生成三维全层皮肤等效物及自动化伤口制造

摘要

本实验方案的目标是构建一种三维全厚度皮肤等效物，其结构类似于天然皮肤。通过特制的自动化致伤装置，可在保持无菌条件下产生精确且可重复的伤口。

摘要

体外 模型是研究皮肤伤口愈合过程的一种经济且符合伦理的替代方法。此外，通过使用人类细胞，这些模型比动物模型更能准确反映人类的伤口状况。尽管二维模型已广泛用于研究细胞迁移和增殖等过程，但仍需更复杂的模型以深入理解伤口愈合机制。除了合适的模型系统外，产生精确且可重复的伤口对于确保不同实验之间结果的可比性至关重要。本研究展示了用于研究伤口愈合的三维全层皮肤等效模型的构建方法。模型的真皮部分由嵌入大鼠尾部I型胶原水凝胶中的人类真皮成纤维细胞构成。接种人类表皮角质形成细胞后，在气液界面条件下进行培养，模型表面可形成多层结构的表皮。为研究伤口愈合过程，我们还开发了一种自动化致伤装置，可在无菌环境中生成标准化的伤口。 三维皮肤模型, 伤口愈合, 人类细胞, 全层皮肤等效物, 胶原水凝胶, 表皮角质形成细胞, 真皮成纤维细胞, 气液界面培养, 自动化致伤装置, 标准化伤口

引言

皮肤是人体最大的器官，它在外部环境与内部器官之间形成一道屏障。此外，皮肤还能保护机体免受体液流失、环境影响、损伤和感染的侵害，并有助于调节体温¹。由于其暴露的位置，皮肤常受到机械性、热力性或化学性创伤的影响。尽管皮肤通常具备自我修复能力，但多种局部因素如感染、氧合状况和静脉回流是否充分等，可能导致伤口愈合受损。系统性因素如肥胖、酗酒、吸烟、药物使用、营养状况以及糖尿病等疾病也可能干扰伤口愈合过程²。

伤口愈合过程可分为三个阶段：（i）炎症期，（ii）增殖期和（iii）重塑期。皮肤受到损伤后，会启动复杂的信号级联反应，最终实现伤口闭合。³ 损伤发生后，伤口会出血并形成血凝块。成纤维细胞迁移至血凝块中，将其替换为新生组织，随后该组织在数年内经历重塑过程。

目前对皮肤修复背后生物学过程的理解仍然有限。研究人员已使用小型动物和猪模型来研究伤口愈合。然而，由于物种间的特异性差异，这些结果无法直接外推至人类。除了这些体内模型外，还可通过刮除基于永生化细胞系或原代细胞的体外单层培养物来模拟伤口状态，从而研究伤口愈合的某些方面。⁴ 这类刮痕模型具有高度标准化的优点，但不足以充分反映复杂的体内生理环境。⁵ 除了二维模型外，三维人皮肤等效物也已发展并应用于皮肤病学研究。这些模型的真皮部分可通过多种支架材料构建，包括去细胞化真皮⁶、胶原水凝胶^7,8、糖胺聚糖⁹或合成材料。¹⁰ 利用这些皮肤等效物，可研究上皮-间充质相互作用¹¹、再上皮化过程、成纤维细胞与角质形成细胞之间的细胞互作，以及不同生长因子的影响。此外，这些模型还有助于深入了解成纤维细胞如何迁移至损伤区域，以及趋化因子如何影响组织再生。¹²

不仅伤口愈合模型本身的构建具有挑战性，而且在模型中建立高度标准化的伤口也存在问题。常见的造伤方法包括划痕试验¹³、烧伤¹⁴、胶带摩擦¹⁵、热损伤¹⁶、负压水疱¹⁷、液氮冷冻¹⁸、激光¹⁹、手术刀¹⁸、组织研磨器⁶以及活检打孔器²⁰。这些方法大多存在相同的缺陷。人工操作造成的损伤难以在多次实验之间实现标准化和重复。伤口的大小、形状和深度在不同研究之间存在差异，从而影响科研数据的质量。使用激光进行精确皮肤造伤相对容易实现标准化，但其结果更类似于烧伤伤口。激光产生的热量可能导致蛋白质变性、血小板聚集或血管收缩，进而引起组织坏死。

