本方案描述了一种在小鼠肿瘤模型中对肿瘤微环境内白细胞亚群进行详细评估的方法。将表达chemerin的B16黑色素瘤细胞皮下植入同源小鼠体内。随后对来自肿瘤微环境的细胞进行染色，并通过流式细胞术进行分析，从而实现对白细胞亚群的详细分析。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
特化的免疫细胞浸润肿瘤微环境，调控肿瘤的生长与存活。 恶性细胞必须逃避或破坏抗肿瘤免疫应答，才能存活并增殖。肿瘤可利用多种免疫“逃逸”机制，包括招募诱导免疫耐受的树突状细胞（DC）、免疫抑制性调节性T细胞（Tregs）以及髓源性抑制细胞（MDSC），从而抑制抗肿瘤的细胞毒性免疫应答。相反，抗肿瘤效应免疫细胞则可延缓恶性肿瘤的生长与扩散：具有免疫刺激功能的树突状细胞、具有固有抗肿瘤免疫能力的自然杀伤细胞以及细胞毒性T细胞，均可参与肿瘤抑制。促肿瘤与抗肿瘤白细胞之间的平衡最终决定了转化细胞的行为与命运，大量人类临床研究已证实了这一点。因此，对肿瘤微环境中白细胞亚群进行详细分析变得日益重要。本文介绍一种在小鼠肿瘤模型中分析肿瘤微环境内浸润性白细胞亚群的方法。将小鼠B16黑色素瘤细胞接种于C57BL/6小鼠皮下。在指定时间点，切除肿瘤组织及周围皮肤 整块 并处理成单细胞悬液，随后进行多色流式细胞术染色。通过使用多种白细胞亚群标记物，我们能够比较对照组与表达chemerin肿瘤中浸润性白细胞亚群的相对百分比。研究人员可利用该工具研究肿瘤微环境中的免疫细胞分布情况，若结合传统的游标卡尺测量肿瘤生长尺寸的方法，有望进一步阐明免疫细胞组成变化对肿瘤生长的影响。该技术可应用于任何可将肿瘤及其微环境完整切除并进行处理的肿瘤模型。
引言
肿瘤生长与促进和消退之间的平衡，在一定程度上取决于肿瘤微环境中促肿瘤和抗肿瘤浸润性白细胞的平衡1,2。为了研究肿瘤微环境（TME）并特异性鉴定其中浸润的白细胞亚群，我们建立了一种用于评估小鼠皮下肿瘤模型中肿瘤的方法。研究肿瘤微环境的重要性已在文献中得到广泛认可和支持。大量研究表明，促肿瘤与抗肿瘤浸润性免疫细胞的平衡会影响肿瘤生长的结局，这不仅见于小鼠研究，也在人类研究中得到证实（详见综述3,4）。例如，Curiel et al. 发现，卵巢癌患者临床预后恶化与肿瘤内浸润的调节性CD4+ T细胞（Tregs）比例升高相关5。我们之前的研究也表明，在小鼠黑色素瘤模型中，一种新型白细胞趋化因子可影响白细胞亚群的比例6，且该比例变化与肿瘤生长减缓相关。因此，对肿瘤内白细胞亚群的详细分析目前已被更广泛地认识，并日益重要。
评估肿瘤微环境中浸润性白细胞的方法有多种；例如，一些研究团队已构建了表达各种荧光蛋白的转基因小鼠，用于成像肿瘤微环境（TME）7，此外还包括对保存的组织切片进行经典的免疫组织化学和免疫荧光分析8，以及采用多种成像方式如磁共振成像（MRI）、正电子发射断层扫描（PET）、共聚焦显微镜9-11——其中部分技术具备活体动态监测能力10,12。这些方法可结合多种分子成像探针使用，例如用于标记免疫细胞的纳米颗粒13或新型对比剂14。我们的方法基于流式细胞术，具有多项优势。首先，该方法可对整个肿瘤微环境进行取样；在分析时，将手术完整切除皮下肿瘤及其周围组织进行处理，从而避免了单个肿瘤内部可能存在的取样偏差，实现对整个肿瘤更“全局性”的分析。其次，利用多色流式细胞术分析白细胞亚群，可更精确地评估浸润性白细胞的表型特征。根据所使用的荧光颜色数量，能够识别出非常特异的细胞亚群。这一点尤为重要，因为在特定细胞类型甚至广义亚型分类中，存在多个功能迥异的白细胞亚群，这些差异可能在决定肿瘤命运方面具有重要意义。例如，浆细胞样树突状细胞（pDC）已被证实参与抗肿瘤免疫15。然而，pDC中的CCR9+亚群被证明具有免疫耐受诱导功能16，调节此类亚群的比例可能对肿瘤生长产生影响。
