在猪体内心包靶向递送模型中测试药理学制剂的疗效

摘要

我们已建立一种猪模型，用于在心包腔/心包液内实现药物的靶向递送。利用该方法，可研究给药制剂对诱发性心房颤动、相对不应期和/或缺血保护的相对作用效果。

摘要

迄今为止，在开胸手术中用于治疗或预防心律失常的许多药物均会产生不良的全身性副作用。例如，静脉注射的抗心律失常药物可能导致本已存在心脏功能障碍的患者出现全身血压下降。在外科医生进行开胸手术时，通常会创建一个小的手术通道或形成一个心包托架，以提供适宜的操作视野。这种入路为将药物（如抗心律失常药物或缺血预处理剂）直接递送至心肌组织提供了机会，从而避免产生不必要的副作用。

我们建立了一种猪模型，用于测试药物在心包液内靶向递送的效果。在全身麻醉状态下，每只动物均置入Swan-Ganz导管以及左、右心室压力导管，并在右心耳和右心室放置起搏电极。随后进行胸骨正中切开术，建立心包通路吊床，在左心耳置入穿刺式起搏电极，在左心室置入双极起搏电极。利用起搏程控仪和心脏标测系统，测定房室结（AVN）、心房和心室的不应期。此外，使用Grass刺激器诱发心房颤动（AF），并观察AF持续时间。这些指标在治疗前以及心包内给药后30分钟 和60分钟 分别进行测定。部分选定研究还增加了额外的时间点。随后对心脏进行停跳保护，并以四腔工作模式重新启动心脏功能。复跳后持续记录1小时的压力变化和心脏功能。该治疗策略模型使我们能够观察药理学制剂在心脏手术期间及术后对降低心律失常发生率和/或缺血性损伤的作用。

引言

目前在开胸手术中，临床医生会全身性地使用抗心律失常药物及其他治疗药物。然而，这种方法对许多患者可能存在问题，尤其是那些已有临床病情恶化的患者。例如，静脉给药可能导致全身性血压下降或肾功能障碍；此外，还可能引发麻醉管理困难和/或其他长期不良反应。

本文建立了一种用于评估将药物制剂递送至心包腔疗效的模型。例如，该方法可用于测试抗心律失常药物，研究能够增强心脏功能和/或促进心肌在手术后恢复的化合物。与静脉给药相比，将治疗药物靶向递送至心包腔已观察到多种优势：例如，本实验室已证明，局部递送抗心律失常药物（如美托洛尔）可有效预防心律失常的发生，同时最小化对血压的降低作用¹。这种靶向递送策略还可在最小化全身药物浓度的同时，实现局部较高浓度的给药。例如，静脉给予高浓度脂肪酸可能导致溶血，而心包腔递送则可显著降低这一风险²。

本研究范式包含三个主要目标，旨在评估心包给药化合物的有效性：1） 原位 测定房室结、心房和心室在治疗前以及治疗后30分钟和60分钟的不应期 治疗后; 2）相对的 原位 治疗前及治疗后30和60分钟的房颤负荷 处理后（通常会增加额外的时间点） 3) 心脏复苏后的功能分析 ³ 包括血流动力学监测、心率、冠状窦取样的心肌代谢（乳酸和葡萄糖）、每10分钟监测一次的射血分数（EF%）和心室壁厚度（cm） 复苏后，该治疗策略模型使我们能够观察药理学药物在开胸手术或移植期间及术后对降低心律失常和/或缺血性损伤发生率的影响。