在另一种方法中，我们开发了一种自动损伤装置（aWD），可在无菌条件下生成定义明确且精确的皮肤伤口。损伤参数（如穿透深度、速度以及钻头转速）均可调节。在本研究中，我们将aWD与实验室自主研发的全层皮肤替代物（ftSE）相结合，该模型与Gangatirkar et al. ⁸ 发表的方案类似。皮肤替代物的真皮层由嵌于I型胶原水凝胶中的人真皮成纤维细胞（hDF）构成。在真皮层之上接种人表皮角质形成细胞（hEK）。在气液界面培养两周内，hEK可形成由多层活细胞及角质层（stratum corneum）构成的表皮。本研究不仅展示了该模型的构建方法，还验证了利用aWD在ftSE上制造定义明确且精确伤口的应用效果。

方案

注意：本方案旨在制备24个全层皮肤等效物。人真皮成纤维细胞和表皮角质形成细胞根据先前发表的方案从皮肤活检组织中分离获得。^21,22 实验前已获取知情同意，并经维尔茨堡朱利叶斯-马克西米利安大学人类研究机构伦理委员会批准（批准号：182/10）。

1. 真皮组分的制备

1. 用0.1%乙酸溶解胶原蛋白，使其终浓度为6 mg/ml。配制凝胶中和溶液：将232.5 ml 2× DMEM、7.5 ml 胎牛血清、7.5 ml 3 M HEPES 和 2.5 ml 硫酸软骨素（5 mg/ml）混合。将凝胶中和溶液和胶原蛋白溶液置于冰上保存。按每插入物/皮肤等效物500 µl凝胶计算所需体积。
   注意：由于凝胶中和溶液将与两倍体积的胶原蛋白溶液混合，因此需准备双倍量的胶原蛋白溶液。
2. 将24个插入物放入24孔板中。
3. 将人真皮成纤维细胞（hDF）重悬于10 ml DMEM中，270 × g离心5分钟，计数细胞。取所需数量的hDF（每500 µl胶原蛋白凝胶含5 × 10⁴ 个细胞），270 × g离心5分钟。
4. 弃去上清液，小心地将hDF用4 ml预冷的凝胶中和溶液重悬，避免产生气泡。从该步骤开始应尽快操作，以防止胶原凝胶过早凝固。
5. 向该溶液中加入8 ml胶原蛋白溶液并混匀。
6. 使用多通道移液器吸取胶原-细胞混合液，迅速向每个插入物中加入500 µl混合液。将凝胶在培养箱（37 °C，5% CO₂）中孵育20分钟，使其凝胶化。
7. 向每个孔中加入2 ml杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）+ 10%胎牛血清（FCS），在培养箱（37 °C，5% CO₂）中孵育24小时。

2. 添加人表皮角质形成细胞（hEK）

1. 24 小时后移除培养基。用超纯水溶解人纤维连接蛋白，配制成终浓度为 50 µg/ml 的溶液。每块真皮等效物上覆盖 25 μl 纤维连接蛋白溶液。将凝胶在培养箱中孵育 30 分钟（37 °C，5% CO₂）。
2. 与此同时，将 hEK 重悬于 10 ml KGM-2 培养基中，并用含 5% FCS 的 KGM-2 培养基调整细胞浓度至 1 × 10⁶ 个细胞/ml。每块凝胶上接种 1 × 10⁵ 个 hEK 细胞。将凝胶在培养箱中孵育 45 分钟（37 °C，5% CO₂），以使细胞贴附。
3. 用含 5% FCS 的 KGM-2 培养基浸没凝胶，并在培养箱中继续培养（37 °C，5% CO₂）。

3. 全层皮肤等效物（ftSE）的培养

1. 将ftSE在FCS浓度递减的培养基中培养6-7天（5%、2%和0% FCS）。每2-3天更换一次培养基，依次使用更低浓度的FCS培养基。操作时，完全移除旧培养基，并加入1.6 ml新鲜培养基。
2. 第7天，彻底移除培养基。
   注意：操作过程中切勿用移液器枪头接触ftSE表面。
3. 用无菌镊子将每个插入物转移至6孔板的每个孔中。每孔加入1.5 ml气液界面培养基，注意避免润湿ftSE表面。继续培养14天，每2-3天更换一次培养基。
   注意：培养基液面高度应与ftSE的弯月面齐平。

