一种基于水凝胶支架和纤维蛋白胶的方法在小鼠心肌梗死模型中递送治疗药物

摘要

本方案旨在通过使用水凝胶系统和基于纤维蛋白的胶水，克服干细胞治疗心肌梗死时细胞移植率低的局限性。采用该方法，可在心肌梗死后维持细胞与组织之间的接触，从而提高有益因子在损伤部位的治疗潜力。

摘要

小鼠心肌梗死（MI）模型在心血管疾病研究领域被广泛认可，并一直被用作在活体（in vivo）条件下初步验证治疗效果的标准方法¹。传统的标准操作方案已进一步优化，以尽量减少对实验动物的损伤。值得注意的是，胸肌层的分离采用逐层剥离而非直接切断的方式，开胸操作通过肋间入路进行，而非采用胸骨正中切开并折断肋骨的方式，从而保持了胸廓结构的完整性。通过这些改进，显著降低了动物整体的手术应激反应。

旨在减轻心肌梗死（MI）造成损伤的干细胞疗法多年来已展现出良好的前景，其优势在于具有促血管生成和抗凋亡作用。目前将细胞递送至心脏表面的常用方法通常包括将细胞注射到损伤部位附近、冠状动脉内或外周血流中^2-4。尽管已证实这些细胞能够趋向性归巢至受损心肌，但其在损伤部位的植入效率较低，导致大量细胞扩散进入血液循环，从而限制了治疗功能⁵。本文介绍了一种利用包裹细胞的水凝胶贴片克服上述障碍的操作方法。该贴片在手术前预先制备，并在左冠状动脉结扎后立即放置于受损心肌表面。为使贴片牢固附着，将生物相容性的外用纤维蛋白胶直接覆盖在贴片上方，使其自然干燥并与贴片及心脏表面紧密结合。该方法为应用精细的细胞包封治疗性结构提供了一种新颖的粘附策略。

引言

心肌梗死（MI）是指由于冠状动脉主要分支阻塞，导致血液无法供应至心脏某一区域。MI 所造成的损伤表现为存活心肌组织重塑为无功能的瘢痕组织，从而降低心脏、更具体而言是左心室正常搏动的能力。这导致每次心跳输送至全身的血量（即每搏输出量）以及每次心跳从心脏泵出的血量百分比（即射血分数⁶）下降。这些变化以及其他功能减退，会增加心脏其余部分维持足够功能的负担。这种增大的负担常会变得极为严重，进而引发第二次心肌梗死，该现象在约10%的个体中可见⁷。

尽管医疗技术已发展到能够治疗心肌梗死（MI）的急性期后果，但目前尚无技术能够阻止、减缓或逆转组织重塑带来的不利影响。干细胞疗法被视为实现此类治疗的一种可能途径，然而，尽管其具有良好的应用前景，干细胞在临床应用中尚未取得成功。一种解释其疗效不足的理论认为，无法确保有益细胞在梗死部位停留足够长的时间以产生有利效果⁵。已有研究表明，在直接注射至梗死部位的细胞中，仅有不超过24%的细胞在给药后1天内存活并保留在损伤部位²。解决细胞滞留问题的一个可能方向是开发可生物相容的水凝胶系统，用于包封细胞或治疗性药物，并将其递送至损伤部位。本方案选用的水凝胶为聚乙二醇二甲基丙烯酸酯（poly(ethylene glycol) dimethacrylate），因其此前已被用于细胞包封实验；但任何具备包封能力的水凝胶均可使用⁸。将补片直接递送至损伤部位，可确保细胞与组织在较长时间内保持接触，从而延长细胞向下方心肌组织提供有益因子的作用时间。

采用贴片方法的一个瓶颈在于将贴片牢固粘附于心脏表面的困难。许多研究团队已通过多种技术克服了这一问题，其中最普遍的方法是使用简单的缝合线将构建物固定在心脏表面^9,10。该方法在构建物由较硬材料制成的情况下已证明成功，但在水凝胶系统中尝试时则失败，原因在于贴片结构含水量高且质地脆弱。为克服这一问题，我们采用了一种模拟凝血化学过程的纤维蛋白胶外部粘合系统。纤维蛋白胶已在多种外科手术中广泛应用，包括硬脑膜撕裂、支气管瘘和角膜移植，显示出其作为伤口封闭剂具有良好的生物相容性^11-13。此外，纤维蛋白胶也用于多种心脏相关用途，如左心室破裂的外科治疗和冠状动脉旁路移植术，但其作为心脏贴片粘合剂的应用尚不常见^14-17。通过将凝血酶和纤维蛋白原进行简单配制，即可获得一种生物相容性良好的粘合剂，可直接施用于外部心脏贴片的表面，从而提供一种有效的粘附系统，确保贴片与心脏之间的稳定结合。

