本实验方案的目标是构建一种三维全厚度皮肤等效物，其结构类似于天然皮肤。通过特制的自动化致伤装置，可在保持无菌条件下产生精确且可重复的伤口。
本文内容
摘要
摘要
体外 模型是研究皮肤伤口愈合过程的一种经济且符合伦理的替代方法。此外，通过使用人类细胞，这些模型比动物模型更能准确反映人类的伤口状况。尽管二维模型已广泛用于研究细胞迁移和增殖等过程，但仍需更复杂的模型以深入理解伤口愈合机制。除了合适的模型系统外，产生精确且可重复的伤口对于确保不同实验之间结果的可比性至关重要。本研究展示了用于研究伤口愈合的三维全层皮肤等效模型的构建方法。模型的真皮部分由嵌入大鼠尾部I型胶原水凝胶中的人类真皮成纤维细胞构成。接种人类表皮角质形成细胞后，在气液界面条件下进行培养，模型表面可形成多层结构的表皮。为研究伤口愈合过程，我们还开发了一种自动化致伤装置，可在无菌环境中生成标准化的伤口。 三维皮肤模型, 伤口愈合, 人类细胞, 全层皮肤等效物, 胶原水凝胶, 表皮角质形成细胞, 真皮成纤维细胞, 气液界面培养, 自动化致伤装置, 标准化伤口
引言
皮肤是人体最大的器官，它在外部环境与内部器官之间形成一道屏障。此外，皮肤还能保护机体免受体液流失、环境影响、损伤和感染的侵害，并有助于调节体温1。由于其暴露的位置，皮肤常受到机械性、热力性或化学性创伤的影响。尽管皮肤通常具备自我修复能力，但多种局部因素如感染、氧合状况和静脉回流是否充分等，可能导致伤口愈合受损。系统性因素如肥胖、酗酒、吸烟、药物使用、营养状况以及糖尿病等疾病也可能干扰伤口愈合过程2。
伤口愈合过程可分为三个阶段：（i）炎症期，（ii）增殖期和（iii）重塑期。皮肤受到损伤后，会启动复杂的信号级联反应，最终实现伤口闭合。3 损伤发生后，伤口会出血并形成血凝块。成纤维细胞迁移至血凝块中，将其替换为新生组织，随后该组织在数年内经历重塑过程。
目前对皮肤修复背后生物学过程的理解仍然有限。研究人员已使用小型动物和猪模型来研究伤口愈合。然而，由于物种间的特异性差异，这些结果无法直接外推至人类。除了这些体内模型外，还可通过刮除基于永生化细胞系或原代细胞的体外单层培养物来模拟伤口状态，从而研究伤口愈合的某些方面。4 这类刮痕模型具有高度标准化的优点，但不足以充分反映复杂的体内生理环境。5 除了二维模型外，三维人皮肤等效物也已发展并应用于皮肤病学研究。这些模型的真皮部分可通过多种支架材料构建，包括去细胞化真皮6、胶原水凝胶7,8、糖胺聚糖9或合成材料。10 利用这些皮肤等效物，可研究上皮-间充质相互作用11、再上皮化过程、成纤维细胞与角质形成细胞之间的细胞互作，以及不同生长因子的影响。此外，这些模型还有助于深入了解成纤维细胞如何迁移至损伤区域，以及趋化因子如何影响组织再生。12
不仅伤口愈合模型本身的构建具有挑战性，而且在模型中建立高度标准化的伤口也存在问题。常见的造伤方法包括划痕试验13、烧伤14、胶带摩擦15、热损伤16、负压水疱17、液氮冷冻18、激光19、手术刀18、组织研磨器6以及活检打孔器20。这些方法大多存在相同的缺陷。人工操作造成的损伤难以在多次实验之间实现标准化和重复。伤口的大小、形状和深度在不同研究之间存在差异，从而影响科研数据的质量。使用激光进行精确皮肤造伤相对容易实现标准化，但其结果更类似于烧伤伤口。激光产生的热量可能导致蛋白质变性、血小板聚集或血管收缩，进而引起组织坏死。
