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使用巨噬细胞进行正向遗传学筛选，以鉴定在抵抗干扰素-γ依赖性细胞自主免疫中起重要作用的Toxoplasma gondii基因

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DOI：

10.3791/52556

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2015年3月12日

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1Department of Microbiology and Immunology, New York Medical College

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

正向遗传学是一种用于鉴定胞内病原体中对细胞自主免疫具有抗性的重要基因的强大方法。本方法利用先天免疫细胞，特别是巨噬细胞，来鉴定在免疫逃逸中起重要作用的新型Toxoplasma gondii基因。

摘要

Toxoplasma gondii 是弓形虫病的病原体，为一种专性细胞内寄生的原虫病原体。该寄生虫几乎可在任何温血脊椎动物的细胞类型中入侵并复制。在寄生虫侵入宿主细胞的过程中，会形成一个起源于宿主细胞膜的寄生泡（PV），该过程独立于吞噬作用，寄生虫在其中进行复制。尽管依赖干扰素（IFN）的先天免疫和细胞介导免疫对于最终控制感染至关重要，但先天免疫细胞（包括中性粒细胞、单核细胞和树突状细胞）在感染早期也可作为寄生虫系统性播散的载体。本文描述了一种利用宿主先天免疫反应（此处为巨噬细胞）进行正向遗传筛选的方法，旨在鉴定在巨噬细胞激活后于感染巨噬细胞中存在适应性缺陷、但在未激活巨噬细胞中入侵和复制能力正常的寄生虫突变体。因此，该筛选方法可分离出在抵抗巨噬细胞激活效应能力方面存在特异性缺陷的寄生虫突变体。文章描述了感染巨噬细胞激活后突变寄生虫的两种广泛表型：寄生虫停滞生长与寄生虫降解，后者常发生于形态不规则的空泡中。随后对这些寄生虫突变体进行分析，以鉴定出对抵抗细胞自主免疫诱导介质特别重要的相关寄生虫基因。本文提出了一种通用的正向遗传筛选策略，理论上可经修改用于靶向筛选对特定抗菌介质具有抗性的重要寄生虫基因。同时，还描述了一种评估寄生虫突变体所易感的特定巨噬细胞抗菌介质的方法。感染巨噬细胞的激活还可促进寄生虫由速殖子向缓殖子阶段的转化，从而维持慢性感染。因此，本文提供了评估所鉴定寄生虫基因在建立慢性感染中重要性的方法学。

引言

刚地弓形虫（T. gondii） 是一种专性胞内寄生的原虫病原体，可引起弓形虫病，在免疫功能低下个体中构成健康威胁。它也是研究其他感染人类的顶复门病原体的模式系统，包括 隐孢子虫与环孢子虫弓形虫病最常通过摄入被寄生虫缓殖子或卵囊阶段污染的食物或水而获得。摄入后，这些阶段会转化为速殖子阶段，速殖子在宿主细胞内复制并进行系统性播散。T细胞和IFN-γ 以及较少量的一氧化氮 1-4对于控制感染至关重要，但无法彻底清除疾病，因为部分速殖子会转化为缓殖子阶段，并被保护在组织包囊内，从而导致长期的慢性感染。事实上，目前尚无对疾病慢性包囊阶段有效的治疗药物。严重的弓形虫病通常是由于持续性感染重新激活所致，此时寄生虫的缓殖子阶段会重新转化为快速增殖的速殖子阶段，表现出原发性和急性感染的特征。

在先天免疫反应面前实现早期存活，对于使寄生虫达到足够的数量并扩散至远端部位以建立慢性感染至关重要。 T. gondii 已进化出多种策略以对抗宿主防御机制，这些策略可能有助于其在感染早期进行复制和播散。首先， T. gondii 在寄生虫侵入过程中形成一种独特的寄生泡（PV），与其它胞内病原体相比，该寄生泡在很大程度上与宿主细胞的内吞和外排过程相分离 5-9同样，与其他成功入侵细胞内的病原体一样 T. gondii 通过改变宿主细胞的转录因子（包括在调控细胞活化....