我们的方法适用于可整体切除的皮下或其他肿瘤。en bloc。在我们的操作中，肿瘤均在动物安乐死后统一切除。然而，可以设想的是，正如某些研究所采用的方法，皮下肿瘤可在生存手术中被完全切除，并缝合周围皮肤17，从而允许对动物进行进一步观察。随后对切除的肿瘤进行分析，因此结果仅代表肿瘤发育过程中的一个时间点。虽然这种方法有助于深入观察肿瘤微环境，但它所呈现的毕竟只是对一个动态过程的静态快照。然而，随后可将分离的白细胞（例如通过磁性分选或密度梯度法）与肿瘤上皮和间质成分分开进行分析，或用于其他功能性实验，以进一步明确其表型特征，如先前研究所述18。因此，该方法适用于任何希望了解在特定时间点肿瘤微环境中白细胞组成的科研人员，无论是在自然病程中，还是在特定治疗干预之后。尽管我们未进行此类操作，该方法的变体还可能用于单独分析肿瘤的特定区域。例如，根据肿瘤的大小，可将周边区域从中央可能坏死的核心部分分离，从而为研究人员提供对肿瘤微环境更精确的空间分区视图。
在肿瘤免疫学这一快速发展的领域中，无疑将有越来越多的研究在小鼠肿瘤模型中评估新型免疫调节剂。已有数篇报告强调了特定白细胞在肿瘤微环境与外周环境中的功能差异。例如，Shafer-Weaver et al. 在小鼠模型中发现，抗原特异性的效应性CD8+ T细胞在外周具有活性，但一旦迁移至肿瘤微环境，便会转化为CD8+ T抑制细胞19。这一转化部分归因于TGFβ，但可能还涉及其他因素。因此，直接评估肿瘤内白细胞亚群的数量、比例及其功能状态，将更准确地反映特定免疫调节对肿瘤命运的影响。
我们的技术能够对肿瘤进行详细分析，并为研究人员提供了比以往方法更精确地识别白细胞群体变化的机会。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
注意：所有动物实验均按照斯坦福大学、帕洛阿尔托退伍军人事务医疗保健系统（Palo Alto VA HCS）以及美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）机构动物护理与使用委员会批准的指南进行。
1. 样本采集与处理的准备工作（所需时间：约10-15分钟）
- 将小鼠 B16F0 黑色素瘤细胞（0.5–1 × 106）皮下接种于雌性 C57BL/6 小鼠腹部中线位置或其附近，操作方法如前所述6。也可选择在其他解剖部位（e.g. 腋窝、乳腺脂肪垫等）接种肿瘤细胞。
注意：本方案可用于使用和评估任意数量的肿瘤（移植性或自发性）。例如，在 C57BL/6 小鼠中常用的其他同源肿瘤包括结肠癌细胞系 MC38、Lewis 肺癌（LLC）以及前列腺癌 TRAMP-C2 细胞系。尽管将人源异种移植瘤接种于免疫缺陷小鼠后也可采用此方法进行评估，但需注意，肿瘤浸润白细胞的特征将因宿主小鼠的免疫缺陷状态而发生相应改变。- 使用完全培养基（e.g. 含 10% FBS 及添加剂的 RPMI）或其他合适的含蛋白缓冲液（e.g. HBSS 或 PBS 加 1% FBS 或 1% BCS）。在处死小鼠前将培养基或缓冲液预冷至 4 °C。
- 为切除的肿瘤准备收集管和过滤器，并将其置于冰上。
- 每例待切除肿瘤使用一个 50 ml 圆底离心管，在其中插入一个 40–70 µm 的细胞悬液过滤器。或者，可使用带金属滤网的 15 ml 圆底离心管。使用 5 ml 注射器推杆或粗笔在 15 ml 管顶部压出杯状滤器结构。
- 准备肿瘤切除与处理所需的器械；使用手术镊和精细剪刀进行肿瘤切除与处理。每次切除或处理不同肿瘤样本之间，使用 70% 乙醇清洁器械。当样本数量较多时（e.g. >10），建议多位研究人员同时处理样本，以避免不同肿瘤样本之间的处理时间出现显著差异。
2. 肿瘤切除（所需时间：约5分钟/肿瘤）
- 使用二氧化碳或其他经批准的方法对荷B16肿瘤的小鼠进行个体安乐死。
- 将小鼠固定在手术台上。用70%乙醇喷洒肿瘤区域，并擦去多余液体；这有助于防止毛发扩散。对于非裸鼠，根据需要在切除前剃除肿瘤周围皮肤区域的毛发。
