高通量定量实时RT-PCR检测法用于确定I型和III型干扰素亚型的表达谱

摘要

本方案描述了一种用于分析I型和III型干扰素（IFN）表达特征的高通量qRT-PCR检测方法。该检测方法能够区分这些基因高度相似转录本之间的单个碱基对差异。通过批量制备和机器人移液操作，确保了检测的一致性和可重复性。

摘要

本报告描述了一种在384孔板中分析十七种人类干扰素（IFN）亚型的qRT-PCR检测方法，该方法结合了高度特异性的锁核酸（LNA）和分子信标（MB）探针、转录本标准品、自动化多通道移液以及平板干燥技术。I型干扰素（IFN）的表达检测，尤其是十二种IFN-α亚型，受限于它们高度相似的序列同源性；同样，III型干扰素（特别是IFN-λ2和IFN-λ3）的序列也极为相近。本检测方法为十七种干扰素亚型转录本的表达分析提供了一种可靠、可重复且相对经济的手段。

引言

I型和III型干扰素（IFN）在机体针对病毒及其他病原性刺激的免疫应答中发挥关键作用，存在于所有脊椎动物中¹。免疫细胞和非免疫细胞均可表达并分泌干扰素，同时也可对干扰素产生应答²。先天免疫感受器（如Toll样受体（TLR）、STING和RIG-I）在识别病原体相关分子模式（PAMP）后，可诱导I型和III型干扰素的表达^3,4。在人类中，I型干扰素包括IFN-β、-ω、-κ以及12种亚型的IFN-α，它们结合于IFNAR1/IFNAR2受体复合物^2,5。III型干扰素包括IFN-λ1、-λ2和-λ3，结合于IL10RB/IL28RA受体复合物²。经典途径中，I型和III型干扰素分别与其特异性受体复合物结合，进而募集STAT1/STAT2异源二聚体，启动干扰素刺激基因（ISG）的转录⁶。ISG参与多种生物学功能，包括抗病毒和抗增殖活性，以及适应性免疫应答的激活⁷。

病原体已进化出多种机制来逃避、破坏和劫持干扰素（IFN）信号通路中的组分，这表明干扰素在先天免疫应答中具有重要作用⁸。例如，痘苗病毒表达一种具有IFNAR1同源性的诱饵受体，可结合并隔离I型干扰素⁹，而类似雅巴病毒则分泌一种糖蛋白，抑制I型和III型干扰素蛋白的功能¹⁰。除了在宿主防御中的作用外，干扰素还参与肿瘤监视以及多种自身炎症性疾病的发病过程：乳腺癌细胞中干扰素表达的沉默会限制免疫监视¹¹，IFN-α的过度产生是系统性红斑狼疮发病的机制之一¹²，而STING的异常激活会导致干扰素过量，从而引发STING相关血管病中的系统性炎症¹³。在治疗方面，干扰素被用于治疗多发性硬化症¹⁴、慢性病毒感染（如乙型肝炎病毒¹⁵和丙型肝炎病毒^16,17）以及某些癌症，例如毛细胞白血病¹⁸和慢性粒细胞白血病¹⁹。关于干扰素在特定生理过程中作用的研究不断揭示出这一细胞因子家族的广泛生物学意义。

I型干扰素（IFN），尤其是IFN-α亚型，通常被视为单一实体^20-23，而非一组密切相关但各不相同的蛋白质。多种IFN物种（包括IFN-α亚型）在脊椎动物进化过程中长期存在²⁴，表明其中至少有一部分亚型具有特定或独特的功能。明确IFN表达的模式可能有助于解析并表征一种或多种亚型的具体功能¹⁷。研究I型和III型IFN亚型的难点在于它们具有较高的序列同源性：12种IFN-α亚型的氨基酸序列相似度超过>50%²⁵，而IFN-λ亚型之间的氨基酸序列相似度则为81–96%²⁶。在本研究所描述的qRT-PCR检测中，分子信标（MB）和锁核酸（LNA）荧光探针能够区分高度相似的IFN亚型序列之间的单个碱基对差异，从而实现对IFN表达特征的鉴定。该检测采用384孔板格式，同时包含定量（转录本标准品）和半定量（看家基因，HKG）分析指标，可分别用于基于转录本拷贝数和∆Cq值的分析。通过自动化多通道移液器实现批量制备，以及将引物/探针（Pr/Pb）组合干燥保存于板上以实现长期储存，显著提高了该检测方法的可重复性、适用性和实用性。