在另一种方法中，我们开发了一种自动损伤装置（aWD），可在无菌条件下生成定义明确且精确的皮肤伤口。损伤参数（如穿透深度、速度以及钻头转速）均可调节。在本研究中，我们将aWD与实验室自主研发的全层皮肤替代物（ftSE）相结合，该模型与Gangatirkar et al. 8 发表的方案类似。皮肤替代物的真皮层由嵌于I型胶原水凝胶中的人真皮成纤维细胞（hDF）构成。在真皮层之上接种人表皮角质形成细胞（hEK）。在气液界面培养两周内，hEK可形成由多层活细胞及角质层（stratum corneum）构成的表皮。本研究不仅展示了该模型的构建方法，还验证了利用aWD在ftSE上制造定义明确且精确伤口的应用效果。
方案
注意：本方案旨在制备24个全层皮肤等效物。人真皮成纤维细胞和表皮角质形成细胞根据先前发表的方案从皮肤活检组织中分离获得。21,22 实验前已获取知情同意，并经维尔茨堡朱利叶斯-马克西米利安大学人类研究机构伦理委员会批准（批准号：182/10）。
1. 真皮组分的制备
- 用0.1%乙酸溶解胶原蛋白，使其终浓度为6 mg/ml。配制凝胶中和溶液：将232.5 ml 2× DMEM、7.5 ml 胎牛血清、7.5 ml 3 M HEPES 和 2.5 ml 硫酸软骨素（5 mg/ml）混合。将凝胶中和溶液和胶原蛋白溶液置于冰上保存。按每插入物/皮肤等效物500 µl凝胶计算所需体积。
注意：由于凝胶中和溶液将与两倍体积的胶原蛋白溶液混合，因此需准备双倍量的胶原蛋白溶液。 - 将24个插入物放入24孔板中。
- 将人真皮成纤维细胞（hDF）重悬于10 ml DMEM中，270 × g离心5分钟，计数细胞。取所需数量的hDF（每500 µl胶原蛋白凝胶含5 × 104 个细胞），270 × g离心5分钟。
- 弃去上清液，小心地将hDF用4 ml预冷的凝胶中和溶液重悬，避免产生气泡。从该步骤开始应尽快操作，以防止胶原凝胶过早凝固。
- 向该溶液中加入8 ml胶原蛋白溶液并混匀。
- 使用多通道移液器吸取胶原-细胞混合液，迅速向每个插入物中加入500 µl混合液。将凝胶在培养箱（37 °C，5% CO2）中孵育20分钟，使其凝胶化。
- 向每个孔中加入2 ml杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）+ 10%胎牛血清（FCS），在培养箱（37 °C，5% CO2）中孵育24小时。
2. 添加人表皮角质形成细胞（hEK）
- 24 小时后移除培养基。用超纯水溶解人纤维连接蛋白，配制成终浓度为 50 µg/ml 的溶液。每块真皮等效物上覆盖 25 μl 纤维连接蛋白溶液。将凝胶在培养箱中孵育 30 分钟（37 °C，5% CO2）。