方案

该操作程序完全符合IACUC协议编号13302，并已获得动物资源部门的批准。

1. 仪器准备

1. 手术前对所有非一次性使用的器械进行高压灭菌，以确保无菌。
2. 对于在一次操作过程中需重复使用的器械，每次使用之间须用玻璃珠灭菌器进行灭菌。

2. 水凝胶制备

1. 在制备水凝胶构建体前至少24小时，解冻并接种干细胞。
2. 使用立体光刻装置（或类似仪器）在手术前一天制备补片，该装置已在先前的文献中详细描述^8,18。
3. 为制备水凝胶，首先生成所需补片的计算机辅助设计（CAD）模型，并将设计导出为立体光刻格式（STL）。
4. 通过将聚乙二醇二甲基丙烯酸酯（PEGDMA）溶解于无菌1×PBS中，配制20% w/v的预凝胶溶液。同时，将光引发剂1-[4-(2-羟基乙氧基)-苯基]-2-羟基-2-甲基-1-丙烷-1-酮溶解于DMSO中。将光引发剂加入PEGDMA溶液中，终浓度为0.5% w/v。在交联前立即加入100 µl所需密度的细胞。注意：建议细胞密度为2.0 × 10⁵–2.0 × 10⁶ 个细胞/ml 。
5. 将预凝胶溶液用移液器滴加至SLA平台中心的培养皿中，并运行SLA软件，加载先前上传的STL格式设计。
6. 从装置中取出补片，并将水凝胶置于含5%胎牛血清（FBS）、100 U/ml 青霉素和100 mg/ml 链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中过夜培养，以使细胞适应补片内的环境。

3. 动物准备与经口插管

1. 在实施操作前对每只小鼠进行评估，确保其健康状况良好，评估依据包括小鼠的理毛行为及其与笼内同伴的互动情况。注：雌性 8-10 周 使用了老龄C57BL/6J小鼠进行该操作，但也可使用任何年龄或其他品系的小鼠。
2. 将动物放入麻醉室，以1 L/min的氧气流速暴露于5%异氟烷中₂ 支持。通过夹捏脚趾反射监测麻醉水平。
3. 动物充分麻醉后，称重并置于插管架上。
4. 将光源对准动物的胸腔，用镊子牵拉喉部表面以暴露声带。小心地将20 G套管针引导至声带之间，并平稳插入气管。当导管连接至小动物呼吸机后，通过胸腔的机械运动判断插入是否正确。
5. 根据制造商的指南，按照动物的体重调整通气参数。
6. 插管后，将动物置于加热垫上，保持仰卧位，以防止低体温。确保加热垫温度不超过40 °C。必要时，在动物与加热垫之间放置屏障，以尽量降低烫伤风险。
7. 使用脱毛膏去除手术部位的毛发。采用聚维酮碘和75%乙醇交替擦拭3次，对术区进行消毒，以确保充分灭菌。铺无菌洞巾，仅暴露手术区域，并在眼睛上涂抹兽用眼膏，以防止手术过程中角膜干燥。

4. 手术操作

1. 动物开胸术在左侧进行，因此在胸骨左侧约1 cm处做一与胸骨等长的皮肤切口。
2. 使用镊子分两步将肌层与下方的肋骨分离。观察代表动物胸大肌的分界线。轻轻提起该肌肉，将其与下方的腹外斜肌分离并向内侧牵开。然后以相同方式将腹外斜肌与下方的肋骨分离，并向外侧牵开，从而清晰暴露第二、第三和第四肋骨。
3. 在第三与第四肋骨之间进行开胸。轻柔抬起第四肋骨，使用电灼器在第三与第四肋骨之间打开胸腔。放置牵开器以进一步扩大胸腔，暴露心脏。
4. 使用镊子刺破心脏薄层的心包膜。
5. 用8-0单丝尼龙缝线结扎左冠状动脉。缝线位置应位于心尖上方约4 mm处，正对左心耳下端的下方。结扎后，通过观察心室心肌的变白情况以及左心房体积增大，以确认缝线位置正确。

5. 贴片放置与粘合

1. 使用前将补片保持在 37 °C 和 5% CO₂ 条件下。
2. 使用平头刮铲轻轻提起补片，并将其轻柔地放置于心脏梗死部位的表面。
   注意：为防止补片从左心室滑脱，可使用刮铲或镊子尖端轻轻接触并固定补片。
3. 按 4:1 的比例混合纤维蛋白原与凝血酶以制备胶水。通过反复吹打混匀溶液，直至其开始变稠，通常在配制开始后 1 分钟内发生。
4. 当溶液黏度达到所需水平时，迅速将约 10 ml 转移至补片表面。注意：纤维蛋白胶的凝固时间很短，因此有效转移胶液的时间窗口较小。

6. 缝合

1. 使用6-0单丝尼龙缝线完成所有关闭缝合。
2. 用三到四针单独的间断缝合关闭肋骨层。
3. 在肋间层完全关闭前，将一根PE-10导管插入切口，以便在关闭完成后抽吸胸腔，恢复正常的胸膜腔内压力。
4. 用三到四针单独的间断缝合关闭胸肌层。
5. 用连续缝合封闭皮肤层。
6. 完全关闭后，将1.0 ml注射器连接到导管末端，用于抽吸胸腔。
7. 在切口部位涂抹组织粘合剂，以加强缝合部位。