本方案描述了制备384孔qRT-PCR检测板的流程（图1），每块板最多可包含十七种不同的引物/探针（Pr/Pb）组合，用于靶向人干扰素（IFN）亚型（表1）。通过使用引物/探针组合工作液来源板（图2），可在多块384孔检测板的制备过程中实现操作，该过程可采用机器人多通道移液器进行自动化操作。尽管最初的重点是建立用于研究人IFN表达特征的实验方案，但该方法也已应用于恒河猴。尽管板式布局略有不同，且引物/探针组合（表2）各不相同，但制备人源和恒河猴源检测板的整体方法完全相同。通过对该方案进行少量修改，该方法还可用于开发针对其他密切相关基因群的研究检测。

见下图 1 和图 2

见下文表1和表2

方案

1. 标准品系列稀释液的制备（图3A）

注意：将含有 Pr/Pb 引物组靶向序列的线性化质粒进行系列稀释，用作 qRT-PCR 检测的定量标准品。每种 IFN 亚型的标准品系列稀释液足以进行 90 块检测板的实验。用于检测的标准品稀释曲线的四个点位选择为覆盖 Ct 值在 20 至 32 范围内（表 3）。

1. 解冻标准品（50 pM）和鲑鱼精子DNA（SSDNA，10 mg/ml）储备液，涡旋混匀后短暂离心。
2. 通过将51 µl SSDNA与20.3 ml水混合，配制用于17个标准稀释系列的SSDNA/水混合液。
3. 为一个8联PCR管条标记，用于一个标准稀释系列。
   注意：从储备液制备标准品系列稀释液需要2–3小时。
4. 向该管条中的第一管加入190 µl SSDNA/水混合液，向其余五管各加入180 µl SSDNA/水混合液。
5. 取10 µl的50 pM标准品储备液加入含190 µl SSDNA/水混合液的管中，进行1:20稀释，混匀；涡旋振荡并快速离心PCR管条。
6. 从最近一次稀释的管中转移20 µl至系列中的下一管，进行1:10稀释；涡旋振荡并快速离心PCR管条。
7. 重复步骤1.6，直至稀释系列的最后一管已加入标准品。
8. 对每个标准品重复步骤1.3–1.7。

见下表 3

2. 引物/探针（Pr/Pb）和无模板对照（NTC）工作储备液的配制（图3B）

注意：每1.7 ml Pr/Pb组工作储备液和128.6 µl无模板对照（NTC）工作储备液混合物可制备30块检测板。

1. 配制Pr/Pb组工作储备液混合物。
   注意：从储备液配制Pr/Pb组和NTC工作储备液混合物需要2-3小时。
   1. 使用超纯水将引物和探针重悬至100 µM，用于制备储备液。
   2. 标记最多十七个2 ml离心管，每管对应检测中包含的一个Pr/Pb组。
   3. 解冻引物（100 µM）、探针（100 µM）和SSDNA（10 mg/ml）储备液，涡旋混匀并短暂离心。
   4. 使用12.5 µl电子多通道移液器，向每管中加入2 µl SSDNA。向每个Pr/Pb组工作储备液管中加入相应的正向引物、反向引物和探针。人IFN亚型靶向的Pr/Pb组信息见表1，恒河猴Pr/Pb组信息见表2。加入超纯水，使每个Pr/Pb组工作储备液管的终体积达到200 µl。
      注意：所需添加的引物、探针和水的体积取决于该Pr/Pb组在反应中的终浓度要求。
2. 配制NTC工作储备液混合物。
   1. 标记两个5管PCR条排管，用于NTC工作储备液混合物。
   2. 将每种Pr/Pb组各14.3 µl转移至对应的NTC工作储备液混合管中。NTC孔所用Pr/Pb组的组合信息见表4。向每个NTC工作储备液混合物中加入水，使终体积达到128.6 µl。
   3. 涡旋混匀，短暂离心，并将管置于冰上避光保存，或于-20 °C长期保存。