4. 组织学分析

1. ftSE 的固定与石蜡包埋
   1. 移除培养基，将小室转移至新的24孔板中，并通过加入1.6 4% 的 ml 向每个孔中加入多聚甲醛，在室温下固定组织 2 小时。注意！多聚甲醛有毒，应在通风橱中操作。将 ftSE 转移至组织包埋盒中。用清水洗涤以去除残留的固定液，并使用梯度乙醇进行脱水处理。
   2. 将皮肤等效物在中间进行垂直切割，分为两部分。将两块组织切面朝下放入盛有石蜡的金属底模中。在模具上方加盖组织包埋盒作为支撑。
   3. 切取3-5 µm切片，置于40 °C水浴中展平，将切片捞至合适的载玻片上，彻底干燥。
2. 苏木精 & 伊红（H&E）和免疫组织化学（IHC）染色
   1. 将切片放入染色架中，在60 °C下孵育1小时，确保石蜡完全融化。用H对复水后的切片进行染色&E 作为标准化的总体染色方法。
   2. 对于 H&E 染色准备 4 个盛有二甲苯的玻璃染色缸，3 个盛有 96% 乙醇的染色缸，2 个盛有 70% 乙醇的染色缸，1 个盛有 50% 乙醇的染色缸，4 个盛有去离子水的染色缸，1 个盛有苏木精的染色缸，1 个盛有盐酸乙醇（13.7 ml 1 M HCl 加至200 ml 50%乙醇），1×蒸馏水，1×伊红（1 100 中的 g 伊红 毫升去离子水）和 2 次 2-丙醇。
   3. 将切片置于二甲苯 I 中 10 分钟，再置于二甲苯 II 中 10 分钟，以完成脱蜡。随后将切片依次浸入 96% 乙醇 I 中 3 次，96% 乙醇 II 中 3 次，70% 乙醇中 3 次，以及乙醇中 3 次，进行再水化。 50%。将切片在去离子水中轻轻晃动。为分化苏木精染色，将切片浸入盐酸乙醇溶液中2次。用去离子水冲洗。进行蓝化时，将切片置于自来水中5分钟。进行伊红染色时，将切片放入伊红溶液中染色1分钟，随后用去离子水洗涤。脱水过程中，将切片依次浸入70%乙醇2次、96%乙醇2次，然后分别在2-丙醇I中放置5分钟、2-丙醇II中放置5分钟、二甲苯I中放置5分钟、二甲苯II中放置5分钟。完成H&E 染色中，细胞核呈蓝色，细胞质和细胞外基质呈红色。
   4. 抗原修复时，用二甲苯去除石蜡，并将切片复水以进行染色。将切片置于蒸锅中，在预热的10 毫摩尔柠檬酸缓冲液（pH 6).
   5. 将载玻片放入洗涤缓冲液（PBS 缓冲液 + 0.5% 吐温 20）中 20）使用防液体扩散的划圈笔或钻石刻划笔在载玻片上标记并圈出切片区域。
   6. 将载玻片置于湿盒中。通过加入100 µl 3%过氧化物酶阻断剂，阻断内源性过氧化物酶。 将过氧化氢溶液加至每张切片上。注意！若接触皮肤或眼睛，有极高危险性。操作时需佩戴个人防护装备。用洗涤缓冲液清洗载玻片。
   7. 加入一抗，在室温下孵育1小时。用洗涤缓冲液洗涤切片3次。自此步骤开始，样品应避光保存。
   8. 使用生物素-链霉亲和素检测系统检测特异性抗原-抗体结合。
   9. 用苏木精对细胞核进行复染，1 分钟。脱水并封片。
   10. 使用倒置显微镜获取图像样本。

5. 使用自动划伤装置（aWD）造成损伤

1. 使用70%乙醇和紫外灯对操作区域进行消毒，以准备aWD。确保使用所需尺寸的钻头（例如， 1 mm）处连接。
2. 使用无菌镊子将皮肤等效物放入灭菌后的样品承载板指定区域。将样品承载板置于钻孔头下方的插槽中。
3. 使用控制软件设置损伤参数如下：旋转速度：15,000 rpm；穿透深度：1.5 mm；推进频率：100 Hz。这些参数需针对每种样品类型单独定义。将损伤参数传输至 aWD。
4. 开始伤口处理程序。从插座中取出样本载体板。使用无菌镊子将受伤的 ftSE 转移回用于培养的插入式培养器中。
5. 将受伤的 ftSE 继续在培养箱中培养（37 °C，5% CO₂）₂) 用于再生研究的分析。或者，可在任意时间点取材用于组织学分析。

结果

分离得到的人包皮成纤维细胞（hDF）和人表皮角质形成细胞（hEK）在形态学及典型标志物表达方面均存在差异。hDF 呈典型的梭形形态，而 hEK 的形态则表现为铺路石样形态。在用于 ftSE 实验前，通过免疫组织化学染色对细胞进行了表征（图1）。hDF 对波形蛋白（vimentin）呈阳性表达（图1A），该蛋白是成纤维细胞的标志物。原代 hEK 高度表达早期分化蛋白角蛋白-14（cytokeratin-14）（图1B），但几乎不表达晚期角质形成细胞分化蛋白角蛋白-10（cytokeratin-10）（图1C）。

原代培养后，我们从细胞培养瓶中分离细胞，并用于构建ftSE。ftSE首先在浸没培养条件下培养7天（图2A），随后在气液界面条件下继续培养14天（图2B）。在此过程中，ftSE发生显著收缩。在21天内，hEK细胞持续增殖（图2C-E）。通过调节...

