本文描述了一种培养 体外 由空间上受限、功能上相互连接的神经元回路组成的模块化网络。使用聚合物掩模在培养基底上构图蛋白层，以促进细胞在特定区域的黏附。接种的神经元在包被区域生长，形成自发连接并表现出电生理活性.
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方法文章
由功能互连回路构成的模块化神经网络的设计、表面处理、细胞接种与培养
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
大脑通过神经元集合的协调激活和动态通信来运作。一个尚未解决的重大问题是，大脑回路的固定拓扑结构和模块化组织如何能够产生出支撑多种脑功能的丰富动力学模式。与 体内 神经元环路研究，其本身具有内在的实验难度， 体外 制备方法为操控和探究实验性神经元系统的结构、动力学及化学特性提供了更广阔的可能性。本文描述了一种 体外 一种实验方法，可培养由空间上分离但功能上相互连接的神经元组件构成的模块化神经网络。该方案能够在不同拓扑复杂度水平上调控神经元网络的二维（2D）结构架构。
在普通盖玻片和嵌入微电极阵列的基底上均可实现理想的神经网络图案化。通过在硅片上加工出微机械结构，制备出具有目标网络结构负形特征的生物相容性聚合物模板。在利用分子层对培养基底进行表面包被以促进细胞黏附的过程中，将该模板置于基底表面。移除模板后，接种神经元细胞，细胞会自发迁移至已包被的区域。通过调节隔室间的距离，可获得相互隔离或相互连接的神经环路。为促进细胞存活，将细胞与位于培养皿边缘的辅助性神经网络进行共培养。本文展示了利用嵌入式微电极阵列和钙成像技术分别对模块化神经网络进行电生理和光学记录的结果。每个模块均表现出自发的全局同步活动，而模块间的同步则由环路之间的连接密度所调控。
引言
实验和理论证据均支持大脑通过神经元细胞群的协调激活来运作这一可能性1-5，这些细胞群可被视为动态的功能单元，能够短暂地相互作用，从而形成并支撑不同的脑状态。功能模块化也依赖于并与脑回路的结构模块化组织相关联6,7。脑回路的结构与功能如何相互塑造，仍是神经科学领域尚未解决的主要问题之一。为了更深入地理解这一问题，识别出能够至少部分地探讨这些问题的理想实验框架至关重要。由于在in vivo实验中对神经网络时空动力学进行可控操纵具有挑战性，因此in vitro神经网络模型因其易于接近、监测、操控和建模而具有重要意义8,9。近年来，在先进基底图案化方法支持下的in vitro技术已能够诱导神经网络形成一系列预定义的模块化结构3，并研究具有特定拓扑结构的网络的功能特性10。特别是，最近已有方法通过施加物理约束来组织神经网络4,11。事实上，为了研究神经网络中结构与功能之间的联系，并提供对相互作用神经元群组的简化但合理的表征，in vitro系统应具备相互连接的神经元亚群。广泛研究的二维均质神经元培养体系不对回路自组织形成的连接施加任何空间限制。因此，一种可能的人工构建相互连接细胞群组的方法是将不同的神经元群体置于空间上分离的区域。这些区域之间的距离并不会阻碍群组间的连接。这种方法在确保对网络复杂性进行有效控制的同时，已被证明能够产生更丰富的....
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方案
该实验程序遵循美国国立卫生研究院（NIH）关于实验动物护理与使用的标准，并已获得特拉维夫大学实验动物护理与使用委员会的批准（许可编号 – L-14-019）。
1. 仪器与聚二甲基硅氧烷的准备
- 准备晶圆（材料表，或从微加工实验室订购晶圆）、手术刀和镊子——无需灭菌。
- 按以下条件配制多聚-D-赖氨酸（PDL）溶液：在0.1 M硼酸缓冲液中配制成4 mg/ml，pH 8，并在-20 °C下保存。
- 按以下步骤制备PDMS模板：
- 通过将基础剂与固化剂按10:1的比例混合制备聚二甲基硅氧烷（PDMS，硅弹性体），然后将两种物质搅拌约5分钟。
- 放入真空腔中抽气两次，每次15分钟，并确认气泡已完全去除。
- PDMS准备就绪后，准备旋涂仪：打开氮气阀门以供气，将硅晶圆（图1A）放置在旋涂仪上，并使用真空固定以防止其移动。
- 将PDMS倒在晶圆上，启动旋涂仪以1,000 rpm转速旋转1分钟（形成约100 µm厚度）。
- 将晶圆置于100 °C的加热板上加热30分钟。
- 当PDMS固化后，使用巴斯德移液管沿模板边界涂布PDMS以形成边框，再将晶圆置于100 °C加热板上加热30分钟。
- 当PDMS边框固化后，使用手术刀沿....