- 与此同时，将 hEK 重悬于 10 ml KGM-2 培养基中，并用含 5% FCS 的 KGM-2 培养基调整细胞浓度至 1 × 106 个细胞/ml。每块凝胶上接种 1 × 105 个 hEK 细胞。将凝胶在培养箱中孵育 45 分钟（37 °C，5% CO2），以使细胞贴附。
- 用含 5% FCS 的 KGM-2 培养基浸没凝胶，并在培养箱中继续培养（37 °C，5% CO2）。
3. 全层皮肤等效物（ftSE）的培养
- 将ftSE在FCS浓度递减的培养基中培养6-7天（5%、2%和0% FCS）。每2-3天更换一次培养基，依次使用更低浓度的FCS培养基。操作时，完全移除旧培养基，并加入1.6 ml新鲜培养基。
- 第7天，彻底移除培养基。
注意：操作过程中切勿用移液器枪头接触ftSE表面。 - 用无菌镊子将每个插入物转移至6孔板的每个孔中。每孔加入1.5 ml气液界面培养基，注意避免润湿ftSE表面。继续培养14天，每2-3天更换一次培养基。
注意：培养基液面高度应与ftSE的弯月面齐平。
4. 组织学分析
- ftSE 的固定与石蜡包埋
- 移除培养基，将小室转移至新的24孔板中，并通过加入1.6 4% 的 ml 向每个孔中加入多聚甲醛，在室温下固定组织 2 小时。注意！多聚甲醛有毒，应在通风橱中操作。将 ftSE 转移至组织包埋盒中。用清水洗涤以去除残留的固定液，并使用梯度乙醇进行脱水处理。
- 将皮肤等效物在中间进行垂直切割，分为两部分。将两块组织切面朝下放入盛有石蜡的金属底模中。在模具上方加盖组织包埋盒作为支撑。
- 切取3-5 µm切片，置于40 °C水浴中展平，将切片捞至合适的载玻片上，彻底干燥。
- 苏木精 & 伊红（H&E）和免疫组织化学（IHC）染色
- 将切片放入染色架中，在60 °C下孵育1小时，确保石蜡完全融化。用H对复水后的切片进行染色&E 作为标准化的总体染色方法。
- 对于 H&E 染色准备 4 个盛有二甲苯的玻璃染色缸，3 个盛有 96% 乙醇的染色缸，2 个盛有 70% 乙醇的染色缸，1 个盛有 50% 乙醇的染色缸，4 个盛有去离子水的染色缸，1 个盛有苏木精的染色缸，1 个盛有盐酸乙醇（13.7 ml 1 M HCl 加至200 ml 50%乙醇），1×蒸馏水，1×伊红（1 100 中的 g 伊红 毫升去离子水）和 2 次 2-丙醇。
- 将切片置于二甲苯 I 中 10 分钟，再置于二甲苯 II 中 10 分钟，以完成脱蜡。随后将切片依次浸入 96% 乙醇 I 中 3 次，96% 乙醇 II 中 3 次，70% 乙醇中 3 次，以及乙醇中 3 次，进行再水化。 50%。将切片在去离子水中轻轻晃动。为分化苏木精染色，将切片浸入盐酸乙醇溶液中2次。用去离子水冲洗。进行蓝化时，将切片置于自来水中5分钟。进行伊红染色时，将切片放入伊红溶液中染色1分钟，随后用去离子水洗涤。脱水过程中，将切片依次浸入70%乙醇2次、96%乙醇2次，然后分别在2-丙醇I中放置5分钟、2-丙醇II中放置5分钟、二甲苯I中放置5分钟、二甲苯II中放置5分钟。完成H&E 染色中，细胞核呈蓝色，细胞质和细胞外基质呈红色。
- 抗原修复时，用二甲苯去除石蜡，并将切片复水以进行染色。将切片置于蒸锅中，在预热的10 毫摩尔柠檬酸缓冲液（pH 6).
