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方法文章

从人皮肤中分离淋巴细胞用于表型分析 离体 细胞培养

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DOI：

10.3791/52564

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2016年4月8日

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Medical Immunology, Department of Laboratory Medicine, Radboud University Medical Centre, 2Department of Dermatology, Radboud University Medical Centre

本文内容

摘要

我们介绍一种高效分离人皮肤活检组织中皮肤常驻T细胞的实验方案。该方案可获得足量的活人皮肤常驻淋巴细胞，用于流式细胞术分析。 离体 培养。

摘要

人体皮肤具有重要的屏障功能，并含有多种免疫细胞，有助于维持组织稳态以及抵御病原体。由于皮肤相对易于获取，因此为研究外周免疫调节机制提供了理想的平台。健康皮肤中的常驻免疫细胞可执行免疫监视功能，同时也在银屑病等炎症性皮肤病的发生发展中发挥重要作用。尽管相关研究不断进展，但目前对多种炎症性皮肤疾病背后生物学机制的理解仍然有限。迫切需要从皮肤活检样本中分离出高质量的（单个）细胞群体。迄今为止，细胞分离流程一直受到难以获得足够数量活细胞的限制。此外，由于现有解离方法在制备单细胞悬液过程中造成的机械和化学应激，导致免疫细胞谱系标志物的丢失，也影响了后续的分离与分析。本文介绍一种改进的方法，通过结合使用自动化组织解离仪进行机械解离与胶原酶处理，从健康人皮肤及银屑病受累皮肤中分离T细胞。该方法在制备单细胞悬液时，能够较好地保留大多数免疫谱系标志物的表达，如CD4、CD8、Foxp3和CD11c。文中展示了成功分离CD4+ T细胞并进行后续表型与功能分析的实例。

引言

皮肤作为机体与外界环境的主要界面，能够抵御外界物理、化学和生物侵害（如创伤、紫外线辐射和微生物），提供第一道防御屏障。皮肤主要由两个部分组成：表皮和真皮，其中包含多种免疫细胞，如朗格汉斯细胞、巨噬细胞、树突状细胞（DCs）以及约200亿个记忆T细胞，数量几乎是全身血液中记忆T细胞的两倍1,2。越来越多的研究数据表明，皮肤在组织稳态以及多种病理状态下均具有重要的免疫学功能。正常皮肤中定居的免疫细胞被认为参与免疫监视3，并已被证实参与银屑病等炎症性疾病的发病过程4。在银屑病皮损皮肤中，可观察到CD4+和CD8+ T细胞的浸润，且CD4与CD8的比例随疾病状态的不同而变化5。然而，由于现有技术仅能分离出少量细胞，这些细胞群体的研究仍较为困难。

目前从人皮肤中分离T细胞的常用技术结合了机械性皮肤解离与酶消化处理。人皮肤活检组织被充分剪碎后，用胰蛋白酶、胶原酶和/或EDTA等酶进行孵育6-8。考虑到皮肤是一种屏障组织，对张力和机械性解聚具有高度抗性，现有的T细胞分离方法所获得的细胞数量极少，且活细胞数目更低，这使得这些细胞群体的体外（ex vivo）培养十分困难且具有挑战性。

本文报道了一种改良的方法，通过结合使用自动化组织解离仪对健康及银屑病病变的人类皮肤进行机械解离（替代传统精细剪碎方法）以及胶原酶消化，从而分离皮肤中的淋巴细胞。制备单细胞悬液后，可观察到多种具有活性的免疫细胞亚群，包括树突状细胞（DCs）和T细胞。重要的是，细胞表面标志物CD3、CD4和CD8的表达得到了良好保留。所获得的细胞可直接用于离体（ex vivo）细胞培养或流式细胞术分析。该方案已成功应用于银屑病患者病变皮肤来源的单个皮肤活检组织（4 mm）的分析。结果显示，来自患者皮肤驻留的T细胞相比健康志愿者可产生更高水平的促炎性细胞因子，如IL-17和IFNγ9。

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方案

注意：健康个体的皮肤活检样本取自接受择期整形手术的个体腹部剩余皮肤，获取样本前已获得其用于科研的口头或书面知情同意。使用人体皮肤样本已获得荷兰奈梅亨拉德堡德大学医学中心和德国埃森大学人类研究医学伦理委员会批准，并符合其规定。