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结果
使用特征厚度约为 100 µm 的硅片上 SU8-2075 模具对 PDMS 进行塑形。图案由多个不同尺寸的正方形组成，边长和间距在 200 至 700 µm 之间变化（图 1B）。正方形的尺寸选择需适配 10X 物镜（适用于边长 <800 µm 的岛状结构）和 20X 物镜（适用于边长 <400 µm 的岛状结构）的视场范围。细胞接种密度、电路间距以及电路尺寸这三个参数对于形成单层或簇状电路，以及控制和塑造其连接性具有决定性作用。然而，这些参数并非相互独立：在两个电路间距固定的情况下，电路尺寸越大，它们自发建立连接的概率越高。在本研究讨论的示例中，对于约 300 × 300 µm 的小型神经元模块，当间距不超过约 300–400 µm 时可建立连接；而对于约 700 × 700 µm 的大型神经元模块，当间距小于约 700 µm 时即可建立连接。总体而言，通过增加正方形之间的距离，可以调节模块间自发形成互连的概率，从而实现从高度连接的模块网络向孤立模块的转变。
约600 x的神经元模块 600 µm 在第4天显示 体外
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讨论
一种培养二维模块化神经元网络的方案 体外 由功能上相互连接的神经回路构成的模块化神经网络构建方法被描述。该方法基于对细胞黏附层进行图案化，图案化过程使用聚二甲基硅氧烷（PDMS）掩膜实现，该掩膜复制了目标网络结构的负像特征。PDMS掩膜界定了细胞黏附层的沉积区域。当细胞接种后，会自发地附着于涂层区域的岛状结构，并自组织形成具有活性且相互连接的神经回路。文中展示了利用多电极阵列（MEA）和钙成像技术记录的功能性模块化神经网络的活动数据。
与最初采用的方案相比，本方案已进行了适当的修改。首先，需要解决PDMS掩膜对准的问题。由于对准必须在第一次尝试时完成（一旦掩膜接触表面，不建议再次移动），因此通过放弃手动操作，改用一种新的方法来克服这一问题，即使用显微操作器将掩膜精确地沉积在MEA记录区域上。另一个需要解决的问题是防止PDL液滴渗入对准后的掩膜下方（否则无法获得所需的图案化结构）。为此，在掩膜对准后、滴加PDL液滴之前，需将所用装置（MEA或盖玻片）置于真空腔室中一段时间，以确保其与表面充分贴合。同样，在将PDL液滴置于掩膜上后，也需进行真空处理，以消除装置与液滴之.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由欧洲项目BRIANBOW（FP7-青年探索者）资助。作者感谢Jacopo Tessadori博士对稿件提出的有益意见，以及Silvia Chiappalone在制作视频中所用图形方面提供的帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| PDMS，Sylgard 184 | Dow Corning | ||
| Nalgene 真空室 | Thermo | 5305-0609 | |
| 多聚-D-赖氨酸 PDL | Sigma | P7886 | |
| 硅脂 - SILICAID 1010 | aidchim Ltd | H3375 | |
| 旋涂仪 | Laurell - Technologies Corporation | WS-650-23 | |
| 12孔细胞培养板 | Sigma | CLS3336 | |
| 5-氟-2’-脱氧尿苷 | Sigma | F0503 | |
| 尿苷 | Sigma | U3003 | |
| MEA1060-Inv-BC | Multi Channel Systems | ||
| TC02 | Multi Channel Systems | ||
| 青霉素-链霉素（Pen Strep） | Biological Industries Beit Haemek | 03-033-1c | |
| B-27 | Gibco | 17504044 | |
| glutaMAX | Gibco | 35050-038 | |
| MEM 最低必需培养基（Eagle） | Biological Industries Beit Haemek | 01-025-1B | |
| 微电极阵列 4Q | Multi Channel Systems | 60-4QMEA1000iR-Ti-pr | 清洁手册：http://www.multichannelsystems.com |
| 硅晶圆 | microchem | SU8-2075 | 制备方案：http://www.microchem.com |
参考文献
- Buzsaki, G. Neural syntax: cell assemblies, synapsembles, and readers. Neuron. 68, 362-385 (2010).
- Meunier, D., Lambiotte, R., Bullmore, E. T. Modular and hierarchically modular organization of brain networks. Frontiers in Neuroscience. 4, 200(2010).
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重印与许可
