正向遗传学是一种用于鉴定胞内病原体中对细胞自主免疫具有抗性的重要基因的强大方法。本方法利用先天免疫细胞,特别是巨噬细胞,来鉴定在免疫逃逸中起重要作用的新型Toxoplasma gondii基因。
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正向遗传学是一种用于鉴定胞内病原体中对细胞自主免疫具有抗性的重要基因的强大方法。本方法利用先天免疫细胞,特别是巨噬细胞,来鉴定在免疫逃逸中起重要作用的新型Toxoplasma gondii基因。
Toxoplasma gondii 是弓形虫病的病原体,为一种专性细胞内寄生的原虫病原体。该寄生虫几乎可在任何温血脊椎动物的细胞类型中入侵并复制。在寄生虫侵入宿主细胞的过程中,会形成一个起源于宿主细胞膜的寄生泡(PV),该过程独立于吞噬作用,寄生虫在其中进行复制。尽管依赖干扰素(IFN)的先天免疫和细胞介导免疫对于最终控制感染至关重要,但先天免疫细胞(包括中性粒细胞、单核细胞和树突状细胞)在感染早期也可作为寄生虫系统性播散的载体。本文描述了一种利用宿主先天免疫反应(此处为巨噬细胞)进行正向遗传筛选的方法,旨在鉴定在巨噬细胞激活后于感染巨噬细胞中存在适应性缺陷、但在未激活巨噬细胞中入侵和复制能力正常的寄生虫突变体。因此,该筛选方法可分离出在抵抗巨噬细胞激活效应能力方面存在特异性缺陷的寄生虫突变体。文章描述了感染巨噬细胞激活后突变寄生虫的两种广泛表型:寄生虫停滞生长与寄生虫降解,后者常发生于形态不规则的空泡中。随后对这些寄生虫突变体进行分析,以鉴定出对抵抗细胞自主免疫诱导介质特别重要的相关寄生虫基因。本文提出了一种通用的正向遗传筛选策略,理论上可经修改用于靶向筛选对特定抗菌介质具有抗性的重要寄生虫基因。同时,还描述了一种评估寄生虫突变体所易感的特定巨噬细胞抗菌介质的方法。感染巨噬细胞的激活还可促进寄生虫由速殖子向缓殖子阶段的转化,从而维持慢性感染。因此,本文提供了评估所鉴定寄生虫基因在建立慢性感染中重要性的方法学。
刚地弓形虫(T. gondii) 是一种专性胞内寄生的原虫病原体,可引起弓形虫病,在免疫功能低下个体中构成健康威胁。它也是研究其他感染人类的顶复门病原体的模式系统,包括 隐孢子虫与环孢子虫弓形虫病最常通过摄入被寄生虫缓殖子或卵囊阶段污染的食物或水而获得。摄入后,这些阶段会转化为速殖子阶段,速殖子在宿主细胞内复制并进行系统性播散。T细胞和IFN-γ 以及较少量的一氧化氮 1-4对于控制感染至关重要,但无法彻底清除疾病,因为部分速殖子会转化为缓殖子阶段,并被保护在组织包囊内,从而导致长期的慢性感染。事实上,目前尚无对疾病慢性包囊阶段有效的治疗药物。严重的弓形虫病通常是由于持续性感染重新激活所致,此时寄生虫的缓殖子阶段会重新转化为快速增殖的速殖子阶段,表现出原发性和急性感染的特征。
在先天免疫反应面前实现早期存活,对于使寄生虫达到足够的数量并扩散至远端部位以建立慢性感染至关重要。 T. gondii 已进化出多种策略以对抗宿主防御机制,这些策略可能有助于其在感染早期进行复制和播散。首先, T. gondii 在寄生虫侵入过程中形成一种独特的寄生泡(PV),与其它胞内病原体相比,该寄生泡在很大程度上与宿主细胞的内吞和外排过程相分离 5-9同样,与其他成功入侵细胞内的病原体一样 T. gondii 通过改变宿主细胞的转录因子(包括在调控细胞活化中起重要作用的转录因子),对宿主细胞基因表达进行重编程,从而修饰宿主细胞以创造利于自身生长的环境 10-15ROP16 16-19GRA15 20,GRA16 21 和GRA24 22 已被证明在调控感染宿主细胞的转录反应和细胞信号级联中具有重要作用 T. gondii最近利用具有不同表型的寄生虫株系进行遗传杂交的研究已成功鉴定了多种寄生虫基因,这些基因是寄生虫基因型依赖性性状的基础,包括逃避与免疫相关的GTP酶(IRGs) 16,19,23-26在小鼠中,免疫相关GTP酶(IRGs)对于控制弓形虫II型和III型基因型至关重要,而毒力极强的I型基因型已进化出逃逸小鼠IRGs的机制。