1. 人类皮肤单细胞悬液的制备（如需后续细胞培养，应在超净工作台中无菌操作）

  1. 准备细胞培养基：RPMI 1640 加青霉素/链霉素（终浓度分别为 100 单位/ml 和 100 µg/ml）、丙酮酸盐（0.02 mM）和 GlutaMAX（0.02 mM），不添加血清。
  2. 制备完全培养基：使用步骤 1.1 中制备的培养基，加入 10% 人混合血清（HPS）；储存于 4°C。使用前将培养基恢复至 20 °C ± 2。
  3. 使用 4 mm 圆形活检打孔器获取皮肤活检样本，并将其置于 RPMI1640 完全培养基中，可在 20 °C ± 2 下保存最多 4 小时 或在 4 °C 过夜保存。样本送达实验室后应尽快处理。
    注意：皮肤样本保存时间过长会影响细胞得率和细胞活力。
  4. 标记一个蓝色盖离心管，并向标记好的管中加入 5 ml 完全培养基。
  5. 向无菌 6 孔培养板的每个孔（共 3 个孔）中加入 2 ml 完全培养基。使用无菌工具将活检组织放入其中一个孔中，冲洗后转移至第二孔，重复此步骤一次，共完成三次冲洗。
  6. 将经过冲洗的皮肤活检组织转移至无菌培养皿中，在组织上方加入 100 µl 完全培养基，并使用一次性无菌不锈钢手术刀小心刮除皮下脂肪组织。
    注意：此步骤至关重要。
  7. 在无菌培养皿中将每块皮肤活检组织切成 4 个小片。将样本（每管最多可放入四块 4 mm 活检组织）转移至含有 5 ml 完全培养基的预装解离管中。
  8. 将管盖拧紧，并倒置固定在自动组织解离仪的套筒上。确保所有样本材料均位于转子区域。
  9. 启动解离程序，运行“program m_spleen _01”（由仪器内置存储器或配套程序卡提供的预设程序），以适当转速解离活检组织 56 秒。
  10. 处理完成后，将解离管从解离仪上取下，并确保所有解离后的材料均沉降至管底。
  11. 向解离管中加入 150 µl 胶原酶 I-A（80 mg/ml），在 37 °C 摇床水浴中孵育 60 分钟。再向解离管中加入 100 µl DNase I（5 MU/ml），充分混匀。
    注意：胶原酶浓度过高或孵育时间过长会影响细胞活力。
  12. 将解离管重新固定至自动组织解离仪的套筒上，再次运行“program m_ spleen _01”程序进行二次解离。
  13. 在 50 ml Falcon 管顶部放置一个 70 µm 尼龙细胞筛网。将解离后的样本通过该筛网过滤，以去除细胞团块和组织碎片。
  14. 用 5 ml 完全培养基冲洗筛网一次。在 20 °C ± 2 条件下，以 450 × g 离心 10 分钟，吸除上清液。
  15. 重复洗涤步骤一次。将细胞沉淀重悬于 300 µl 完全培养基中。单细胞悬液即可用于后续分析；可继续进行 ex vivo 细胞培养或流式细胞术分析。
  16. 如需进行胞内细胞因子染色，可在流式细胞术分析前，在 37 °C、5% CO2 培养箱中用 PMA（12.5 ng/ml）、离子霉素（500 ng/ml）和布雷菲德菌素 A（5 µg/ml）刺激细胞 4 小时 。 

2. 皮肤驻留T细胞的多克隆激活（离体 细胞培养

  1. 取100 µl单细胞悬液（按步骤1.15制备）加入至圆底96孔板中。
    注意：每份4 mm皮肤活检样本所获得的单细胞悬液可分装至96孔板的至少两个孔中。
  2. 每孔加入抗CD3/抗CD28单克隆抗体包被的微珠（每孔25,000个微珠）、重组人细胞因子rIL-2（终浓度25 U/ml）和rIL-1β（终浓度50 ng/ml）。
  3. 用标记清晰的板盖覆盖培养板，置于含5% CO2、100%湿度、37 °C的培养箱中孵育。当培养基颜色变为黄色时更换培养基。
    注意：自细胞培养第8天起可观察到清晰的细胞克隆。