见下表 4

3. 稀释Pr/Pb组工作液。
   1. 在取出用于NTC工作液混合物所需的Pr/Pb组分装液后，加入1.5 ml水，使每管Pr/Pb组工作液的终体积达到1.7 ml。
   2. 涡旋混匀，短暂离心，然后将试管置于冰上避光保存，或于-20 °C长期保存。

3. 使用自动多通道移液器制备384孔检测板

1. 准备用于分装至384孔检测板的Pr/Pb试剂组和NTC混合液的96孔源板。
   注意：从Pr/Pb工作储备液配制源板所需时间少于1小时。每块96孔源板足以制备六块384孔检测板（图3C）。
   1. 涡旋振荡并短暂离心Pr/Pb工作储备液和NTC工作储备液混合物。
   2. 将一块新的96孔板置于预冷的96孔冷却块中，并标记各孔所对应的Pr/Pb试剂组或NTC混合液（见图2）。
   3. 使用250 µl电子多通道移液器向96孔板中加入水：除Target 17的4个孔外，向每个Pr/Pb试剂组孔中加入66 µl水；向Target 17的4个孔中各加入82.5 µl水；向每个NTC混合液孔中加入27.5 µl水。
   4. 向96孔板中对应孔加入正确的Pr/Pb工作储备液：除Target 17的4个孔外，向各Pr/Pb试剂组孔中加入54 µl相应的Pr/Pb工作储备液；向Target 17的Pr/Pb试剂组孔中加入67.5 µl Target 17 Pr/Pb工作储备液；向指定孔中加入22.5 µl相应的NTC工作储备液混合物。
   5. 用粘性板封膜密封96孔板，并在700 × g条件下离心1分钟，确保液体沉至孔底。
   6. 将96孔板放入涡旋混合器中（使用96孔板适配器），在1,000 rpm条件下混合1分钟，随后在700 × g条件下离心5分钟。
   7. 若当天使用，将96孔源板避光保存于4 °C；否则保存于-20 °C直至使用。
2. 使用自动化多通道移液器向384孔检测板中添加Pr/Pb试剂组以制备检测板。
   注意：从一块96孔源板制备六块检测板约需3–4小时。
   1. 在制板前，将冷却巢预冷至4 °C，将板蒸发仪预热至125 °C，底部加热块预热至80 °C，并保持20–25升 每分钟（LPM）的气流。
   2. 开启自动化多通道移液器，通过双击软件图标打开制备IFN检测板的程序。
   3. 设置平台：在位置1放置装满移液枪头的盒，在位置4放置96孔源板，在位置6放置一块新的384孔板。按下播放按钮开始运行。
      注意：运行完成后，每孔将含有5 µl Pr/Pb混合液。
      注意：每孔384孔检测板中最终加入的ssDNA量为0.025 µg。
   4. 轻轻敲击384孔检测板的表面，确保液体位于孔底，然后贴上粘性板封膜。
   5. 在700 × g条件下离心1分钟。撕去粘性板封膜，将384孔检测板放入板干燥仪中，并将384孔歧管正对孔上方放置。
   6. 当384孔检测板内容物完全干燥后，贴上新的粘性板封膜，用铝箔包裹，贴标签，并避光保存于4 °C直至使用。
      注意：检测板可在4 °C下保存至少6个月。
   7. 重复步骤3.2.3–3.2.6，直至完成6块384孔检测板的制备，或96孔源板中的液体耗尽。
   8. 关闭冷却巢，退出软件，关闭自动化多通道移液器。关闭板干燥仪。