- 将载玻片放入洗涤缓冲液（PBS 缓冲液 + 0.5% 吐温 20）中 20）使用防液体扩散的划圈笔或钻石刻划笔在载玻片上标记并圈出切片区域。
- 将载玻片置于湿盒中。通过加入100 µl 3%过氧化物酶阻断剂，阻断内源性过氧化物酶。 将过氧化氢溶液加至每张切片上。注意！若接触皮肤或眼睛，有极高危险性。操作时需佩戴个人防护装备。用洗涤缓冲液清洗载玻片。
- 加入一抗，在室温下孵育1小时。用洗涤缓冲液洗涤切片3次。自此步骤开始，样品应避光保存。
- 使用生物素-链霉亲和素检测系统检测特异性抗原-抗体结合。
- 用苏木精对细胞核进行复染，1 分钟。脱水并封片。
- 使用倒置显微镜获取图像样本。
5. 使用自动划伤装置（aWD）造成损伤
- 使用70%乙醇和紫外灯对操作区域进行消毒，以准备aWD。确保使用所需尺寸的钻头（例如， 1 mm）处连接。
- 使用无菌镊子将皮肤等效物放入灭菌后的样品承载板指定区域。将样品承载板置于钻孔头下方的插槽中。
- 使用控制软件设置损伤参数如下：旋转速度：15,000 rpm；穿透深度：1.5 mm；推进频率：100 Hz。这些参数需针对每种样品类型单独定义。将损伤参数传输至 aWD。
- 开始伤口处理程序。从插座中取出样本载体板。使用无菌镊子将受伤的 ftSE 转移回用于培养的插入式培养器中。
- 将受伤的 ftSE 继续在培养箱中培养（37 °C，5% CO₂）2) 用于再生研究的分析。或者，可在任意时间点取材用于组织学分析。
结果
分离的人包皮成纤维细胞（hDF）和人表皮角质形成细胞（hEK）在形态学和典型标志物表达方面均存在差异。hDF 呈典型的梭形形态，而 hEK 的形态则表现为铺路石样形态。在将这些细胞用于 ftSE 实验之前，通过免疫组织化学染色对其进行表征（图 1）。hDF 对波形蛋白（vimentin）呈阳性反应（图 1A），该蛋白是成纤维细胞的标志物。原代 hEK 高表达早期角质形成细胞分化蛋白细胞角蛋白-14（cytokeratin-14）（图 1B），但几乎不表达晚期角质形成细胞分化蛋白细胞角蛋白-10（cytokeratin-10）（图 1C）。
原代培养后，我们将细胞从细胞培养瓶中分离，并用于生成ftSE。ftSE在浸没培养条件下培养7天（图2A），随后在气液界面条件下继续培养14天（图2B）。在此过程中，ftSE发生显著收缩。在21天内，人表皮角质形成细胞（hEK）持续增殖（图2C-E）。通过调节培养基液面使模型表面暴露于空气中，并提高钙离子浓度，可诱导hEK分化为多层表皮结构，该结构由处于不同分化阶段的多层活性角质形成细胞以及一层stratum corneum（角质层）组成（图2E）。
通过比较ftSE的苏木精与伊红染色（图2E）与天然人皮肤（图2F），可以明显看出ftSE模拟了皮肤的组织学结构。这一点可通过免疫组织化学染色进一步证实（图3）。包埋于I型胶原水凝胶中的hDF可用抗波形蛋白的特异性一抗进行染色（图3A、E）。角质形成细胞形成表皮层，由表达细胞角蛋白-14的细胞构成（图3B、F），而晚期分化标志物细胞角蛋白-10则在基底上层表达（图3C、G）。此外，角质层对丝聚合蛋白呈阳性反应（图3D、H）。
经过21天的培养期后，使用aWD在ftSE上生成皮肤伤口。如图4A所示，aWD被构造成一个封闭的箱体系统，以确保无菌条件。在图4B中展示了伤口制备过程的示意图。ftSE被固定在样品载板上。整个伤口制备过程，包括下压速度、钻头转速（图4D）以及穿透深度等参数的设定，均由计算机辅助控制。可通过前方观察窗或高分辨率相机对伤口制备过程进行光学监测，相机可记录伤口制备期间的所有步骤。伤口损伤的大小、形状和深度均可单独调节（图4C）。
图1. 用于构建全层皮肤等效物的细胞表征。 对原代人真皮成纤维细胞进行波形蛋白（A）的免疫组织化学染色，以及对表皮角质形成细胞进行早期分化角蛋白丝细胞角蛋白-14（B）和晚期分化丝细胞角蛋白-10（C）的染色。阳性染色呈棕色。比例尺为 100 μm。请点击此处查看该图的放大版本。
图 2. 全层皮肤等效物培养条件的变化及其成熟过程。 全层皮肤等效物在浸没条件下培养 7 天（A）和在气液界面培养 14 天（B）后的宏观图像。不同发育阶段全层皮肤等效物的苏木精与伊红染色比较：培养 7 天后（C）、14 天后（其中 7 天处于气液界面，D）和 21 天后（其中 14 天处于气液界面，E）。天然人皮肤的苏木精与伊红染色（F）。比例尺表示 100 μm。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 3. 全层皮肤等效物的表征。 全层皮肤等效物（A–D）与天然人皮肤（E–H）中波形蛋白（A、E）、细胞角蛋白-14（B、F）、细胞角蛋白-10（C、G）和丝聚合蛋白（D、H）的免疫组织化学染色比较。比例尺为 100 μm。请点击此处查看该图的放大版本。