3. 原代/培养的皮肤驻留性T细胞的流式细胞术分析

  1. 配制 FACS 缓冲液：PBS + 0.2% BSA。
  2. 将目标细胞转移至 V 型底 96 孔板中，在 20 °C ± 2 条件下以 450 × g 离心 2 分钟，吸除上清液。
  3. 用 100 µl PBS 重悬细胞沉淀，在 20 °C ± 2 条件下以 450 × g 离心 2 分钟，吸除上清液。
  4. 用 100 µl 预先配制的 eFluorescence780 标记的可固定活死染料（使用 PBS 按 1:1,000 稀释）在 4 °C 下避光染色 30 分钟；加入 100 µl FACS 缓冲液，在 20 °C ± 2 条件下以 450 × g 离心 2 分钟，吸除上清液。
  5. 选择所需细胞表面标志物单克隆抗体，例如：CD45-BV421（HI30，1:20）、CD3-ECD（UCHT1，1:50）、CD4-PC5.5（1388.2，1:200）、CD8-APC-AlexFluo700（B9.11，1:400）、CD14-FITC（TUK4，1:50）、CD19-APC-AlexFluo750（13-119，1:50）、CD56-PE（MEM-188，1:50）、CD25-PeCy7（BC96，1:50）、CD11c-PeCy7（BU15，1:10）和 CD1c-APC（AD5-8E7，1:10），根据各单抗的稀释比例使用 FACS 缓冲液配制抗体混合液。使用同型对照抗体与未染色样本共同设定设门参数。
  6. 向每孔中加入 25 µl 预先配制的抗体混合液，在 20 °C ± 2 条件下避光孵育 20 分钟。
  7. 加入 100 µl FACS 缓冲液，在 20 °C ± 2 条件下以 450 × g 离心 2 分钟，吸除上清液。
  8. 对于仅需进行细胞表面染色的样本，继续进行步骤 3.16。
  9. 若需进行细胞内 Foxp3 染色：
    1. 将固定与破膜缓冲液浓缩液与稀释液按 1:3 比例混合，配制工作液。
    2. 配制 1× 破膜缓冲液：1 份 10× 破膜缓冲液 + 9 份无菌 H2O。
  10. 用 100 µl 固定与破膜缓冲液重悬细胞沉淀，充分混匀，在 4 °C 下孵育 30 分钟。
  11. 向每孔加入 100 µl 破膜缓冲液，在室温下以 450 × g 离心 2 分钟，吸除上清液。
  12. 再用破膜缓冲液洗涤细胞一次。
  13. 选择所需细胞内单克隆抗体，例如 Foxp3-eFluo450（PCH101，1:50）、IL-17A-AlexFluo488（eBio64DEC1，1:50）和 IFNγ-PeCy7（4S.B3，1:400）。根据各单抗的稀释比例，使用含 2% 正常大鼠血清的破膜缓冲液配制抗体混合液。使用同型对照抗体与未染色样本共同设定设门参数。
  14. 向每孔加入 20 µl 预先配制的抗体混合液，在 4 °C 下避光孵育 30 分钟。
  15. 孵育 30 分钟后，向每孔加入 100 µl 破膜缓冲液，在 20 °C ± 2 条件下以 450 × g 离心 2 分钟，吸除上清液。
  16. 再用破膜缓冲液洗涤细胞一次。将细胞沉淀重悬于 110 µl FACS 缓冲液中，并将细胞悬液转移至 microFACS 管中。
    注：样本现已准备好用于 10 色流式细胞术检测。
  17. 若需精确测定细胞数量，在进行流式细胞术检测前，立即向每个样本中加入 10 µl 充分混匀的荧光微球均匀悬浮液。

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结果

采用单个4 mm皮肤活检样本时，本方案可从人皮肤中分离出2,200 ± 615（平均值 ± 标准误，健康志愿者皮肤）至178,000 ± 760（平均值 ± 标准误，银屑病患者病变皮肤）个有活力的淋巴细胞。

在来自健康个体皮肤的单细胞悬液中，鉴定出多种类型的CD45+细胞，包括CD4+ T细胞（约45%）、CD8+ T细胞（约30%）和CD11c+树突状细胞（DCs，约5%），而B细胞（CD19+）、NK细胞（CD56+CD3-）或单核细胞/巨噬细胞（CD14+或CD1c+）数量较少（图1A）。该方法还可用于分析人皮肤活检组织中的CD4+CD25+Foxp3+细胞。通过固定和透化处理后进行细胞内染色，可检测到转录因子Foxp3在CD25+ T细胞中的表达（

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讨论

本文介绍了一种从人皮肤活检组织中高效分离皮肤常驻T细胞的实验方案。该方案的优势在于能够分离出数量相对较多且具有活性的淋巴细胞，并表达相关的表面标志物。所鉴定出的细胞亚群包括：CD11c+ 树突状细胞（DCs）、CD4+ 和 CD8+ T细胞，以及 Foxp3+CD25+ 细胞。重要的是，分离得到的皮肤常驻T细胞进行体外（ex vivo）培养具有很高的可行性，可进一步用于功能分析。