- 使用镊子和剪刀整块切除皮下肿瘤（en bloc），包括其上方及周围皮肤。所切除的“边缘”皮肤范围可适当调整，但通常在肿瘤周围切除2–3 mm的皮肤。
- 在此时称量切除的肿瘤（可包含或不包含周围皮肤）。将切除的皮肤/肿瘤组织置于固定在塑料锥形管内的滤膜中。
3. 制备单细胞肿瘤悬液（所需时间：约5-7分钟/肿瘤）
- 使用镊子和剪刀切碎肿瘤及覆盖/周围的皮肤组织。用剪刀将样本剪碎，直至所有较大的组织块被处理成1-2 mm大小的片段。
注意：通常处理完整的肿瘤；对于较大的肿瘤，也可选取具有代表性的肿瘤组织片段进行剪碎和处理。 - 使用一次性5或10 ml注射器的推杆，将剪碎的肿瘤组织在固定好的滤膜上进行机械性解离。
- 使用移液器，用5–10 ml冷培养基或缓冲液冲洗已处理的肿瘤组织，使单个细胞通过滤膜滤出。
- 重复上述两个步骤数次，确保相同大小的肿瘤所使用的冲洗次数和总体积大致相同。
- 在冲洗处理后的肿瘤组织后，应观察到皮肤的小碎片和/或其他结缔组织残留在滤膜上。
- 对于仅靠机械解离可能不足以充分解离的肿瘤，可在剪碎前使用胶原酶和/或其他酶进行消化处理，以获得更充分的单细胞悬液。但需注意，此类消化方案可能影响表面抗原的表达20，因此在解读相关结果时应谨慎。
- 加入培养基或缓冲液洗涤细胞，并在4 °C下以500 × g离心5分钟，收集细胞沉淀。
4. 单细胞悬液的流式细胞术染色（所需时间：约30-60分钟）
- 将细胞重悬于预冷的 FACS 缓冲液（PBS + 1% FBS）中。
- 使用台盼蓝和血细胞计数板，或自动细胞计数仪，计数活细胞数量。
- 确定每单位体积的总活细胞产量。该数据可结合流式细胞术（FACS）数据，用于推算肿瘤浸润白细胞的绝对数量。
- 确定用于 FACS 染色和分析的细胞数量。该数量受多种因素影响（例如 肿瘤组织学类型、肿瘤年龄和大小、浸润白细胞的平均百分比等）。
注意：在 B16 黑色素瘤中，我们发现肿瘤浸润白细胞（TIL）占肿瘤细胞的比例较低（通常 <5%）。因此，通常通过 FACS 收集至少 1 × 106 个总肿瘤细胞（肿瘤细胞 + 浸润白细胞）用于分析。- 根据台盼蓝染色的计数结果，计算用于 FACS 染色的细胞体积。例如，若 TIL 通常占总肿瘤细胞的 5%（许多肿瘤细胞在台盼蓝染色中呈死亡状态），则在计算待染色的单细胞悬液总量时应将此因素考虑在内。
- 对于较罕见的白细胞亚群（例如 CCR9+ pDC），由于其在单细胞悬液中的频率相对较低，应使用更多的总肿瘤细胞数量（例如 2–3 × 106）进行 FACS 染色。
- 对肿瘤单细胞悬液进行 FACS 染色。
- 为区分活细胞与死细胞，可使用可固定的染料或非固定性染料（例如 碘化丙啶）。若未进行活/死细胞区分染色，则需谨慎操作，以防抗体发生非特异性结合。
- 按照标准 FACS 染色方案，对细胞悬液进行特定白细胞亚群的染色。在加入抗原特异性抗体前，使用含 1% 大鼠血清和 Fc 封闭剂（抗 CD16/32）的 PBS/FBS 封闭细胞 10 分钟，以减少抗体的非特异性结合。同时应设置相应的同型对照抗体，以确保染色的特异性。
- FACS 染色完成后，使用 4% 甲醛或其他类似固定剂对样本进行固定。将样本置于 4 °C 避光保存（以避免荧光染料淬灭），直至上机采集与分析。
注意：长期储存固定后的样本可能导致荧光信号和强度发生变化21。 - 在流式细胞仪上采集样本。最佳仪器设置参数将根据仪器类型及激光/检测器配置的不同而有所差异。
注意：即使使用同一台仪器，不同实验之间也可能存在变异。因此，在每次实验的 FACS 采集与分析前，应进行适当的仪器校准（例如 使用校准微球），以确保补偿设置正确。
- 白细胞亚群的分析
- 使用 FACS 数据分析软件进行数据分析。若进行了活/死细胞染色，首先设门排除死细胞。使用针对白细胞特异性标志物的抗体（例如 抗 CD45）在活细胞中鉴定白细胞。