图4. 用于全层皮肤等效物上可控损伤的自动造伤装置。 自动化造伤装置（aWD）可在可控造伤过程中提供无菌环境（A）。连接的计算机（CPU）用于控制aWD。将全层皮肤等效物（ftSEs）放置在样品载板（SCP）上，通过光屏障（LB）校正样品形态的偏差，并触发造伤程序。伤口形状取决于所使用的钻头（DH），其直径范围从1 mm（C，上图）到2 mm（C，下图）。造伤过程可被实时监控，并可记录以用于文档存档和质量控制（D）。使用1 mm钻头的自动化造伤装置对全层皮肤等效物进行造伤后，经苏木精与伊红染色的横截面图像（E）。所有比例尺均为2 mm。请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
体外细胞通常在二维细胞培养体系中扩增，其中细胞附着于塑料表面。然而，这些培养条件并不能反映细胞在体内生长的生理三维环境。在三维条件下，细胞能够形成自然的细胞-细胞连接和细胞-基质连接，并在三维空间中迁移。尤其是在皮肤伤口愈合研究中，模拟体内环境对于获得有意义的数据至关重要，因为细胞迁移和基质生成是伤口愈合的关键环节。
为了模拟这些条件，我们开发了由人类原代细胞组成的功能性皮肤等效物（ftSE），其能够同时反映皮肤的真皮层和表皮层。在气液界面培养两周期间，人表皮角质形成细胞（hEK）会形成由处于不同分化阶段的多层角质形成细胞以及角质层（stratum corneum）构成的表皮。此外，真皮层由嵌入于I型胶原水凝胶中的人真皮成纤维细胞（hDF）组成。在培养过程中，hDF会重塑真皮成分，导致模型发生显著收缩（图2B）。
为了制备可重复且标准化的伤口，我们开发了一种自动伤口装置（aWD）。该计算机控制的设备能够创建定义明确且精确的皮肤损伤（图4）。根据预期的研究目的，可调整损伤的深度、形状和大小。然而，由于aWD的技术规格以及ftSE的形态特征，建议设置至少100 µm的穿透深度以确保可重复性。aWD在封闭箱体系统内以无菌条件运行，所有组件均可通过高压灭菌、消毒液或紫外光进行灭菌。在伤口制备操作前，需将样本转移至样本承载板。该承载板有助于样本精确定位，且样本与承载板之间的粘附力足以在造伤过程中保持样本位置固定。造伤过程本身可通过前方观察窗或高分辨率摄像头进行光学监测，摄像头可从近景位置记录所有操作步骤。与其他使用激光消融组织以形成伤口的系统不同，aWD采用旋转钻头进行操作，因此在过程中不产生热效应，这是研究机械性伤口的关键前提。此外，钻头的特定形状可确保伤口通道内的材料被有效移除。通过使用上述经实验确定的造伤参数，可针对ftSE或天然皮肤样本的特定生理特性调整造伤程序，从而最大限度地减少表皮层意外脱落等不良副作用，并实现成功率高达90%的可重复性造伤。
本研究结果表明，所开发的ftSE在一定程度上模拟了 体内 准确反映皮肤状况，因此可作为伤口愈合研究的模型。尽管该模型缺乏血管系统、血凝块和免疫系统等在伤口愈合过程中重要的因素，但其在三维高度标准化的环境中重现了表皮-间质及细胞-基质间的相互作用。此外，我们已证实活体伤口装置（aWD）可在皮肤模型上产生标准化的伤口。结合这两种技术，可用于研究伤口愈合过程以及促进愈合的物质和药物的作用。为了模拟 体内 为更密切地模拟该情况，ftSE 可通过其他细胞（如黑素细胞、皮肤肿瘤细胞或微血管内皮细胞）进行扩展。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢弗劳恩霍夫 ISC 在自动划伤装置构建方面的合作。该项目由弗劳恩霍夫内部项目“未来市场”（SkinHeal）资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DPBS 中的胰蛋白酶 EDTA（1:250，0.5%） | PAA | L11-003 | 0.05% |
| Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液 | Sigma | D8537 | |
