递送shRNA、目的基因的cDNA或Cre重组酶，从而实现上述目标。为确保目的DNA或小RNA的表达，应使用表达质粒进行电穿孔。该方法在研究大脑皮层发育中已得到成功应用9,10，但由于海马结构位于脑组织较深层，研究齿状回发育时该技术的实施更具挑战性。

子宫外 电穿孔结合脑片组织培养是解决这一问题的一种方法11,12与……相比，截然不同 在子宫内 电穿孔仅针对胚胎头部而非整个胚胎，从而能够以更理想的方式放置电极，将shRNA/DNA定向导入海马体和齿状回。本课题组已成功采用该方法 子宫外 电穿孔法研究转录因子 Bcl11b 在齿状回发育过程中的作用8Bcl11b 通过调控前体细胞的增殖和分化，在齿状回发育中发挥双重作用，这一点已通过免疫组织化学得到证实。为了进一步阐明 Bcl11b 参与这些过程的机制，Polleux 实验室的方案11,12 根据方案部分下文所述，调整以研究齿状回。第一种方法旨在探讨Bcl11b是否以细胞自主方式调控神经元细胞分化。第二种方法则考察Bcl11b的直接靶基因Desmoplakin是否足以挽救Bcl11b的表型。

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方案

注意：所有动物实验均依照德国法律进行，并已获得图宾根市政府部门的批准。

1. 微量移液器、溶液和膜的制备

  1. 玻璃微电极的制备
    1. 使用微电极拉制仪，按照以下程序拉制玻璃微电极：加热温度：540，拉力：125，速度：20，延迟：140。针尖长度约为5.5 cm。
    2. 使用微磨机对针尖进行斜面打磨，获得约4 mm的合适尖端尺寸。将微电极存放于盒子或15 cm的培养皿中，以防止尖端受损。
  2. 溶液的配制
    1. 质粒DNA溶液
      1. 根据制造商提供的操作说明，使用无内毒素大提试剂盒制备含有目标cDNA构建体的质粒DNA。
      2. 将质粒DNA溶液用无内毒素的Tris-EDTA缓冲液调整至终浓度为3 µg/µl（不加GFP spike载体）或4 µg/µl（加入1 µg GFP spike载体），并加入Fast Green染料至终浓度为0.05%。
    2. 层粘连蛋白储存液
      1. 将1 mg层粘连蛋白溶于无菌水中，定容至1 ml。分装为100 µl每份，于-80 °C保存。
    3. 聚-L-赖氨酸储存液
      1. 将50 mg聚-L-赖氨酸溶于50 ml无菌水中，配制成终浓度为1 mg/ml的溶液。分装为1 ml每份，于-20 °C保存。
    4. 完全汉克平衡盐溶液（Complete HBSS）
      1. 将100 ml 10x HBSS、2.5 ml 1 M HEPES缓冲液（pH 7.4）、30 ml 1 M D-葡萄糖、10 ml 100 mM CaCl2、10 ml 100 mM MgSO4 和4 ml 1 M NaHCO3 混合，加无菌水至终体积1 L，4 °C保存。
        注：除1 M HEPES缓冲液和1 M D-葡萄糖需过滤除菌外，其余溶液均需高压灭菌。
    5. 脑片培养基
      1. 将35 ml基础Eagle培养基（BME）、12.9 ml完全HBSS（1.2.4）、1.35 ml 1 M D-葡萄糖、250 µl 200 mM L-谷氨酰胺和500 µl青霉素-链霉素混合，定容至50 ml。加入马血清至终浓度5%，4 °C保存。
    6. 低熔点（LMP）琼脂糖
      1. 将2 g低熔点琼脂糖加入50 ml完全HBSS（1.2.4）中，高火微波加热1–2分钟至完全溶解。将溶液置于37–39 °C水浴中保温。使用后可于4 °C保存并重复使用。
    7. 多聚甲醛溶液
      1. 在通风橱中，将4 g多聚甲醛加入100 ml 1x PBS中，加热至60 °C，并逐滴加入1 N NaOH数滴，直至溶液变澄清。
    8. 通透化溶液
      1. 将9 g BSA溶于含0.3% Triton X-100的300 ml 1x PBS中，4 °C保存。长期保存时可加入10%叠氮化钠。
  3. 膜插件的包被
    1. 将一份层粘连蛋白储存液（1.2.2）和一份聚-L-赖氨酸储存液（1.2.3）用无菌水稀释至终体积12 ml。
    2. 将膜插件放入6孔板中，每孔加入2 ml无菌水。在膜表面加入1 ml包被液，于37 °C、5% CO2培养箱中过夜孵育。
    3. 孵育后，用1 ml无菌水洗涤膜插件三次，晾干。包被后的膜插件应于当日使用，或在干燥的6孔板中4 °C保存，最长可保存四周。