通过结合机械解离和酶解降解维持组织结构完整性的细胞外黏附蛋白，可将人皮肤解离为单细胞悬液。尽管基于分散酶（dispase）的表皮与真皮分层分离法被广泛用于分析这些皮肤层中的细胞浸润情况，但我们注意到，分散酶处理会导致细胞表面CD25和CD27的表达显著降低（未显示）。由于这些标志物对于表征淋巴细胞亚群至关重要，我们认为分散酶处理会影响后续的免疫表型分析。CD25或CD27阳性细胞的减少不太可能是由真皮层的去除所致，因为在健康个体的皮肤中，大多数T细胞定位于真皮层，而表皮层中仅存在...

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披露

作者无任何利益冲突披露。

致谢

银屑病患者的皮肤活检样本由德国埃森大学皮肤病学系Andreas Koerber博士在获得患者口头或书面知情同意用于科学研究后提供。 

X.H. 还得到了国家自然科学基金 61263039 和国家自然科学基金 11101321 的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
一次性活检打孔器Kai EuropeBP-40F4 mm
一次性无菌手术刀Dalhausen1100000510
gentleMACS C 管Miltenyi Biotech130-093-237蓝色盖，用作解离管。
gentleMACS 组织解离仪Miltenyi Biotech130-093-235自动化组织解离设备。使用 "程序 spleen_01" 对皮肤活检组织进行解离。
细胞筛网 BD35235070 µm 尼龙
96 孔圆底板Greiner Bio-One650180
RPMI 1640Life Technologies22409-015
丙酮酸钠Life Technologies11360-039
GlutaMAXLife Technologies35050-061
青霉素/链霉素Life Technologies15140-122
人混合血清（HPS）实验室自制
胶原酶 ISigma-AldrichC26741-A 型，适用于细胞培养
DNase ICalbiochem260913
PBSB Braun3623140
BSASigma-AldrichA4503-500G
可固定活力染料（FVD）APC-eFluo780eBioscience65-0865-18细胞固定前用于标记死细胞；用 PBS 按 1:1,000 稀释
固定/透化浓缩液eBioscience00-5123-43
固定/透化稀释液eBioscience00-5223-56
透化缓冲液（10x）eBioscience00-8333-56
BV421 小鼠抗人 CD45BD563879克隆号：HI30；稀释倍数 1:50
FITC 小鼠抗人 CD14DakoT0844克隆号：TUK4；稀释倍数 1:50
PE 小鼠抗人 CD56DakoR7127克隆号：MOC-1；稀释倍数 1:50
ECD 小鼠抗人 CD3Beckman - CoulterA07748克隆号：UCHT1；表面染色稀释倍数 1:50；胞内染色稀释倍数 1:25
PC5.5 小鼠抗人 CD4Beckman - CoulterB16491克隆号：13B8.2；稀释倍数 1:200
PeCy7 小鼠抗人 CD11cBeckman - CoulterA80249克隆号：BU15；稀释倍数 1:50
APC 小鼠抗人 CD1cMiltenyi Biotech130-090-903克隆号：AD5-8E7；稀释倍数 1:10
APC-AlexFluo700 小鼠抗人 CD8Beckman - CoulterA66332克隆号：B9.11；稀释倍数 1:400
APC-AlexFluo750 小鼠抗人 CD19Beckman - CoulterA94681克隆号：J3-119；稀释倍数 1:50
PeCy7 小鼠抗人 CD25eBioscienceAD5-8E7克隆号：BC96；稀释倍数 1:50
 PE 大鼠抗人 CLAMiltenyi Biotech130-091-635克隆号：HECA-452；稀释倍数 1:
eFluo450 大鼠抗人 Foxp3eBIoscience48-4776-42克隆号：PCH101；胞内染色；稀释倍数 1:50
AlexFluo488 小鼠抗人 IL-17AeBioscience53-7179-42克隆号：eBio64DEC17；胞内染色；稀释倍数 1:50
PeCy7 小鼠抗人 IFNgeBioscience25-7319-41克隆号：4S.B3；胞内染色；稀释倍数 1:400
Flow-Count 荧光微球Beckman - Coulter7547053计数微珠，用于流式细胞术

参考文献

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