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方案

注意：所有涉及动物使用的实验方案均严格遵循纽约医学院动物护理与使用委员会制定的指南和规定。
注意：本文引用了化学诱变38、通过有限稀释法分离寄生虫38、从小鼠骨髓分离巨噬细胞39、在人包皮成纤维细胞（HFF）中培养T. gondii、在巨噬细胞中形成包囊以及基本免疫荧光分析（IFA）32的详细实验方案。所有细胞培养均在37 °C、5% CO2条件下，使用D10培养基（DMEM高糖培养基，添加10%胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺、100 U/ml青霉素和100 µg/ml链霉素）进行。在细胞分离和细胞培养过程中，所有试剂均须保持无菌状态。

1. IFN-γ 和 LPS 的剂量滴定，以确定在正向遗传学筛选中用于激活感染巨噬细胞的浓度

  1. 培养小鼠骨髓来源巨噬细胞过夜 在八孔玻璃载片中以每3个浓度 × 105 细胞/毫升，在250 μ每孔加入 D10 培养基 1 升。使用从骨髓分离后 1 至 2 周的巨噬细胞。
    注意：购买的腔室载玻片带有促进生长的RS洗涤液。
  2. 使用血细胞计数板对从T25培养瓶中培养的人包皮成纤维细胞（HFF）收获的野生型寄生虫进行计数。将寄生虫重悬至浓度为5 × 10⁶个/mL。5 每毫升 D10 ....

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结果

Toxoplasma gondii 可在未经激活的巨噬细胞中自由复制，其倍增时间根据寄生虫株系的不同，介于 6–12 小时之间。图 1 展示了在未经激活与已激活的骨髓来源巨噬细胞中寄生虫的代表性图像。图 2 展示了在 HFF 宿主细胞中，每个寄生虫空泡（PV）分别含有 2、4、8、16 和 32 个寄生虫时的总体形态。在本实验方案中，允许寄生虫先进入未经激活的巨噬细胞并形成初始的寄生虫空泡（PV），随后向感染的巨噬细胞施加强效激活刺激物 LPS 和 IFN-γ。在此模型中，野生型寄生虫的复制速度减慢，但在激活后的约 24 小时内仍可继续复制；在此期间，巨噬细胞逐渐增强对寄生虫复制的抑制能力。该筛选实验的设计基于一种改良的竞争模型，即巨噬细胞强效激活所需时间与野生型寄生虫或寄生虫突变体在 PV 内持续复制时间之间的竞争。筛选的第一步是选择用于激活感染巨噬细胞的 LPS 与 IFN-γ 剂量。该剂量需通过实验确定，方法为评估在固定剂量 IFN-γ 与一系列 LPS 浓度组合下，或固定剂量 LPS 与一系列 IFN-γ 浓度组合下激活的巨噬细胞中寄生虫的复制.......

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讨论

本方案提供了一种无偏倚的方法，通过激活小鼠骨髓来源的巨噬细胞并结合正向遗传学手段，分离出在抵抗感染巨噬细胞激活方面存在生存缺陷的 T. gondii 突变株。突变株在巨噬细胞激活后的表型通常可分为两大类：1）寄生虫形态完整，但在每个寄生泡（PV）中无法增殖至超过一个个体；2）寄生虫出现降解现象，可能存在于较大且形态不规则的寄生泡中。突变株在未激活的 naïve 巨噬细胞中表现出与野生型寄生虫相似的表型，这一事实证明该方案可特异性地用于鉴定那些抵抗巨噬细胞激活能力受损的突变株。建议在筛选过程中使用原代骨髓来源的巨噬细胞，而非 RAW 264.7 巨噬细胞系，因为在骨髓来源的巨噬细胞中，寄生虫的形态及每个空泡内的寄生虫数量更易于观察。

所述筛选方法结合正向遗传学，为解析寄生虫基因及最终揭示对细胞自主免疫特定介质抵抗至关重要的遗传通路提供了多功能工具。此类正向遗传学研究对于鉴定寄生虫基因具有重要意义，这些基因可作为线索，用于逐步解析在体外及致病过程中抵抗特定抗菌介质的重要寄生虫通路。T. gondii 中既往正向遗传学方法面临的主要困难在于确定每个突变.......