- 随后，根据染色方案采用不同的设门策略来鉴定特定亚群。例如，为鉴定 CD4+ T 细胞，可从 CD45+ 细胞群中选择侧向散射光低（SSClo）的区域，并进一步选择 CD19-CD3+ 细胞；在此基础上可识别出 CD4+ T 细胞22。
- 对数据进行分析，并以多种方式呈现结果，以确保数据一致性并识别模式或趋势（即 使用总数、百分比或比值来量化各亚群）。
注意：例如，我们分析了所收集的总肿瘤细胞中活 CD45+ 细胞所占的百分比（图 1）。此外，我们还计算了各白细胞亚群（如 CD4+ T 细胞）在肿瘤内的百分比，并在对照组与实验组之间以比值形式进行比较（图 3）。
- 使用 FACS 数据分析软件进行数据分析。若进行了活/死细胞染色，首先设门排除死细胞。使用针对白细胞特异性标志物的抗体（例如 抗 CD45）在活细胞中鉴定白细胞。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
我们的结果表明，在小鼠B16肿瘤中强制过表达chemerin可增加肿瘤浸润白细胞（TILs）的比例。此外，还发现chemerin表达与肿瘤微环境中白细胞亚群相对比例的变化相关。经Pachynski et al.6许可重印。
图1显示，与对照组相比，表达chemerin的肿瘤内总CD45+细胞（肿瘤浸润白细胞，TILs）数量显著增加，该结果通过流式细胞术分析第17天切除的肿瘤组织获得。通过染色的冷冻切片B16肿瘤组织进行免疫荧光分析，进一步证实了CD45+细胞浸润的增加（图2）。
进一步分析FACS数据表明，在趋化素（chemerin）过表达的肿瘤中，与对照肿瘤相比，自然杀伤细胞（NK细胞）、T细胞以及传统树突状细胞（cDC，Lin-B220-CD11c+）的比例平均有所上升（图3）。具有抑制免疫应答作用或可能抑制免疫应答的白细胞亚群比例则相对降低，特别是髓源性抑制细胞（MDS...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
对肿瘤微环境进行详细分析，对于确定免疫调节的机制和效应至关重要。随着免疫治疗药物在人类临床领域的日益增多，了解这些药物对肿瘤浸润性白细胞亚群的影响，已成为阐明其作用机制的必要环节。在人类研究中，获取和分析用于白细胞亚群分析的肿瘤组织常面临临床和/或实际操作上的困难，因此通常转而分析外周免疫反应。在动物模型中开展临床前研究，可使研究人员更全面地探索免疫调节剂对肿瘤内部免疫系统的影响，从而进一步揭示可能影响临床结局的相关机制。
我们的技术可对肿瘤浸润性白细胞进行详细分析。由于能够取样整个肿瘤微环境，因此可以更全面地评估肿瘤内的免疫细胞分布情况。最终，促肿瘤的抑制性细胞与抗肿瘤的效应细胞之间的平衡可能对肿瘤生长及临床结局产生显著影响4。因此，此类分析有助于研究人员获得关于肿瘤中具体白细胞亚群的详细信息。这些详细数据可与其他功能性数据结合使用，进一步阐明肿瘤内的免疫机制。
该方案的相对简便性使得研究人员能够评估更大规模的肿瘤队列，从而最大限度地减少组内变异。与更为常见和普遍的成像方法（如免疫组化或免疫...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究工作获得了美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）资助项目 R01-CA169354 和 R01-047822 以及美国退伍军人事务部（Department of Veterans Affairs）卓越奖（Merit Award）（ECB）的支持。