2. E15.5 和 E18.5 胚胎的 DNA 注射与电穿孔

  1. 将妊娠期配对的雌性小鼠放入充满5%异氟烷并与麻醉蒸发器相连的麻醉室中，以进行麻醉。以1 L/min的流速通入异氟烷和氧气。将动物置于麻醉室中2-4分钟，或直至其失去意识，可通过轻捏小鼠足垫间皮肤来检测是否已无痛觉反应。
  2. 在胚胎发育第15.5天（E15.5）或第18.5天（E18.5）通过颈椎脱位法处死已麻醉的小鼠。解剖取出含有胚胎的子宫13，并将其置于含有15-20 ml冷的完全HBSS的培养皿中。
    注意：从此步骤开始，所有胚胎及组织均需保持在冰上操作。
  3. 使用剪刀将每个胚胎从子宫角分离，并转移至第二个含有冷的完全HBSS的培养皿中。
  4. 在解剖显微镜下，使用精细镊子（#55）和剪刀切断子宫肌层和胎盘组织，小心地将胚胎从卵黄囊中释放出来。
  5. 使用Bonn剪刀在前肢稍上方以60°角将胚胎头部剪下。若实验需要对胚胎进行基因分型，可采集一小段尾部组织用于基因组DNA提取。
  6. 将头部转移至一个洁净干燥的培养皿中。由于头部是以60°角剪下的，当将其背侧朝上放置时，头部应自然向一侧倾斜。
  7. 将一根细针小心插入大脑半球中部靠近前囟的位置（图1A，B）。踩下Picospritzer III的脚踏开关，以每脉冲10-15毫秒、压力30磅的条件注射约2-3 µl（浓度为3或4 µg/µl）的DNA溶液，共施加5-8次脉冲。脉冲持续时间和次数取决于针尖开口直径，开口越小所需时间越长。每次脉冲之间的间隔为1秒。
  8. 在放置电极前，先在胚胎头部滴加数滴完全HBSS。将电极放置成“负极”位于注射侧脑室同侧，“正极”位于对侧、即胚胎头部耳部下方的位置（图1C，D）。施加5次、每次50 V的电脉冲。
    1. E15.5阶段使用3 mm电极，E18.5阶段使用5 mm电极。

3. 脑组织的解剖

  1. 电穿孔后，用精细镊子辅助剥离头部皮肤。使用弹簧剪在颅骨中线处的小脑中部做一小切口。
  2. 将弹簧剪插入切口，沿矢状缝纵向剪开。用精细镊子剥离颅骨，并将脑组织从颅骨中分离。将完整脑组织转移至15–20 ml冰冷的完全HBSS溶液中。
  3. 同时，将保持在37–39 °C水浴中的4%低熔点琼脂糖倒入可剥离模具中。
  4. 用小刮铲将脑组织从完全HBSS中取出，并用精细滤纸或Kimwipes吸去多余的HBSS。
  5. 轻柔地将整个脑组织放入琼脂糖中，并用细针调整其位置。将模具置于冰上，直至琼脂糖完全凝固并准备进行切片（冠状切片时嗅球朝上）。