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披露

作者无竞争性财务利益。

致谢

特别感谢 Peter Bradley 博士提供用于检测 T. gondii 线粒体的抗体。本研究工作由美国国立卫生研究院资助，项目编号 AI072028 和 AI107431，授予 D.G.M.，并获得纽约医学院热带医学研究捐赠基金的慷慨支持。

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弓形虫（Toxoplasma gondii）是弓形虫病的致病原，为一种专性胞内原虫病原体。该寄生虫可侵入并几乎在任何温血脊椎动物的细胞类型中进行复制。在寄生虫侵入宿主细胞过程中，其会形成一个起源于宿主细胞膜的寄生泡（PV），该过程独立于吞噬作用，寄生虫即在此泡内复制。尽管依赖干扰素的先天性免疫和细胞介导免疫对于最终控制感染至关重要，但先天免疫细胞（包括中性粒细胞、单核细胞和树突状细胞）在感染早期也可作为寄生虫系统性播散的载体。本文描述了一种利用宿主先天免疫反应（此处为巨噬细胞）的正向遗传学筛选方法，用于鉴定在激活的巨噬细胞中存在适应性缺陷、但在未激活的巨噬细胞中具有正常侵袭和复制能力的寄生虫突变体。因此，该筛选可分离出在抵抗巨噬细胞激活效应能力方面存在特异性缺陷的寄生虫突变体。文章描述了感染巨噬细胞激活后突变寄生虫的两种广泛表型：寄生虫停滞生长与寄生虫降解（常发生于无定形的空泡中）。随后对这些寄生虫突变体进行分析，以鉴定出对抵抗细胞自主免疫诱导介质特别重要的寄生虫基因。本文提出了一种正向遗传筛选的通用方法，理论上可经修改用于靶向筛选对特定抗菌介质具有抗性的重要寄生虫基因。同时，还描述了一种评估寄生虫突变体所易感的特异性巨噬细胞抗菌介质的方法。感染巨噬细胞的激活还可能促进寄生虫从速殖子阶段向缓殖子阶段的转化，从而维持慢性感染。因此，本文还提供了评估所鉴定寄生虫基因在建立慢性感染中重要性的方法。&hasPromo=0
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弓形虫（Toxoplasma gondii）是弓形虫病的致病原，为专性细胞内寄生的原生动物病原体。该寄生虫可侵入并几乎在任何温血脊椎动物的细胞类型中进行复制。在寄生虫侵入宿主细胞过程中，其会形成一个起源于宿主细胞膜的寄生泡（PV），该过程独立于吞噬作用，寄生虫即在此泡内进行复制。尽管依赖干扰素的先天免疫和细胞介导免疫对于最终控制感染至关重要，但先天免疫细胞（包括中性粒细胞、单核细胞和树突状细胞）在感染早期也可作为寄生虫系统性播散的载体。本文描述了一种利用宿主先天免疫反应（此处为巨噬细胞）的正向遗传筛选方法，用于鉴定在激活的巨噬细胞中存在适应性缺陷、但在未激活的巨噬细胞中具有正常侵袭和复制能力的寄生虫突变体。因此，该筛选可分离出在抵抗巨噬细胞激活效应能力方面存在特异性缺陷的寄生虫突变体。文章描述了感染巨噬细胞激活后突变寄生虫的两种广泛表型：寄生虫停滞生长与寄生虫降解（常发生于无定形的空泡中）。随后对这些寄生虫突变体进行分析，以鉴定出对抵抗细胞自主免疫诱导介质特别重要的寄生虫基因。本文提出了一种正向遗传筛选的通用方法，理论上可经修改用于靶向筛选对特定抗菌介质具有抗性的重要寄生虫基因。同时，还描述了一种评估寄生虫突变体所易感的特异性巨噬细胞抗菌介质的方法。感染巨噬细胞的激活还可能促进寄生虫从速殖子阶段向缓殖子阶段的转化，从而维持慢性感染。因此，本文还提供了评估所鉴定寄生虫基因在建立慢性感染中重要性的方法。&hasPromo=0
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参考文献

  1. Scharton-Kersten, T. M., Yap, G., Magram, J., Sher, A. Inducible nitric oxide is essential for host control of persistent but not acute infection with the intracellular pathogen Toxoplasma gondii. J Exp Med. 185 (7), 1261-1273 (1997).
  2. Schluter, D., et al.

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