RKP 获得了 NIH T32 CA009287-30A1、ASCO 青年研究者奖（ASCO Young Investigator Award）、加州乳腺癌研究项目奖学金（California Breast Cancer Research Project Fellowship）以及美国癌症协会指导研究学者基金（American Cancer Society Mentored Research Scholar Grant）的支持；BAZ 获得了 NIH 资助项目 AI079320 的支持。JM 获得了 NIH T-32 培训基金 T32-AI07290-25、T32-AI07290-24 以及美国癌症协会博士后奖学金 PF-12-052-01-CSM 的支持。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| RPMI | Cellgro | 10-040 | http://cellgro.com；置于冰上保存 |
| FBS | Cellgro | 35-011-CV | http://cellgro.com |
| 50 ml 锥形管 | Falcon | 14-432-22 | fischersci.com |
| 40 μm 滤膜 | Falcon | 08-771-1 | fischersci.com |
| 5 ml 注射器 | BD | 14-823-35 | fischersci.com |
| 手术剪/镊子 | Roboz | RS-5910 | roboz.com |
| PBS | Cellgro | MT-21-030-CM | http://cellgro.com；置于冰上保存 |
| 台盼蓝 | Cellgro | MT-25-900-CI | fischersci.com |
| 血细胞计数板 | Hausser Scientific | 02-671-54 | fischersci.com |
| 活/死细胞染色试剂 | Life Technologies | L34957 | lieftechnologies.com |
| FlowJo 软件 | TreeStar, Inc | flowjo.com |
参考文献
- Mantovani, A., et al. Chemokines in the recruitment and shaping of the leukocyte infiltrate of tumors. Semin Cancer Biol. 14 (3), 155-160 (2004).
- Zitvogel, L., Tesniere, A., Kroemer, G. Cancer despite immunosurveillance: immunoselection and immunosubversion. Nat Rev Immunol. 6 (10), 715-727 (2006).
- Gajewski, T. F., Schreiber, H., Fu, Y. X. Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment. Nat Immunol. 14 (10), 1014-1022 (2013).
- Fridman, W. H., Pages, F., Sautes-Fridman, C., Galon, J. The immune contexture in human tumours: impact on clinical outcome. Nat Rev Cancer. 12 (4), 298-306 (2012).
- Curiel, T. J., et al. Specific recruitment of regulatory T cells in ovarian carcinoma fosters immune privilege and predicts reduced survival. Nat Med. 10 (9), 942-949 (2004).
