骨诱导培养基：制备与生物活性检测

摘要

我们在此介绍如何制备骨组织条件培养基（BCM）并检测其活性 体外.

摘要

自体骨移植在口腔颌面外科、骨科和创伤学中被广泛应用。自体骨移植不仅能够替代缺失的骨组织，还能支持骨再生的复杂过程。这种自体移植物的良好性能归因于其三种特性：骨传导性、成骨性和骨诱导性。然而，还存在另一个方面：骨移植物会释放大量分子，包括可作用于参与骨再生的间充质细胞的生长因子。骨移植物的旁分泌特性可以被研究 体外 通过使用骨条件培养基（BCM）实现。本文介绍了一种从天然猪皮质骨以及经过热处理或脱矿处理的骨组织制备骨条件培养基的实验方案。细胞可直接暴露于BCM中，或接种于预先用BCM浸泡过的生物材料（如胶原膜）上。我们提供了相关示例 体外 基于间充质细胞的生物测定，研究TGF-β调控基因的表达。所展示的实验方案有助于进一步揭示骨移植材料在骨再生过程中的旁分泌效应，并为重建外科领域的转化研究开辟新路径。

引言

自体骨被广泛用于修复因畸形、切除手术、创伤重建手术以及种植体植入前造成的骨缺损^1,2。了解骨移植材料支持移植物整合过程的生物学原理，不仅对于理解为何自体移植物被视为重建手术中的“金标准”至关重要，同时也为骨替代材料的仿生优化设计提供了依据³。然而，与骨替代材料相比，自体骨的移植物整合速度更快^4,5。因此，揭示使自体骨在促进骨再生方面如此高效的分子与细胞机制显得尤为迫切。

自体移植物被认为具有三种教科书级特征，可支持骨愈合过程 ^6,7首先，自体骨具有骨传导性，可引导新形成的骨组织长入缺损区域。其次，自体骨具有骨生成性，即其含有可分化为成骨细胞的间充质细胞。 ⁸第三，自体骨具有骨诱导性，因为埋藏于基质中的生长因子（如骨形态发生蛋白）可启动软骨内成骨甚至膜内成骨过程。 ⁹还有一个方面：新制备的骨碎片具有基于旁分泌功能的特性 体外 使用“骨条件培养基”的观察结果 ^10-15还应提及髓系造血的影响 ¹⁶一种类似的术语“脱矿骨基质条件培养基”早在1996年就已被提出，该术语支持骨组织具有旁分泌功能的整体概念，即使在经过脱矿处理后依然如此。 ¹⁷对于我们的目的，BCM 可以从新鲜的猪下颌骨制备 ^10,11. 对BCM的蛋白质组学分析揭示了其复杂的组成，包括生长因子和细胞外基质成分 ¹⁰，同时也拓展了关于完整骨组织中蛋白酶体的现有知识 ^18,19因此，BCM 应反映不同修饰骨移植物所释放的活性 体外.

当间充质细胞（例如从骨碎片或口腔软组织中分离的细胞）暴露于BCM时会发生什么？ 体外，BCM 可减少成骨和成脂分化，并引起 IL11 表达显著升高 ¹¹全基因组微阵列分析显示，间充质细胞在响应BCM时有更多基因差异表达。这些基因包括肾上腺髓质素（ADM）、白细胞介素11（IL11）、白细胞介素33（IL33）、NADPH氧化酶4（NOX4）、蛋白聚糖4（PRG4，又称润滑素）和五聚素3（PTX3）。 ¹⁵. 从高压灭菌骨碎片获得的BCM未能改变相应基因的表达 ¹⁴经巴氏消毒和冷冻处理的骨碎片中的BCM能够改变基因表达 ¹⁴脱矿骨基质条件培养基（DBM-CM）也可改变TGF-β调控基因的表达 ²⁰有趣的是，用于保护骨碎片免受周围软组织侵入的胶原屏障膜 ^21,22，吸附了BCM中负责基因表达变化的那些部分 ²³BCM 研究可拓展至参与骨再生的其他细胞类型，例如骨吸收性破骨细胞和内皮细胞等。总体而言，不断积累的 体外 数据为临床前研究的设计提供了科学依据。

本实验方案包含两个部分：首先，介绍如何制备BCM；其次，介绍如何基于间充质细胞检测其生物学活性。 体外.