| 胶原蛋白（0.1% 乙酸中的 6 mg/ml） | 本实验室制备 | ||
| 人纤维连接蛋白，血浆来源（50 µg/ml） | Life Technologies | 33016-015 | |
| 插入式培养皿 | Nunc | 140627 | |
| 6 孔板 | Nunc | 140685 | |
| 24 孔板 | Nunc | 142485 | |
| 显微镜载玻片 | R. Langenbrinck | 03-0070 | |
| 成纤维细胞培养基（500 ml）： | |||
| DMEM，高糖 | Life Technologies | 11965-092 | 89%（445 ml） |
| 胎牛血清 | Bio & Sell | FCS.ADD.0500 | 10%（50 ml） |
| 青霉素-链霉素（10,000 U/ml） | Life Technologies | 15140-122 | 1%（5 ml） |
| 角质形成细胞培养基（500 ml）： | |||
| 角质形成细胞生长培养基 2 | Promocell | C-20111 | 89%（445 ml） |
| 角质形成细胞生长培养基 2 补充剂套装 | Promocell | C-39011 | |
| 青霉素-链霉素（10,000 U/ml） | Life Technologies | 15140-122 | 1%（5 ml） |
| 凝胶中和溶液（250 ml）： | |||
| Dulbecco’s 改良 Eagle 培养基，高糖粉末含 L-谷氨酰胺 | PAA | G0001,3010 | 93%（232.5 ml） |
| 鲨鱼软骨来源的硫酸软骨素钠盐 | Sigma | C4384-1g | 1%（2.5 ml） |
| 胎牛血清 | Bio & Sell | FCS.ADD.0500 | 3%（7.5 ml） |
| HEPES | Sigma | H3375-1kg | 3%（7.5 ml） |
| 皮肤模型浸没式培养基（500 ml）： | |||
| 角质形成细胞生长培养基 2 | Promocell | C-20111 | |
| 角质形成细胞生长培养基 2 补充剂套装 | Promocell | C-39011 | |
| 胎牛血清 | Bio & Sell | FCS.ADD.0500 | 5%-2%（25 ml-10 ml） |
| 青霉素-链霉素（10,000 U/ml） | Life Technologies | 15140-122 | 1%（5 ml） |
| 皮肤模型气液界面培养基（500 ml）： | |||
| 角质形成细胞生长培养基 2 | |||
| 角质形成细胞生长培养基 2 补充剂套装 | Promocell | C-39011 | 仅添加补充剂：胰岛素、氢化可的松、肾上腺素、转铁蛋白、CaCl2 |
| 青霉素-链霉素（10,000 U/ml） | Life Technologies | 15140-122 | 1%（5 ml） |
| CaCl2（300 mM） | Sigma | C7902-500g | 0.62%（3.1 ml） |
| 组织学： | |||
| IHC-Kit DCS SuperVision 2 HRP | DCS | PD000KIT | |
| 波形蛋白抗体 | Abcam | ab92547 | |
| CK14 抗体 | Sigma | HPA023040-100µl | |
| CK10 抗体 | Dako | M7002 | |
| 丝聚蛋白抗体 | Abcam | ab81468 | |
| 苏木精-伊红（H&E）染色： | |||
| Mayer´s 苏木精 | AppliChem | A0884,2500 | |
| 二甲苯 | Sigma Aldrich | 296325-4X2L | |
| 乙醇 | Sigma Aldrich | 32205-4X2.5L | |
| HCl | Sigma Aldrich | H1758-500ML | |
| 伊红 | Sigma Aldrich | E4009-5G | |
| 2-丙醇 | Sigma Aldrich | I9516-500ML | |
| 封片介质 | Sigma Aldrich | M1289-10ML |
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