4. 加载和运行384孔检测板

1. 准备两种看家基因（HKG）反应孔混合液，每种包含针对一个看家基因的Pr/Pb引物探针组合、SSDNA、PCR预混液和水，用于加入已预先干燥的384孔检测板中图3D).
   注意：配制混合液并加样至检测板需要 1–2 小时。运行检测板所需时间少于 2 小时。
   1. 为每个HKG混合液标记一个1.5 ml离心管。
   2. 将2 µl SSDNA（10 mg/ml）与84.9 µl水混合稀释。取2 µl稀释后的SSDNA，加入11.8 µl水、23 µl预混液和9.2 µl正确的20x HKG Pr/Pr引物探针组至各管中，涡旋混匀后短暂离心。
   3. 使用甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）和泛素C（UBC）作为人源检测中的HKG（参见 材料表）。使用 GAPDH 以及18S核糖体RNA作为恒河猴检测的HKG。
      注意：用于进行检测的HKG可根据具体情况灵活选择，应反映所测试细胞类型中适宜的基因。 GAPDH, 不列颠哥伦比亚大学（UBC），以及 18S 是常用看家基因（HKG）的示例；其他看家基因可能更合适。
2. 制备样本和阳性对照孔反应混合液，包含样本或阳性对照cDNA、主混合液和水，用于加入预置干燥的384孔检测板中。样本和阳性对照混合液需制备足量，以满足21个孔的加样需求（图3D).
   1. 在进行 cDNA 合成之前，按照试剂盒说明书对 RNA 样本进行 DNase 消化处理。
   2. 提前准备样品和阳性对照：取至少 500 ng RNA 进行 cDNA 合成，随后按照制造商说明书用 RNase H 处理（每份样品终体积为 24 µl）。将制备好的 cDNA 储存于 -20 °C，直至使用。使用前解冻样品 cDNA，涡旋混匀并短暂离心。
   3. 向每个24 µl样本和阳性对照管中加入78.8 µl的主混合液和54.8 µl的水。
   4. 涡旋并短暂离心试管。
3. 配制标准品和NTC孔的混合液，包含预混液和水，用于加入到干燥的384孔检测板中（图3D）。标准品混合液的配制：在1.5 ml离心管中，将165 µl水与275 µl预混液混合。无模板对照（NTC）混合液的配制：在1.5 ml离心管中，将52.5 µl水与52.5 µl预混液混合。涡旋振荡并短暂离心各管。
4. 准备一个干燥的384孔检测板，用于加入混合液和样品。
   1. 从4 °C取出一个干燥的384孔检测板，以700 × g离心1分钟。
   2. 将培养板置于预冷的384孔冷却块上，移除粘性板封膜，并标记板上的孔位，以标明不同混合液和样品的加样位置（图1).
5. 将384孔检测板加入标准品孔混合液、标准品、NTC孔混合液、样本、阳性对照和HKG混合液（图3E). 使用前对所有溶液进行涡旋振荡并短暂离心。
   1. 使用30 µl电子多通道移液器，将6 µl标准品混合液加入每个标准品孔中。使用12.5 µl电子多通道移液器，将1.5 µl相应的标准品系列稀释液加入指定孔中。
   2. 使用30 µl电子多通道移液器，向每个NTC孔中加入7.5 µl NTC孔混合液。使用30 µl电子多通道移液器，向指定孔中加入7.5 µl样本。使用12.5 µl电子多通道移液器，向指定孔中加入2.5 µl HKG引物/探针混合液。
   3. 使用30 µl电子多通道移液器，向所有空孔中加入7.5 µl剩余的水和预混液混合物；仅加入7.5 µl水亦可。
   4. 用光学粘性封膜密封384孔检测板，并在700 × g下离心1分钟。将密封后的384孔板在涡旋混合器中以2,600 rpm涡旋振荡2分钟，然后在700 × g下离心5分钟。
   5. 将密封的384孔检测板放入qRT-PCR仪中，打开该检测布局的模板并开始运行。
      注意：结果可导出为电子表格或文本文件，以便进行分析。
   6. 使用以下最佳的热循环仪反应条件进行检测：i) 50 °C 2分钟，ii) 95 °C 10分钟，iii) 95 °C 25秒，iv) 59 °C 1分钟。重复步骤iii和iv共40个循环。
   7. 将qRT-PCR平台的原始数据导出至电子表格应用程序。将每组4点标准品数据绘制成标准曲线以评估线性关系。通过计算∆Cq值或基于4点标准曲线的拷贝数进行数据分析。²⁷.