讨论

体外细胞通常在二维细胞培养体系中扩增，其中细胞附着于塑料表面。然而，这些培养条件并不能反映细胞在体内生长的生理三维环境。在三维条件下，细胞能够形成自然的细胞-细胞连接和细胞-基质连接，并在三维空间中迁移。尤其是在皮肤伤口愈合研究中，模拟体内环境对于获得有意义的数据至关重要，因为细胞迁移和基质生成是伤口愈合的关键环节。

为了模拟这些条件，我们开发了由人类原代细胞组成的功能性皮肤等效物（ftSE），其能够同时反映皮肤的真皮层和表皮层。在气液界面培养两周期间，人表皮角质形成细胞（hEK）会形成由处于不同分化阶段的多层角质形成细胞以及角质层（stratum corneum）构成的表皮。此外，真皮层由嵌入于I型胶原水凝胶中的人真皮成纤维细胞（hDF）组成。在培养过程中，hDF会重塑真皮成分，导致模型发生显著收缩（图2B）。

为了制备可重复且标准化的伤口，我们开发了一种自动伤口装置（aWD）。该计算机控制的设备能够创建定义明确且精确的...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DPBS 中的胰蛋白酶 EDTA（1:250，0.5%）	PAA	L11-003	0.05%
Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液	Sigma	D8537
胶原蛋白（0.1% 乙酸中的 6 mg/ml）	本实验室制备
人纤维连接蛋白，血浆来源（50 µg/ml）	Life Technologies	33016-015
插入式培养皿	Nunc	140627
6 孔板	Nunc	140685
24 孔板	Nunc	142485
显微镜载玻片	R. Langenbrinck	03-0070
成纤维细胞培养基（500 ml）：
DMEM，高糖	Life Technologies	11965-092	89%（445 ml）
胎牛血清	Bio & Sell	FCS.ADD.0500	10%（50 ml）
青霉素-链霉素（10,000 U/ml）	Life Technologies	15140-122	1%（5 ml）
角质形成细胞培养基（500 ml）：
角质形成细胞生长培养基 2	Promocell	C-20111	89%（445 ml）
角质形成细胞生长培养基 2 补充剂套装	Promocell	C-39011
青霉素-链霉素（10,000 U/ml）	Life Technologies	15140-122	1%（5 ml）
凝胶中和溶液（250 ml）：
Dulbecco’s 改良 Eagle 培养基，高糖粉末含 L-谷氨酰胺	PAA	G0001,3010	93%（232.5 ml）
鲨鱼软骨来源的硫酸软骨素钠盐	Sigma	C4384-1g	1%（2.5 ml）
胎牛血清	Bio & Sell	FCS.ADD.0500	3%（7.5 ml）
HEPES	Sigma	H3375-1kg	3%（7.5 ml）
皮肤模型浸没式培养基（500 ml）：
角质形成细胞生长培养基 2	Promocell	C-20111
角质形成细胞生长培养基 2 补充剂套装	Promocell	C-39011
胎牛血清	Bio & Sell	FCS.ADD.0500	5%-2%（25 ml-10 ml）
青霉素-链霉素（10,000 U/ml）	Life Technologies	15140-122	1%（5 ml）
皮肤模型气液界面培养基（500 ml）：
角质形成细胞生长培养基 2
角质形成细胞生长培养基 2 补充剂套装	Promocell	C-39011	仅添加补充剂：胰岛素、氢化可的松、肾上腺素、转铁蛋白、CaCl2
青霉素-链霉素（10,000 U/ml）	Life Technologies	15140-122	1%（5 ml）
CaCl2（300 mM）	Sigma	C7902-500g	0.62%（3.1 ml）
组织学：
IHC-Kit DCS SuperVision 2 HRP	DCS	PD000KIT
波形蛋白抗体	Abcam	ab92547
CK14 抗体	Sigma	HPA023040-100µl
CK10 抗体	Dako	M7002
丝聚蛋白抗体	Abcam	ab81468
苏木精-伊红（H&E）染色：
Mayer´s 苏木精	AppliChem	A0884,2500
二甲苯	Sigma Aldrich	296325-4X2L
乙醇	Sigma Aldrich	32205-4X2.5L
HCl	Sigma Aldrich	H1758-500ML
伊红	Sigma Aldrich	E4009-5G
2-丙醇	Sigma Aldrich	I9516-500ML
封片介质	Sigma Aldrich	M1289-10ML