- Pachynski, R. K., et al. The chemoattractant chemerin suppresses melanoma by recruiting natural killer cell antitumor defenses. J Exp Med. 209 (8), 1427-1435 (2012).
- Hoffman, R. M. Transgenic nude mice ubiquitously expressing fluorescent proteins for color-coded imaging of the tumor microenvironment. Methods Mol Biol. 1194, 353-365 (2014).
- Mansfield, J. R. Imaging in cancer immunology:phenotyping immune cell subsets in situ in FFPE tissue sections. MLO Med Lab Obs. 46 (6), 12-13 (2014).
- Serres, S., O'Brien, E. R., Sibson, N. R. Imaging angiogenesis, inflammation, and metastasis in the tumor microenvironment with magnetic resonance imaging. Adv Exp Med Biol. 772, 263-283 (2014).
- Schietinger, A., et al. Longitudinal confocal microscopy imaging of solid tumor destruction following adoptive T cell transfer. Oncoimmunology. 2 (11), e26677(2013).
- Singh, A. S., Radu, C. G., Ribas, A. P. E. T. imaging of the immune system: immune monitoring at the whole body level. Q J Nucl Med Mol Imaging. 54 (3), 281-290 (2010).
- Kilarski, W. W., et al. Intravital immunofluorescence for visualizing the microcirculatory and immune microenvironments in the mouse ear dermis. PLoS One. 8 (2), e57135(2013).
- Habibollahi, P., et al. Fluorescent nanoparticle imaging allows noninvasive evaluation of immune cell modulation in esophageal dysplasia. Mol Imaging. 13 (3), 1-11 (2014).
- Balducci, A., et al. A novel probe for the non-invasive detection of tumor-associated inflammation. Oncoimmunology. 2 (2), e23034(2013).
- Liu, C., et al. Plasmacytoid dendritic cells induce NK cell-dependent, tumor antigen-specific T cell cross-priming and tumor regression in mice. J Clin Invest. 118 (3), 1165-1175 (2008).
- Hadeiba, H., et al. CCR9 expression defines tolerogenic plasmacytoid dendritic cells able to suppress acute graft-versus-host disease. Nat Immunol. 9 (11), 1253-1260 (2008).
- McLean, M., et al. A BALB/c murine lung alveolar carcinoma used to establish a surgical spontaneous metastasis model. Clin Exp Metastasis. 21 (4), 363-369 (2004).
- Watkins, S. K., Zhu, Z., Watkins, K. E., Hurwitz, A. A. Isolation of immune cells from primary tumors. J Vis Exp. (64), e3952(2012).
- Shafer-Weaver, K. A., et al. Cutting Edge: Tumor-specific CD8+ T cells infiltrating prostatic tumors are induced to become suppressor cells. J Immunol. 183 (8), 4848-4852 (2009).
- Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis. J Immunol Methods. 405, 97-108 (2014).
- Stewart, J. C., Villasmil, M. L., Frampton, M. W. Changes in fluorescence intensity of selected leukocyte surface markers following fixation. Cytometry A. 71 (6), 379-385 (2007).
- Hackstein, H., et al. Heterogeneity of respiratory dendritic cell subsets and lymphocyte populations in inbred mouse strains. Respir Res. 13, 94(2012).
- Ostrand-Rosenberg, S. Myeloid-derived suppressor cells: more mechanisms for inhibiting antitumor immunity. Cancer Immunol Immunother. 59 (10), 1593-1600 (2010).
- Curran, M. A., Montalvo, W., Yagita, H., Allison, J. P. PD-1 and CTLA-4 combination blockade expands infiltrating T cells and reduces regulatory T and myeloid cells within B16 melanoma tumors. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (9), 4275-4280 (2010).
- Schreiber, R. D., Old, L. J., Smyth, M. J. Cancer immunoediting: integrating immunity's roles in cancer suppression and promotion. Science. 331 (6024), 1565-1570 (2011).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