见下图 3

结果

所述的qRT-PCR检测可用于分析多种细胞类型和条件下I型和III型干扰素（IFN）的表达模式。例如，研究人员分析了来自6名供体的外周血单个核细胞（PBMC）在TLR配体刺激下的人I型和III型IFN表达特征；所用配体包括聚肌胞苷酸（poly I:C，25 μg/ml）、脂多糖（LPS，10 ng/ml）、咪喹莫特（imiquimod，10 μM）以及CpG寡核苷酸（1 μM）（图4）。数据使用电子表格应用软件进行分析，并以雷达图形式展示，其中IFN-α亚型按照其蛋白序列系统发育树的顺序顺时针排列²⁷。人IFN表达的雷达图采用对数刻度表示，该刻度基于检测设计中包含的两种不同分析方法：相对于持家基因（HKG）归一化的绝对Cq值（ΔCq），以及每微克（μg）总RNA中模板的拷贝数。拷贝数数值由转录本标准曲线的结果计算得出。数据表明，TLR激动剂诱导的人IFN表达特征具有配体特异性。

见下图 4

如人类干扰素（IFN）表达谱所示，恒河猴的I型和III型干扰素表达谱也具有TLR配体特异性。来自3名供体的外周血单个核细胞（PBMC）分别用聚肌胞苷酸（poly I:C，50 μg/ml）、脂多糖（LPS，10 μg/ml）和咪喹莫特（imiquimod，10 μg/ml）刺激3小时（图5）。未刺激细胞在基础状态下的IFN亚型表达水平较低。LPS和poly I:C仅诱导少量IFN亚型表达。相比之下，咪喹莫特刺激引起的IFN表达水平较高，且亚型表达谱更广泛。三种TLR激动剂均能增强IFN-β和IFN-λ1的表达²⁸。

见下图 5

图 1：包含十七组引物/探针（Pr/Pb）的 384 孔检测板布局。 靶标编号对应一组引物/探针（Pr/Pb）。四点标准曲线（深灰色三角形）加入第 1 至第 5 列。内参基因（HKG）引物/探针组（白色背景）加入第 6 和第 7 列。其余第 8 至第 24 列分别对应十七组特定的引物/探针（Pr/Pb）组。样本从第 6 至第 24 列加入 A 至 P 行（黑色箭头所示）。第 5 列底部的两个孔（O5、P5）仅加入水和主混合液。 请点击此处查看该图的高清版本。

图2：含十七组Pr/Pb引物探针组合的96孔源板布局。 目标编号对应一组Pr/Pb引物探针组合。黑色箭头表示同一组Pr/Pb引物探针组合被加入多个孔中。NTC混合液被加入指定孔位（深灰色背景）。带有斜线的两个孔（F3、G3）未使用。请点击此处查看该图的高清版本。

图 3：qRT-PCR 检测方案中特定步骤的示意图。 A–E 图示了该方案的部分关键步骤。(A) 步骤 1：标准品连续稀释液的制备。(B) 步骤 2：Pr/Pb 和 NTC 工作储备混合液的制备。(C) 步骤 3.1：制备 96 孔工作储备板，包含 Pr/Pb 组和 NTC 混合液。(D) 步骤 4.1–3：为 384 孔检测板加样制备混合液。(E) 步骤 4.5：向 384 孔检测板加样。示意图按从左上至右下的顺序阅读。干扰素（IFN）检测所用试剂储存于 -20 ^oC，列于左侧栏中；各操作步骤之间以横线分隔。请点击此处查看该图的高清版本。

图4：外周血单个核细胞（PBMC）中人干扰素（IFN）表达特征在不同TLR配体刺激下的反应存在差异。 使用TLR配体刺激PBMC，并提取RNA进行qRT-PCR分析。图中显示了来自6名供体的多聚I:C（25 μg/ml）刺激8小时（红色方块）、LPS（10 ng/ml）刺激4小时（绿色三角形）、咪喹莫特（10 μM）刺激16小时（紫色菱形）、CpG（1 μM）刺激16小时（黑色圆形）以及16小时未刺激对照（蓝色圆形）条件下峰值反应的几何平均值，以相对于持家基因UBC的ΔCq值（左图）或每微克RNA中的拷贝数（右图）的log₁₀尺度表示。IFN-α亚型根据其氨基酸序列相似性的系统发育图进行排序。该图最初发表于《免疫学与细胞生物学》²⁷。