4. 振动切片与脑片培养

  1. 修剪低熔点琼脂糖块，并使用“超级胶水”将其粘附到样品台上。待胶水干燥后，将样品台转移至振动切片机的缓冲槽中，并加入冰浴的完全HBSS溶液，直至完全浸没琼脂糖块。
    注意：切片前需用70%乙醇对所有器械和设备表面进行灭菌。
  2. 使用新刀片制备250 µm厚的振动切片，步骤如下：
    1. 以以下参数修整琼脂糖块：频率 – 60 Hz，振幅 – 0.7 µm，速度 16–18 mm/sec。在较低速度（9 mm/sec）下，使用上述参数切割含有目标组织的切片。从后脑开始切片，收集5–7片大脑皮层切片。
    2. 借助弯头刮勺将切片转移至含有5 ml冰浴完全HBSS的洁净6孔培养板中，并置于冰上保存，直至所有切片收集完毕（图1E）。
  3. 在将切片放置于膜上之前，先以100 µl完全HBSS以十字交叉方式润湿膜表面，以利于切片的定位。
  4. 使用弯头刮勺将切片转移至膜上（用镊子夹住切片一角，将其拉至刮勺上，再用镊子将切片推至膜上）。每张膜上最多放置五片切片，并用镊子进行排列（图1F）。切片之间不得重叠。
    1. 使用移液器吸除膜上多余的HBSS。此处使用的特定膜固定于支架上，并插入组织培养板中，使组织与培养基接触但不被液体覆盖。
  5. 将膜插件放入含有1.8 ml脑片培养基（1.2.5）的6孔板中（图1G、H）。将培养板置于37 °C、5% CO2条件下培养11天或14天（DIV）。每隔两天更换一半培养基（0.9 ml）。
    注意：在此阶段，可在培养开始的前20小时向培养基中添加Bromodeoxyuridine（BrdU；终浓度10 µM）等试剂，用于标记增殖细胞。

5. 切片固定后进行免疫荧光染色

  1. 根据切片的方向，使用洁净且锋利的手术刀片切割并修整膜。
  2. 将切片连同膜一起转移至含有1 ml 4% PFA（1.2.7）的24孔板中。室温孵育1小时，随后用1×PBS洗涤3次，每次15分钟。在4 °C下用通透液轻柔振荡孵育过夜（O/N）。
  3. 次日，将切片与适当的一抗在通透液中稀释后，在4 °C下轻柔振荡孵育过夜（O/N）或孵育48小时。
  4. 用1×PBS洗涤切片3次，每次15分钟，然后在4 °C下用适当稀释于通透液中的二抗孵育过夜（O/N）。
  5. 与二抗孵育后，用1×PBS洗涤切片一次，持续15分钟，随后进行DAPI染色10分钟。
  6. 用1×PBS洗涤切片3次，每次15分钟，然后转移至显微镜载玻片上。加入ImmunoMount封片剂，并轻轻将盖玻片置于切片上。在4 °C下过夜干燥，并用指甲油封片。
    注意：载玻片应始终保存在4 °C。
    1. 通过共聚焦显微镜分析切片培养物（图1I）。

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结果

转录因子 Bcl11b 的缺失会导致前体细胞增殖和神经元分化受损，从而引起齿状回体积减小和细胞数量减少。此外，突变神经元无法整合到海马神经环路中，导致学习和记忆能力受损8。为探究 Bcl11b 在这些过程中所涉及的调控机制，采用了子宫外电穿孔技术（ex utero electroporation）。

为了探究Bcl11b是否以细胞自主性方式调控神经元细胞分化，通过在E15.5时将GFP-Cre重组酶构建体或单独的GFP质粒经体外（ex utero）电穿孔导入Bcl11bflox/flox小鼠海马组织，随后进行长达电穿孔后18天的器官型脑片培养，从而在组织中产生Bcl11b的嵌合性缺失11（图2A、B；该图已根据文献8修改）。为确定Bcl11b是否以细胞自主性方式调控颗粒细胞的分化，使用特异性识别NeuroD及GFP的抗体进行了免疫荧光染色。NeuroD在有丝分裂阶段2b/3期...