方案

本方案已获得明尼苏达大学机构动物护理和使用委员会的批准。

图1. 研究范式示意图 请点击此处查看此图的放大版本。

1. 猪的手术准备

1. 通过肌肉注射给予猪（70-80 kg）替来他明/唑拉西泮（tiletamine/zilazipam）5-7 mg/kg。建立耳静脉通路，通过静脉注射给予甲ohexital 5-7 mg/kg。进行气管插管并实施机械通气。
2. 使用室内空气与氧气的混合气体输送异氟烷（>1.2% MAC），以维持外科麻醉深度。在进行任何操作前，通过检查下颌张力消失并维持麻醉深度高于猪的最低肺泡有效浓度（MAC），确保动物处于深麻醉状态。初始麻醉深度通过确认下颌张力消失来评估，并在手术全程持续监测异氟烷浓度（>1.5 MAC），以确保维持深麻醉状态。
3. 使用电凝和钝性分离技术小心暴露右侧颈外静脉和颈总动脉。将一根8.5F Swan-Ganz导管经颈外静脉插入，充盈球囊至1.5 cc，依次通过右心房、右心室，穿过肺动脉瓣进入肺动脉，直至测得楔压。
4. 放空球囊并保持导管位置不变。使用球囊记录右心房压和肺动脉压。此外，记录楔压或肺内压力（若肺部功能正常，亦可记录左心房压）。
   注意：该导管还可用于估算心输出量。
5. 在颈外静脉内再置入一根5.0F球囊压力导管，并送至右心室，用于连续压力监测。
6. 将另一根5.0F球囊压力导管经颈总动脉插入，跨过主动脉瓣并固定于左心室。所有压力导管均使用含20单位/ml肝素的生理盐水冲洗，并连接至压力传感器，记录来自左心室、右心室（及估算的心输出量）、肺动脉压和右心房压的所有压力数据。
7. 对于外周监测，通过置入18F导管至股动脉分支，实现实时血压或血气监测。在手术过程中记录心率和体温。
8. 使用电凝和钝性分离技术小心暴露左侧颈外静脉。在颈静脉内置入两根11.0F止血导入鞘，并用0号丝线缝合固定。将可操控导管插入导入鞘中。
9. 在X线透视引导下，将主动固定型电极导线分别置于右心耳和右心室心尖部。
   注意：固定型电极导线是一种外科植入的导线，用于连接心脏与植入式起搏器。
10. 将分析仪电缆连接至电极导线，使用起搏程控仪测试起搏夺获。参数设置为8V电压、0.25毫秒脉宽，并将起搏频率设定为比当时自身心率至少高10 bpm。记录每根导线的相对阻抗值。
11. 从剑突开始向胸锁乳突肌附着处附近做正中手术切口。使用胸骨锯切除胸骨前突部分（龙骨状结构），以便进行部分正中胸骨切开。对剩余的胸骨结构使用剪切方式断开。分离胸骨-心包韧带并牵开胸骨。
12. 采用钝性分离法将心包与胸膜壁层分开。在心包上做一条3-5 cm的正中矢状切口，并在四个角（右、左、上、下位置）各缝合一针方结，形成心包吊床。
13. 在左心室心尖区域放置一根临时双极导线，并将一根单极穿刺式临时起搏导线插入左心耳。
14. 在深麻醉状态下通过摘除心脏实施安乐死。

2. 电生理监测的准备工作

1. 心脏标测系统。
   1. 在心脏标测系统中选择一项房颤研究，使用鳄鱼夹将心室心外膜双极起搏导线和心耳内的心外膜导线连接至扩展盒的相应设置。将心电图导联和接地电极片连接至系统。
2. 示波器与Grass刺激器。
   1. 将扩展盒中的左心室双极起搏导线和单极心房导线连接至Grass刺激器，该刺激器同时连接示波器以进行电学验证。
3. 程序化电生理刺激。
   1. 固定右心房导线和右心室导线于起搏器中，将程控仪遥测头置于起搏器上方。选择起搏电极刺激（PES）研究，参数设置为8 V；清除所有患者相关参数。将起搏持续时间设置为8次脉冲，间隔400毫秒（或300毫秒）。

3. 原位 研究

1. 不应期：研究范式。
   1. 在基线水平以及心包给药/药物/对照处理后 30 和 60 分钟时，测定心房有效不应期（AERP）、房室结不应期（AVNERP）和心室有效不应期（VERP）；可根据需要增加额外的时间点。
2. 不应期：程序设定。
   1. 采用猝发刺激诱导程序电刺激（PES）研究参数，先进行 8 次起搏（400 毫秒或 300 毫秒），随后至少进行 300 毫秒的起搏。逐渐缩短起搏间期，直至心室/心房（分别对应）不再产生收缩。该终点通过起搏电极的感知信号确定，从而判定相对不应期。

图 2. EnSite 系统：AERP、AVNERP 和 VERP 的测定 请点击此处查看本图的放大版本。

3. 相对房颤负荷测定：参数
   1. 维持动物心脏处于心房颤动状态，1分钟后，使其持续心房颤动长达10分钟： 即，然后使用直接电极板以5焦耳电击心房以终止房颤。在每个时间点最多诱发房颤10次。注意，在本研究中，房颤定义为一种不规则节律，且P波消失。
4. AF负荷：禾本科植物刺激器与示波器设置
   1. 优化Grass刺激器参数，通过穿刺起搏导联向左心耳（LAA）输送4 Hz、脉冲持续时间为2秒的刺激；使用标准示波器验证刺激参数。向左心耳输送单次脉冲以诱发心房颤动（AF）。

4. 心脏移植与再灌注（移植模型）

1. 主动脉根部插管。
   1. 仔细分离升主动脉周围的心包组织，并去除心包膜。在升主动脉上缝合两个相距 2–3 cm 的 2.0 Ethibond 缝线固定点，并静脉注射 30,000 单位肝素。
   2. 将主动脉根部插管置于两个缝线固定点之间，并固定主动脉。在灌注系统加压状态下，取出导丝斜面，并在插管上夹闭止流夹，防止液体流动。
2. 心脏停搏液准备。
   1. 通过加压袋，以 150 mm/hg 的压力将低温 St. Thomas 心脏停搏液注入升主动脉。将连接至加压心脏停搏液系统的灌注导管通过三通旋塞固定于远端。将三通旋塞连接至主动脉根部插管，通过导管持续冲洗心脏停搏液，并确保其牢固连接至主动脉根部插管。
3. 阻断钳。
   1. 用无创钳夹闭下腔静脉，位置位于膈肌上方 1–2 cm 处。用无创角度钳夹闭升主动脉，位置位于主动脉根部插管上方 1–2 cm 处的升主动脉段。
4. 阻断钳/心脏停搏。
   1. 松开主动脉根部插管上的止流夹，以 150 mm/hg 的压力将心脏停搏液冲向主动脉瓣，使主动脉瓣关闭并灌注冠状动脉。
   2. 夹闭上腔静脉，并在肺动脉上做一小切口，以避免心脏过度加压。待心脏停搏（无收缩）后，切除心脏并从胸腔中取出，置于冷 Krebs-Henseleit 缓冲液浴中（约 3–8 °C）。
5. 再灌注复苏。
   1. 插管大血管，并采用 Visible Heart 方法学（3）准备心脏。当灌注心脏温度达到 37±5 °C 时，通过心外膜片状电极对心室施加 34 J 电击，恢复正常的窦性心律。