图5：恒河猴外周血单个核细胞（PBMC）中干扰素（IFN）表达特征在不同TLR配体刺激下的响应存在差异。 来自三只恒河猴（以方形、菱形和三角形标识）的PBMC从全血中分离后，分别用脂多糖（LPS）（10 μg/ml）、聚肌胞苷酸（poly I:C）（50 μg/ml）或咪喹莫特（imiquimod）（10 μg/ml）进行刺激。细胞在刺激前0小时（空心图形）或TLR刺激3小时后（实心图形）收集，用于检测IFN表达水平。I型、II型和III型IFN的转录水平以相对于持家基因GAPDH的ΔCq值（左图）或每微克RNA中的拷贝数（右图）表示，并以log₁₀尺度展示。该图最初发表于《干扰素与细胞因子研究杂志》²⁸。

表 1：人干扰素引物/探针序列及反应信息。 请点击此处查看此表的高清版本。

表2：恒河猴IFN引物/探针组序列及反应信息。 请点击此处查看此表格的放大版本。

	质粒浓度 (fM)
	A	B	C	D
IFN-α1	25	2.5	0.25	0.025
IFN-α2	25	2.5	0.25	0.025
IFN-α4	2500	250	25	2.5
IFN-α5	25	2.5	0.25	0.025
IFN-α6	250	25	2.5	0.25
IFN-α7	250	25	2.5	0.25
IFN-α8	250	25	2.5	0.25
IFN-α10	25	2.5	0.25	0.025
IFN-α14	25	2.5	0.25	0.025
IFN-α16	250	25	2.5	0.25
IFN-α17	25	2.5	0.25	0.025
IFN-α21	25	2.5	0.25	0.025
IFN-λ1	25	2.5	0.25	0.025
IFN-λ2	25	2.5	0.25	0.025
IFN-λ3	250	25	2.5	0.25
IFN-β	25	2.5	0.25	0.025
IFN-ω	250	25	2.5	0.25

表3：标准稀释系列浓度信息。

	添加的 IFN Pr/Pb 组	添加的水体积 (ml)
NTC 1	IFN-β, -ω, -λ3	85.7
NTC 2	IFN-α1, -α5	100.0
NTC 3	IFN-α2	114.3
NTC 4	IFN-α4	114.3
NTC 5	IFN-α7	114.3
NTC 6	IFN-α6, -α8, -α10	85.7
NTC 7	IFN-α14, -α16	100.0
NTC 8	IFN-α17	114.3
NTC 9	IFN-α21, -λ1	100.0
NTC 10	IFN-λ2	114.3

表4：NTC工作储备液混合物信息。

讨论

本报告描述了一种在科研实验室环境中用于检测一组高度相似基因转录水平的检测方法的设计、批量生产及分析策略。本文报道的高通量qRT-PCR检测方法可高度特异性地检测IFN-和λ亚型。该方法包含两个关键方面：一是设计能够区分同源基因家族中不同成员的引物/探针（Pr/Pb）组合，二是建立一个可生产稳定且一致的384孔预装Pr/Pb组合检测板的生产平台。qRT-PCR探针采用了结构修饰（分子信标，MB）或化学修饰（锁核酸，LNA）策略以提高其特异性²⁹。在恒河猴检测体系的两对引物组中（表2），引物序列中引入了扩增阻碍突变系统（ARMS），以进一步增强特异性³⁰。尽管通常为提高qRT-PCR反应的特异性应优先靶向外显子-外显子连接区域，但由于Ⅰ型IFN基因不含内含子，此策略不可行。因此，PCR反应中将扩增基因组DNA，故需在RNA提取后通过DNase处理将其降解。