然而,显然弓形虫还进化出了除IRGs以外逃逸其他抗菌介质的机制,其中部分机制可能在不同弓形虫基因型间保守存在。 27,28此外,关于细胞自主免疫中抵抗病原体的关键效应分子,目前所知甚少。 T. gondii 在人类弓形虫病期间,对细胞自主性免疫效应分子具有抗性的寄生虫基因,可能在速殖子向缓殖子转化过程中也具有重要作用,而该转化过程亦可由宿主免疫反应所触发。例如,高水平的一氧化氮可抑制感染性巨噬细胞中寄生虫的增殖,同时也可促进速殖子向缓殖子转化,从而诱导包囊形成30-32.
T. gondii 的功能性基因组数据库 ToxoDB 是该领域的重要资源,可提供寄生虫基因组的序列信息,并支持访问已发表和未发表的基因组规模数据,包括群体注释、基因表达和蛋白质组学数据33。与许多原生动物病原体类似,其基因组的大部分由假定基因组成,这些基因缺乏基于同源性的信息,因而难以推断其潜在功能。因此,正向遗传学是一种强大的工具,可用于鉴定在免疫逃逸、包囊转化以及其他对寄生虫致病性和不同发育阶段转换至关重要的新基因。正向遗传学的另一优势在于,它可作为一种相对无偏倚的方法,用于探究在致病过程中(包括免疫逃逸和包囊形成)发挥重要作用的寄生虫基因。近年来,突变谱分析的高通量测序技术不断改进,使其成为利用化学诱变和插入诱变进行正向遗传学研究中鉴定相关寄生虫基因的首选方法34-37。
识别弓形虫的脆弱环节至关重要 T. gondii 可被利用来增强针对该寄生虫的细胞自主免疫机制的有效性,特别是那些可能对耐药的包囊阶段也具有活性的机制。为实现这一目标,一种 体外 小鼠巨噬细胞感染与激活模型被用于鉴定那些特异性损害 T. gondii 感染巨噬细胞激活后的适应性缺陷,但在未激活巨噬细胞中无此缺陷。该巨噬细胞筛选方法被用于分析一个突变体文库 T. gondii 插入突变体以最终鉴定 T. gondii 对一氧化氮抵抗至关重要的基因 27,28一组突变体的分离 T. gondii 对感染巨噬细胞活化抵抗能力受损的突变体,尤其是对一氧化氮表现出显著敏感性的突变体,证实了该筛选方法在鉴定寄生虫基因方面的实用性,这些基因对于抵抗细胞自主性免疫介质(除小鼠IRG蛋白介导的已知抵抗机制之外)具有重要作用 28插入突变相较于化学诱变具有若干优势,例如可在每个寄生虫克隆中产生数量有限的随机突变,且理论上更易于确定突变位点。然而,鉴定质粒插入寄生虫基因组的具体位置仍具有挑战性。 T. gondii 插入突变体在实际操作中,许多情况下出人意料地难以实现 37将质粒插入基因也可能破坏基因功能,这与化学诱变通常仅导致单核苷酸改变的情况不同。然而,与插入诱变相比,使用N-乙基-N-亚硝基脲(ENU)或乙基甲磺酸(EMS)进行化学诱变可能更有利于分析更大范围的寄生虫基因组,因为它在每个突变体中可产生多个单核苷酸多态性(估计为10–100个)34,38此外,全基因组分析技术的最新进展使得利用下一代测序技术鉴定突变寄生虫表型最可能相关的候选基因成为可能。 34,38无论采用何种诱变方法,最终都需要通过基因敲除和互补实验来验证该寄生虫基因在抵抗巨噬细胞激活中的作用,以满足分子柯赫氏法则的要求。