5. 体外 研究范式

1. 复苏后持续监测心脏功能60分钟。以二维模式短轴切面（二尖瓣下方左心室层面）持续进行超声心动图监测。
2. 复苏后每10分钟计算一次心室壁厚度和射血分数（见下文）。在-5分钟及评估期间每5分钟从冠状窦采集样本（1 cc）。
3. 监测。
   1. 监测左心室和右心室的血流动力学，包括压力、血流和容积变化。
4. 超声心动图：射血分数。
   1. 将经胸超声探头直接置于心脏表面，获取乳头肌水平短轴切面图像。每10分钟在四腔工作模式下计算射血分数（EF %），计算公式为：（左心室舒张末期容积 − 左心室收缩末期容积）× 100 / 左心室舒张末期容积。
5. 超声心动图：左心室壁厚度。
   1. 复苏后1小时内，每隔10分钟通过乳头肌水平短轴切面测量左心室壁厚度（cm）。使用屏幕卡尺测量左心室四个角的壁厚并取平均值。
6. 心肌代谢。
   1. 将可操控导管置入冠状窦（CS）。在复苏前5分钟及复苏后每5分钟采集CS血液样本1 cc，持续1小时。检测样本中的乳酸和葡萄糖水平；也可同时评估其他血气指标。

结果

这些结果是利用猪模型进行药物靶向递送所能获得数据的典型特征。该数据表明，在输注DHA后，心室有效不应期（VERP）显著延长 原位此外，数据表明与对照组相比，DHA可增加左心室压力 体外DHA处理组心脏的左心室压力在多个时间点均显著高于对照组。该数据证实了测试治疗策略的药理学窗口。 原位 和 体外.

图 3. 心室有效不应期（VERP）的变化。 在心包给予对照剂（生理盐水）或二十二碳六烯酸（DHA）或 DHA 灌注前 5 分钟，以及给予处理或对照后 30 和 60 分钟，测定心室有效不应期（VE...

讨论

在此，我们展示了一种独特的研究方法，用于评估靶向递送化合物进入心包腔的潜在疗效。该研究范式可用于测试当前已上市的药物产品或实验性化合物，从而为多种临床场景提供直接的转化应用价值。在此治疗策略中，将药物递送至心包腔主要有两大临床应用：1）开胸或微创心脏外科手术；以及 2）心脏移植与器官保存。此外，该研究范式包含多个可分析的参数，有助于更深入地理解药物制剂在上述治疗策略中的预测性疗效。在体参数包括：1）房室结（AVN）、心房和/或心室的相对不应期；2）房颤易感性/负荷的评估；以及 3）血流动力学和心率反应。离体参数包括：1）相对射血分数；2）左心室壁厚度变化；3）心脏代谢改变；以及 4）血流动力学和心率变化。我们在此展示的历史数据体现了上述部分参数的结果。这些研究最具意义的转化应用体现在开胸或微创心脏手术，以及移植前的器官获取过程。

更具体而言，在开胸手术期间（无论是微创手术还是正中胸骨切开术后）放置成型的心包托，为局部给药提供了重要机会：即可以使用高于静脉给药的浓度，和/或避免全身性副作用。对于创伤更小的心脏手术（例如，剑突下入路...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
SelectSecure 3830 导线	Medtronic		起搏导线
C304 可偏转导管	Medtronic		用于放置导线的可操控导管
SelectSecure 3830 导线	Medtronic		主动固定式起搏导线
Grass S48 刺激器			电刺激器
Premium 6500 单极起搏			左心耳插入手动起搏导线
EnSite 心脏标测系统			电生理标测系统
CareLink 程控仪 2092	Medtronic		起搏导线程控仪
GEM II 起搏器	Medtronic		起搏器外壳
DLP 主动脉根部插管	Medtronic		移植用主动脉根部插管
C 型臂透视成像系统	Ziehm		透视成像设备
示波器	Tektronix
11F 止血鞘	SafeSheath		止血引入鞘
Swan-Ganz 导管 8.0F	ICU Medical		热稀释导管
静脉造影球囊	Oscor		压力监测
Ultraview SL	Spacelabs		心电图和血压监测设备
s/5 Avance	General Electric		麻醉机
心房 6492 – 单极临时心房起搏导线	Medtronic		临时起搏导线
VIVID i	General Electric		二维心电图仪