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讨论

海马体在学习和记忆中具有重要功能。齿状回是成年期仍持续发生神经发生的两个脑区之一，另一个为侧脑室下区。出生后及成年期的海马神经发生过程相似，均涉及多种共同因子。明确这些因子的调控机制，将有助于理解神经退行性疾病，进而推动新疗法和预防措施的开发。要获得此类信息，需要一种能够在原位环境中对单个细胞进行操控并观察的系统，正如所展示的那样 子宫外 电穿孔结合脑片器官型培养

ex utero 电穿孔技术最初成功应用于皮层发育的研究11,16。据我们所知，探讨 Bcl11b 在海马发育中作用的研究是首次描述将 DNA 通过 ex utero 电穿孔技术导入齿状回组织的方法8。本实验方案基于 Polleux 团队研究皮层发育所发表的方法11,12。为了成功将该方法应用于齿状回的研究，必须对电极的大小和位置进行调整。将负极置于靠近注射部位的皮层区域，正极置于对侧耳下方，从而改变电穿孔的极性，成功将 DNA 导入齿状回细胞中。正确放置电极并施加 0.06 至 0.08 mA 的电流...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本研究由德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft）向 SB 提供的资助（BR-2215；SFB 497/A9）支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Flaming/Brown 微量移液器拉制仪Sutter Instruments Company (USA)P-97
精细玻璃移液管Warner InstrumentsG100F-4
微电极研磨仪Narishige, JapanEG-44
麻醉支架装置Harvard ApparatusPY2 34-0412
Halovet 蒸发麻醉器Harvard ApparatusPY2 34-0398
Fluovac 麻醉系统Harvard ApparatusPY2 34-0387
IMS Fluosorber 气体吸附装置Harvard ApparatusPY2 34-0415
麻醉诱导室Harvard ApparatusPY2 34-0460
电穿孔仪BEX CompanyCUY21 EDIT
带盘状电极的镊子BEX CompanyLF650P3适用于 E15.5 的 3 mm 电极
带盘状电极的镊子BEX CompanyLF650P5适用于 E18.5 的 5 mm 电极
Picospritzer III 微量压力注射仪Parker Hannifin CorporationP/N 052-0500-900
HM 650 V 振动切片机，230 VThermo Scientific920120
解剖显微镜Carl Zeiss Microscopy GmbhStemi SV8
倒置显微镜LeicaLeica DM IL LED
共聚焦显微镜LeicaSp5II
6 孔板BD Falcon#353502
6 孔板CELLSTAR#657160
组织培养小室BD Falcon#353090
快绿染料SigmaF7252
层粘连蛋白Sigma#L2020
聚-L-赖氨酸Sigma#P5899
弹簧剪Fine Science Tools15003-08
超精细邦氏剪Fine Science Tools14084-08
镊子Dumont #5511255-20 Inox
HBSS 10 倍浓缩液Life Technology14180-046
BMELife Technology41010-26

参考文献

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  13. Shea, K., Geijsen, N. Dissection of 6.5 dpc mouse embryos. J Vis Exp. (2), (2007).
  14. Sugiyama, T., Osumi, N., Katsuyama, Y. The germinal matrices in the developing dentate gyrus are composed of neuronal progenitors at distinct differentiation stages. Dev Dyn. 242, 1442-1453 (2013).
  15. Lechler, T., Fuchs, E. Desmoplakin: an unexpected regulator of microtubule organization in the epidermis. J Cell Biol. 176, 147-154 (2007).
  16. Nichols, A. J., O'Dell, R. S., Powrozek, T. A., Olson, E. C. Ex utero electroporation and whole hemisphere explants: a simple experimental method for studies of early cortical development. J Vis Exp. (74), (2013).

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