通过遗传学手段对寄生虫和巨噬细胞进行基因操作,以解析基因功能,这一点至关重要,因为许多通过正向遗传学在T. gondii以及其他病原体中鉴定出的基因仍被归类为假想基因,其序列与其他已知功能蛋白几乎没有或完全没有同源性。本文概述了一种通用方法,可用于确定突变体中被破坏的基因是否对已知或未知的细胞自主免疫介质具有抵抗作用。对宿主抗菌因子的初步分析,是通过评估野生型和突变型寄生虫在野生型小鼠巨噬细胞与特定基因敲除小鼠巨噬细胞中的存活情况来进行的,这些基因敲除包括诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、gp-91 phox(NADPH氧化酶)以及特定的免疫相关GTP酶(IRGs)。该分析可判断所鉴定的寄生虫基因是否分别对一氧化氮、活性氧中间产物或免疫相关GTP酶的抵抗具有重要作用,或是否涉及未知的免疫机制28。如本实验方案所述,使用IFN-γ和LPS共同激活感染的巨噬细胞,主要可筛选出对一氧化氮抵抗具有重要作用的寄生虫基因28。使用在不激活巨噬细胞条件下即可诱导一氧化氮产生的药理学试剂(一氧化氮供体)进一步证实,所鉴定的大多数基因主要参与对一氧化氮本身的抵抗,而非一氧化氮与其他伴随巨噬细胞激活产生的介质协同作用下的抵抗28。
第一步和第二步描述了一项正向遗传学筛选方法,旨在分离在感染骨髓来源巨噬细胞激活后具有适应性缺陷的寄生虫突变体 体外第一步描述了通过剂量滴定分析,以经验性确定IFN的剂量 γ 以及用于巨噬细胞激活的LPS,以减少寄生虫复制,但不会完全抑制野生型寄生虫的复制 T. gondii 用于构建寄生虫突变体文库的亲本菌株。第二步描述在96孔板中对突变克隆进行巨噬细胞内的正向遗传筛选。第三步概述一种方法,用于确认在96孔板筛选中鉴定出的每个突变体的表型,并评估各突变体的缺陷是否影响寄生虫在巨噬细胞激活后的存活、增殖或包囊形成。第四步描述利用特定抗菌通路基因敲除小鼠来源的骨髓衍生巨噬细胞,鉴定该寄生虫突变体特异性敏感的免疫效应分子。第五步概述一种方法,用于确定该寄生虫突变体是否在 在体内 通过检测感染小鼠脑内包囊的产生来评估致病性。
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注意:所有涉及动物使用的实验方案均严格遵循纽约医学院动物护理与使用委员会制定的指南和规定。
注意:本文引用了化学诱变38、通过有限稀释法分离寄生虫38、从小鼠骨髓分离巨噬细胞39、在人包皮成纤维细胞(HFF)中培养T. gondii、在巨噬细胞中形成包囊以及基本免疫荧光分析(IFA)32的详细实验方案。所有细胞培养均在37 °C、5% CO2条件下,使用D10培养基(DMEM高糖培养基,添加10%胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺、100 U/ml青霉素和100 µg/ml链霉素)进行。在细胞分离和细胞培养过程中,所有试剂均须保持无菌状态。
1. IFN-γ 和 LPS 的剂量滴定,以确定在正向遗传学筛选中用于激活感染巨噬细胞的浓度
2. 分离在感染巨噬细胞激活后具有适应性缺陷的寄生虫突变体
注意:进行正向遗传学筛选需要一个随机突变的 T. gondii 突变体文库。可通过化学诱变(ENU/EMS)或插入诱变对 T. gondii 进行随机诱变27,28,38。诱变后,通过有限稀释法对寄生虫进行克隆,并在含有贴壁 HFF 细胞的 96 孔板中、200 µl D10 培养基内培养单个克隆32,38。用于显微镜筛选巨噬细胞内寄生虫的 96 孔板必须具有光学底,以实现显微观察。对染色后的 96 孔板进行相差和荧光显微镜观察时,需要配备长工作距离的倒置荧光显微镜,并配有 4、10、20 或 40X 物镜。4X 物镜有助于观察整个孔,但使用 20X 物镜可获得寄生虫更佳的分辨率。
