一种基于水凝胶支架和纤维蛋白胶的方法在小鼠心肌梗死模型中递送治疗药物

摘要

本方案旨在通过使用水凝胶系统和基于纤维蛋白的胶水，克服干细胞治疗心肌梗死时细胞移植率低的局限性。采用该方法，可在心肌梗死后维持细胞与组织之间的接触，从而提高有益因子在损伤部位的治疗潜力。

摘要

小鼠心肌梗死（MI）模型在心血管疾病研究领域被广泛认可，并一直被用作在活体（in vivo）条件下初步验证治疗效果的标准方法¹。传统的标准操作方案已进一步优化，以尽量减少对实验动物的损伤。值得注意的是，胸肌层的分离采用逐层剥离而非直接切断的方式，开胸操作通过肋间入路进行，而非采用胸骨正中切开并折断肋骨的方式，从而保持了胸廓结构的完整性。通过这些改进，显著降低了动物整体的手术应激反应。

旨在减轻心肌梗死（MI）造成损伤的干细胞疗法多年来已展现出良好的前景，其优势在于具有促血管生成和抗凋亡作用。目前将细胞递送至心脏表面的常用方法通常包括将细胞注射到损伤部位附近、冠状动脉内或外周血流中^2-4。尽管已证实这些细胞能够趋向性归巢至受损心肌，但其在损伤部位的植入效率较低，导致大量细胞扩散进入血液循环，从而限制了治疗功能⁵。本文介绍了一种利用包裹细胞的水凝胶贴片克服上述障碍的操作方法。该贴片在手术前预先制备，并在左冠状动脉结扎后立即放置于受损心肌表面。为使贴片牢固附着，将生物相容性的外用纤维蛋白胶直接覆盖在贴片上方，使其自然干燥并与贴片及心脏表面紧密结合。该方法为应用精细的细胞包封治疗性结构提供了一种新颖的粘附策略。

引言

心肌梗死（MI）是指由于冠状动脉主要分支阻塞，导致血液无法供应至心脏某一区域。MI 所造成的损伤表现为存活心肌组织重塑为无功能的瘢痕组织，从而降低心脏、更具体而言是左心室正常搏动的能力。这导致每次心跳输送至全身的血量（即每搏输出量）以及每次心跳从心脏泵出的血量百分比（即射血分数⁶）下降。这些变化以及其他功能减退，会增加心脏其余部分维持足够功能的负担。这种增大的负担常会变得极为严重，进而引发第二次心肌梗死，该现象在约10%的个体中可见⁷。

尽管医疗技术已发展到能够治疗心肌梗死（MI）的急性期后果，但目前尚无技术能够阻止、减缓或逆转组织重塑带来的不利影响。干细胞疗法被视为实现此类治疗的一种可能途径，然而，尽管其具有良好的应用前景，干细胞在临床应用中尚未取得成功。一种解释其疗效不足的理论认为，无法确保有益细胞在梗死部位停留足够长的时间以产生有利效果⁵。已有研究表明，在直接注射至梗死部位的细胞中，仅有不超过24%的细胞在给药后1天内存活并保留在损伤部位²。解决细胞滞留问题的一个可能方向是开发可生物相容的水凝胶系统，用于包封细胞或治疗性药物，并将其递送至损伤部位。本方案选用的水凝胶为聚乙二醇二甲基丙烯酸酯（poly(ethylene glycol) dimethacrylate），因其此前已被用于细胞包封实验；但任何具备包封能力的水凝胶均可使用⁸。将补片直接递送至损伤部位，可确....