Pr/Pb 引物组的靶区域被限定为每种干扰素（IFN）成熟肽的编码区。由于 IFN-α 亚型之间，尤其是成熟肽区域的序列高度相似，在某些情况下，为了确保特异性，不得不在灵敏度上做出妥协。IFN-α17 就是典型例子，其成熟肽转录本与其他 IFN-α 亚型相比，仅有四个独特的碱基。针对 IFN-α17 的引物设计必须结合多个亚型的转录本，因此特异性只能依赖于探针。结果是，PCR 反应会扩增除 IFN-α17 以外的其他亚型，从而消耗大量 PCR 试剂，并降低 IFN-α17 特异性探针的荧光信号强度。针对 IFN 等高度相似基因设计灵敏且特异的 Pr/Pb 引物组时，另一个挑战在于 GenBank 数据库中注释的序列在设计时可能并不完整或全面。这一点在 IFN-α17 上再次体现，新近注释的序列与设计时数据库中的序列版本无法完全比对。因此，在针对尚未深入研究的基因设计 Pr/Pb 引物组时，定期核查目标基因的最新注释序列是十分必要的。最后，必须确保 Pr/Pb 引物组不会扩增可能被转录但不被翻译的假基因。

设计好引物/探针（Pr/Pb）组合后，下一步的挑战是在一个384孔板上对十七种不同的Pr/Pb组合优化PCR反应条件。转录本标准品在检测Pr/Pb组合特异性方面至关重要，并且对于协调大量不同PCR反应的qRT-PCR条件必不可少。通过转录本标准品对Pr/Pb组合进行测试，可确定其扩增效率和灵敏度；在某些情况下，可能需要使用表达高度相似假基因的质粒，以确保该Pr/Pb组合能够特异性地检测功能基因的转录。此外，转录本标准品还提供了定量分析手段（转录本数量），而不仅仅是相对于看家基因的半定量分析（ΔCq）。

使用机器人多通道移液系统将96孔源板中的样品移取至多个384孔检测板中，可提高板间结果的精确性和一致性。鲑鱼精子DNA（SSDNA）作为载体，可稳定并长期保存Pr/Pb试剂组，同时将分装至孔板中的试剂进行干燥处理也能实现类似效果。对孔板进行干燥还可减少获得可重复结果所需的反应体积，从而保护珍贵样品并减少昂贵试剂的使用。通过上述步骤制备的孔板批次可在六个月以上的时间内保持高精度和一致性。

在完成平板制备后，质量控制措施对于检测一批平板的一致性至关重要。为此，需在每块平板上额外运行四组标准品。“5x标准”平板用于追踪实验性能，并生成一个数据集，用于与单个平板上的标准品结果进行比较。在实验设计过程中，每种标准品会进行10次10倍稀释，但由于空间限制，每块检测平板以及5x标准平板上仅使用其中四个点构建标准曲线。此外，每块平板还应包含一个阳性对照，以确保平板结果的有效性。