3. 评估突变体,确定缺陷是否发生在感染巨噬细胞激活后寄生虫的存活或复制水平
4. 评估突变寄生虫对感染巨噬细胞活化的敏感性是否与已知的抗菌介质相关
5. 评估突变寄生虫的缺陷是否影响慢性感染
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Toxoplasma gondii 可在未经激活的巨噬细胞中自由复制,其倍增时间根据寄生虫株系的不同,介于 6–12 小时之间。图 1 展示了在未经激活与已激活的骨髓来源巨噬细胞中寄生虫的代表性图像。图 2 展示了在 HFF 宿主细胞中,每个寄生虫空泡(PV)分别含有 2、4、8、16 和 32 个寄生虫时的总体形态。在本实验方案中,允许寄生虫先进入未经激活的巨噬细胞并形成初始的寄生虫空泡(PV),随后向感染的巨噬细胞施加强效激活刺激物 LPS 和 IFN-γ。在此模型中,野生型寄生虫的复制速度减慢,但在激活后的约 24 小时内仍可继续复制;在此期间,巨噬细胞逐渐增强对寄生虫复制的抑制能力。该筛选实验的设计基于一种改良的竞争模型,即巨噬细胞强效激活所需时间与野生型寄生虫或寄生虫突变体在 PV 内持续复制时间之间的竞争。筛选的第一步是选择用于激活感染巨噬细胞的 LPS 与 IFN-γ 剂量。该剂量需通过实验确定,方法为评估在固定剂量 IFN-γ 与一系列 LPS 浓度组合下,或固定剂量 LPS 与一系列 IFN-γ 浓度组合下激活的巨噬细胞中寄生虫的复制...
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本方案提供了一种无偏倚的方法,通过激活小鼠骨髓来源的巨噬细胞并结合正向遗传学手段,分离出在抵抗感染巨噬细胞激活方面存在生存缺陷的 T. gondii 突变株。突变株在巨噬细胞激活后的表型通常可分为两大类:1)寄生虫形态完整,但在每个寄生泡(PV)中无法增殖至超过一个个体;2)寄生虫出现降解现象,可能存在于较大且形态不规则的寄生泡中。突变株在未激活的 naïve 巨噬细胞中表现出与野生型寄生虫相似的表型,这一事实证明该方案可特异性地用于鉴定那些抵抗巨噬细胞激活能力受损的突变株。建议在筛选过程中使用原代骨髓来源的巨噬细胞,而非 RAW 264.7 巨噬细胞系,因为在骨髓来源的巨噬细胞中,寄生虫的形态及每个空泡内的寄生虫数量更易于观察。
所述筛选方法结合正向遗传学,为解析寄生虫基因及最终揭示对细胞自主免疫特定介质抵抗至关重要的遗传通路提供了多功能工具。此类正向遗传学研究对于鉴定寄生虫基因具有重要意义,这些基因可作为线索,用于逐步解析在体外及致病过程中抵抗特定抗菌介质的重要寄生虫通路。T. gondii 中既往正向遗传学方法面临的主要困难在于确定每个突变...
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作者无竞争性财务利益。
特别感谢 Peter Bradley 博士提供用于检测 T. gondii 线粒体的抗体。本研究工作由美国国立卫生研究院资助,项目编号 AI072028 和 AI107431,授予 D.G.M.,并获得纽约医学院热带医学研究捐赠基金的慷慨支持。
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