方案

该操作程序完全符合IACUC协议编号13302，并已获得动物资源部门的批准。

1. 仪器准备

1. 手术前对所有非一次性使用的器械进行高压灭菌，以确保无菌。
2. 对于在一次操作过程中需重复使用的器械，每次使用之间须用玻璃珠灭菌器进行灭菌。

2. 水凝胶制备

1. 在制备水凝胶构建体前至少24小时，解冻并接种干细胞。
2. 使用立体光刻装置（或类似仪器）在手术前一天制备补片，该装置已在先前的文献中详细描述^8,18。
3. 为制备水凝胶，首先生成所需补片的计算机辅助设计（CAD）模型，并将设计导出为立体光刻格式（STL）。
4. 通过将聚乙二醇二甲基丙烯酸酯（PEGDMA）溶解于无菌1×PBS中，配制20% w/v的预凝胶溶液。同时，将光引发剂1-[4-(2-羟基乙氧基)-苯基]-2-羟基-2-甲基-1-丙烷-1-酮溶解于DMSO中。将光引发剂加入PEGDMA溶液中，终浓度为0.5% w/v。在交联前立即加入100 µl所需密度的细胞。注意：建议细胞密度为2.0 × 10⁵–2.0 × 10⁶ 个细胞/ml 。
5. 将预凝胶溶液用移液器滴加至SLA平台中心的培养皿中，并运行SLA软件，加载先前上传的STL格式设计。
....

结果

在手术过程中，左冠状动脉结扎后，阻塞血管远端区域会出现明显的苍白，可据此进行识别。在打结前，可短暂收紧缝线以测试其位置是否恰当。此外，由于动脉阻塞几乎会立即导致左心房正常搏动能力下降，左心房将因血液回流而出现代偿性扩大。

早在心肌梗死后2天进行的M型超声心动图测量即显示左室壁运动停止，提示心肌已发生重构。根据数据进行的定性计算表明，梗死心脏的射血分数和每搏输出量均下降。实验结束时，当心脏被采集用于组织学分析，可明显观察到左心室扩张、左心室壁变薄，以及胶原沉积——后者标志着功能性心肌细胞已被瘢痕组织替代（图1）。

组织学分析中还可观察到由于施加纤维蛋白凝胶而存在的水凝胶结构（图2）。就我们的目的而言，该粘合系统必须具有足够的黏度，以实现精确的定位控制，并尽量减少向周围器官的扩散，但同时又需具备足够的可塑性，以免干扰心脏功能。我们进行了初步测试，以计算不同纤维蛋白原/凝血酶比例下的黏度、凝胶化时间及刚度，从而确定最符合我们需求的配比组合。体内分析.......

讨论

通过这种小鼠心肌梗死（MI）模型的方法，我们建立了一种系统，可最大限度地减少其他小鼠MI技术常伴随的非心肌区域损伤。这些损伤包括气管切开术造成的伤害、肌肉层的切割以及为暴露胸腔而折断肋骨。我们认为，由于在手术过程中特别注意保护肋骨和肌肉层等主要结构的完整性，这些改进显著提升了整体手术效果。

需要注意的是，该技术存在一些局限性，其中最大的问题是耗时较长，导致一天内仅能完成8至10例完整的手术操作。为克服这一问题，可使用第二台呼吸机，从而允许同时对两只动物进行手术。此外，在进行开胸手术时，应避免损伤主要血管，例如肋间血管和胸廓内动脉。若手术区域靠近这些血管，应使用电凝器以防止动脉破裂导致大出血。

纤维蛋白胶因其能够快速促进血块形成，并具有递送和容纳间充质干细胞（MSCs）的潜力，已在实验室和临床环境中得到广泛应用^14-17,19。在本研究中，纤维蛋白胶作为一种生物相容性方法，用于将水性水凝胶结构.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
哈佛模型 687 小鼠呼吸机	哈佛仪器公司	55-0001
Inintech Biosciences LLC 干式玻璃珠灭菌器	菲舍尔科技公司	NC9531961
Leica MZ6 外科显微镜	Leica
电凝止血套装	Gemini	GEM 5917
精细镊子 - 0.4 mm 尖端，倾斜	精细科学工具公司	11063-07
Agricola 牵开器 - 3.5 cm 扩展宽度	精细科学工具公司	17005-04
弹簧剪刀 - 2.5 mm 刀片，直型	精细科学工具公司	15000-08
Castroviejo 持针器 - 带锁，碳化钨头，14 cm	精细科学工具公司	12565-14
虹膜剪刀 - 精细直型，10.5 cm	精细科学工具公司	14060-10
8-0 单股缝线	Ethicon	8730P
6-0 丝线缝线	Ethicon	639G
凝血酶	Sigma	T7009
纤维蛋白原	Sigma	F3879
Vetbond 组织粘合剂	3M	1469SB