7. 术后治疗

1. 给小鼠皮下注射布托啡诺（0.05–1.0 mg/kg）和卡洛芬（2.2 mg/kg），在冠状动脉结扎后立即给药，且至少在术后20分钟 复苏前给予两种药物，术后6-8小时给药一次，之后每日两次，持续最多三天，以控制疼痛和不适。
2. 持续监测动物直至其恢复意识，并在手术后前4小时内每小时监测一次。在手术当晚（术后2-4小时）进行第二次检查，给予第二剂镇痛药。
3. 手术后从第2天开始每天观察动物，直至动物状态稳定。

8. 心脏功能与组织学分析

1. 在手术后4周对小鼠进行超声心动图检查，以评估心肌梗死（MI）后的损伤程度。
2. 使用麻醉舱以4-5%异氟烷对小鼠进行诱导吸入麻醉，随后通过面罩维持2%异氟烷进行维持麻醉。
3. 使用脱毛膏清理成像区域，并利用小动物超声仪获取心脏搏动时的二维M型超声心动图扫描图像，记录相关功能参数。
4. 将小鼠置于二氧化碳安乐死舱内实施安乐死，随后取出心脏并置于10%福尔马林溶液中固定24小时。24小时后，将心脏转移至70%乙醇中，并于4 °C保存直至组织处理。
5. 对心脏组织进行处理，并将其包埋于石蜡块中。
6. 从心室区域开始，自心尖至心房方向连续切取5 mm厚的组织切片。
7. 按照标准操作流程，使用Masson三色染色法以及苏木精-伊红染色法对切片进行染色。

结果

在手术过程中，左冠状动脉结扎后，阻塞血管远端区域会出现明显的苍白，可据此进行识别。在打结前，可短暂收紧缝线以测试其位置是否恰当。此外，由于动脉阻塞几乎会立即导致左心房正常搏动能力下降，左心房将因血液回流而出现代偿性扩大。

早在心肌梗死后2天进行的M型超声心动图测量即显示左室壁运动停止，提示心肌已发生重构。根据数据进行的定性计算表明，梗死心脏的射血分数和每搏输出量均下降。实验结束时，当心脏被采集用于组织学分析，可明显观察到左心室扩张、左心室壁变薄，以及胶原沉积——后者标志着功能性心肌细胞已被瘢痕组织替代（图1）。

组织学分析中还可观察到由于施加纤维蛋白凝胶而存在的水凝胶结构（图2）。就我们的目的而言，该粘合系统必须具有足够的黏度，以实现精确的定位控制，并尽量减少向周围器官的扩散，但同时又需具备足够的可塑性，以免干扰心脏功能。我们进行了初步测试，以计算不同纤维蛋白原/凝血酶比例下的黏度、凝胶化时间及刚度，从而确定最符合我们需求的配比组合。体内分析...

讨论

通过这种小鼠心肌梗死（MI）模型的方法，我们建立了一种系统，可最大限度地减少其他小鼠MI技术常伴随的非心肌区域损伤。这些损伤包括气管切开术造成的伤害、肌肉层的切割以及为暴露胸腔而折断肋骨。我们认为，由于在手术过程中特别注意保护肋骨和肌肉层等主要结构的完整性，这些改进显著提升了整体手术效果。

需要注意的是，该技术存在一些局限性，其中最大的问题是耗时较长，导致一天内仅能完成8至10例完整的手术操作。为克服这一问题，可使用第二台呼吸机，从而允许同时对两只动物进行手术。此外，在进行开胸手术时，应避免损伤主要血管，例如肋间血管和胸廓内动脉。若手术区域靠近这些血管，应使用电凝器以防止动脉破裂导致大出血。

纤维蛋白胶因其能够快速促进血块形成，并具有递送和容纳间充质干细胞（MSCs）的潜力，已在实验室和临床环境中得到广泛应用^14-17,19。在本研究中，纤维蛋白胶作为一种生物相容性方法，用于将水性水凝胶结构...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
哈佛模型 687 小鼠呼吸机	哈佛仪器公司	55-0001
Inintech Biosciences LLC 干式玻璃珠灭菌器	菲舍尔科技公司	NC9531961
Leica MZ6 外科显微镜	Leica
电凝止血套装	Gemini	GEM 5917
精细镊子 - 0.4 mm 尖端，倾斜	精细科学工具公司	11063-07
Agricola 牵开器 - 3.5 cm 扩展宽度	精细科学工具公司	17005-04
弹簧剪刀 - 2.5 mm 刀片，直型	精细科学工具公司	15000-08
Castroviejo 持针器 - 带锁，碳化钨头，14 cm	精细科学工具公司	12565-14
虹膜剪刀 - 精细直型，10.5 cm	精细科学工具公司	14060-10
8-0 单股缝线	Ethicon	8730P
6-0 丝线缝线	Ethicon	639G
凝血酶	Sigma	T7009
纤维蛋白原	Sigma	F3879
Vetbond 组织粘合剂	3M	1469SB