通常，从一个Pr/Pb来源板制备六个检测板需要3-4小时；在研究实验室中，单日完成十二块板的制备是可行的。由于每块人干扰素（IFN）亚型检测板可检测十七个Pr/Pb组合，并可容纳十五个实验样本，因此一天的组装工作所产生的板批次最多可生成3,060个实验数据点。来自qRT-PCR平台的原始数据可通过电子表格应用软件中的编程脚本进行处理和整合，自动填充预设的分析模板。该方法最大限度减少了手动数据录入，从而避免了复制错误，并使研究人员能够专注于数据分析而非数据整理。如本文所述，这种高通量qRT-PCR检测可用于测定人或恒河猴样本中干扰素亚型的表达，也可经调整后用于其他物种或同源基因集。该检测板布局具有灵活性，用户可根据特定细胞类型或模型系统更换引物/探针组合，以定制目标基因。该方法可用于在病原体研究的细胞培养模型或疾病模型中的患者样本中测定IFN表达特征，以阐明免疫应答中涉及的信号传导机制。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.2 ml PCR管条	Eppendorf (Westbury, NY, USA)	E0030 124 286
12通道384等量电子移液器，0.5–12.5 µl	Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)	14-387-139	*已停产
12通道384等量电子移液器，1–30 µl	Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)	14-387-137	*已停产
12通道电子移液器，5–250 µl	Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)	14-387-118	*已停产
2.0 ml 微型离心管，无菌	Celltreat Scientific Products (Shirley, MA, USA)	229446
8通道电子移液器，15–1250 µl	Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)	14-387-115	*已停产
一次性试剂储液槽	VWR International (Radnor, PA, USA)	89094-668	25 mL 储液槽，带2个分隔
E-Centrifuge	Wealtec Corp. (Sparks, NV, USA)	1090003
真核生物18S rRNA (18S)	Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)	Hs99999901_s1	恒河猴HKG引物/探针组
固定转速迷你涡旋混合器	Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)	02-215-360
透气性压敏板密封膜	Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)	AB-0580	板制备过程中使用的一次性板密封膜
甘油醛-3-磷酸脱氢酶 (GAPDH)	FBR (Silver Spring, MD, USA)	定制订单	人HKG引物/探针组
甘油醛-3-磷酸脱氢酶 (GAPDH)	Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)	Rh02621745_g1	恒河猴HKG引物/探针组
Hudson Solo自动化多通道移液器	Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA)	800200	配备384孔冷却模块的改装型号
线性化质粒 (IFN基因)	Aldevron (Fargo, ND, USA)	定制订单	货号3000、3580；用于检测标准品
LNA抑制剂	Exiqon (Woburn, MA, USA)	定制订单	货号500100
LNA探针	Sigma-Proligo (St. Louis, MO, USA)	定制订单	材料编号VC00023
Matrix过滤移液吸头，12.5 µl	Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)	14-387-193
Matrix过滤移液吸头，30 µl	Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)	14-387-196
Matrix TallTip加长移液吸头，1,250 µl	Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)	14-387-160
Matrix TallTip加长移液吸头，250 µl	Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)	14-387-152
带条形码的MicroAmp光学384孔反应板	Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)	4309849
MicroAmp光学96孔反应板	Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)	N8010560
MicroAmp光学压敏膜	Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)	4311971	qRT-PCR运行前用于密封反应板的压敏膜
Microsoft Excel 2010电子表格	Microsoft (Redmond, WA, USA)	Office 2010	Visual Basic编程语言
MixMate涡旋混合器	Eppendorf (Westbury, NY, USA)	5353 000.014	二维板式涡旋混合装置
分子信标探针	FBR (Silver Spring, MD, USA)	定制订单
PCR冷却器，用于96孔板和PCR管的无冰冷藏系统	Eppendorf (Westbury, NY, USA)	Z606634-1EA
板干燥器（歧管）	NIH研究服务办公室机械与电气设计制造部 (Bethesda, MD, USA)	定制订单
引物组	FBR (Silver Spring, MD, USA)	定制订单
pUC57质粒DNA	Genescript (Piscataway, NJ, USA)	SD1176
无RNase 1.5 ml 微量离心管	Life Technologies (Grand Island, NY, USA)	AM12400
无RNase DNase试剂盒（50）	Qiagen (Valencia, CA, USA)	79254
RNase H	New England Biolabs (Ipswitch, MA, USA)	M0297L
RNeasy Mini试剂盒（250）	Qiagen (Valencia, CA, USA)	74106
机器人移液吸头（透明、预灭菌吸头）	Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA)	800350-S
鲑鱼精子DNA溶液	Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)	15632-011
SoftLinx Version V	Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA)	定制订单	用于编程移液步骤的软件
TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2x)，不含AmpErase UNG	Life Technologies (Grand Island, NY, USA)	4352042
ABgene压敏板密封膜	Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)	AB0580
泛素C (UBC)	Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)	Hs01871556_s1	人HKG引物/探针组
Verso cDNA合成试剂盒	Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)	AB1453B
ViiA 7实时荧光定量PCR系统	Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)	4453536
超纯水	Quality Biological, INC. (Gaithersburg, MD, USA)	351-029-101
Zipvap 384（板干燥器加热元件）	Glas-Col LLC (Terre Haute, IN, USA)	384-109A	板干燥器