方案

1. BCM 制备

1. 尽可能从当地屠户处获取新鲜的猪下颌骨。将下颌骨放置在坚固的表面上，剥离全层瓣，特别注意不要在骨表面残留任何软组织或骨膜。操作环境应保持清洁，无需在超净工作台内进行。
2. 完成全层瓣剥离后，使用骨刮匙从颊侧刮取骨碎片。请注意，骨刮匙必须锋利。牢固握持骨刮匙，以长距离刮取动作收集骨组织。丢弃尺寸小于1 mm的骨碎片。
   1. 如需保留天然骨碎片，应立即将其置于直径为10 cm的塑料培养皿中，加入含1%抗生素和抗真菌剂的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM），防止其干燥。
   2. 如需评估热处理的影响，将骨碎片在80 °C下巴氏灭菌30分钟，或在121 °C下高压灭菌20分钟。
   3. 如需评估脱矿作用的影响，将骨碎片在4 °C条件下于1 M HCl中振荡4–6小时，随后用培养基反复冲洗，直至pH值呈中性。
3. 将总共5 g骨碎片加入含10 ml新鲜DMEM（补充1%抗生素和抗真菌剂）的新塑料培养皿中。
4. 将塑料培养皿置于37 °C、加湿环境中培养24小时。随后收集骨条件培养基（BCM）。以200 × g离心10分钟去除碎片，经无菌过滤（0.2 nm），分装后于-80 °C冷冻保存。
5. 使用前立即解冻BCM原液，避免反复冻融。
6. 对于指定实验，将胶原膜在BCM或无血清培养基中室温浸泡1小时。用PBS充分洗涤膜，随后将其放入96孔板中。湿润的膜用于接种细胞。
7. BCM的制备流程总结于图1中。

2. 基于间充质细胞的生物测定

1. 将人源间充质细胞（例如骨细胞、牙龈和牙周韧带成纤维细胞）以30,000个细胞/cm²的浓度接种于12孔板中。接种时使用含DMEM、10%胎牛血清和抗生素的生长培养基。让细胞在过夜（O/N）条件下贴壁。
2. 弃去培养基，用预热至37 °C的PBS洗涤细胞。通过加入预热的无血清培养基（含或不含20% BCM）刺激细胞。将细胞置于37 °C、湿润环境中培养24小时。
3. 弃去培养基，用预热的PBS冲洗细胞，并根据您所选用的方案提取RNA。
4. 调整RNA浓度，使各样品中RNA量相等。制备cDNA，并使用表1所示引物进行qRT-PCR分析目的基因。
   注意：各组分的稀释比例为：2x SYBR Green、20x 正向引物、20x 反向引物、5x 无菌去离子水、5x cDNA。qRT-PCR反应共进行40个循环，每个循环为95 °C 15秒和60 °C 1分钟。
5. 采用Δ(ΔCt)法对GAPDH看家基因进行归一化处理，计算相对表达水平，其中ΔCT = 目标基因CT值 - GAPDH CT值，Δ(ΔCT) = 刺激组ΔCT - 对照组ΔCT。
6. 完成此质量控制后，将BCM加入培养基中，用于刺激包括间充质细胞、造血细胞或内皮细胞在内的所有类型细胞。

结果

骨条件培养基（Bone Conditioned Medium）由新鲜的猪骨碎片制备而成。图1和图2分别展示了制备BCM以及将生物材料与BCM联合使用的一般流程。在制备BCM过程中，应尽量获得较大的骨碎片，并采用长行程研磨；短行程研磨或产生过小的骨碎片可能会影响最终BCM的质量。BCM的质量可通过分析其靶基因（ADM、PTX3、IL11、IL33、NOX4和PRG4）的基因表达水平进行控制（图3）。其中，ADM和PTX3的表达可下调至0.4倍，而IL11、IL33、NOX4和PRG4的表达可上调达200倍。若口腔成纤维细胞未表现出如上所述水平的BCM靶基因表达，则应检查细胞状态是否健康，或使用新的下颌骨重新制备BCM。图4展示了在胶原屏障膜上接种的口腔成纤维细胞中BCM靶基因表达的典型结果。使用经巴氏灭菌骨碎片的条件培养基（20%浓度）或脱矿骨碎片的条件培养基刺激的口腔成纤维细胞，其基因表达水平与BCM刺激的细胞相似（表2和表3）。然而，...

讨论

骨条件培养基反映了骨移植材料在骨再生早期阶段释放的生物活性。本文所述方案可适用于研究参与骨再生的不同类型细胞的反应。此外，该方案也可用于制备经处理的骨组织或骨填充材料的条件培养基。这些方法操作简便，基于一个简单的原理：从各种天然及处理后的骨组织中释放出的生物因子。了解骨条件培养基对间充质细胞的影响，有助于深入认识移植物的整合过程以及自体骨移植物的特性。基于这一理念，我们已积累了关于来源于天然骨组织的骨条件培养基作用效应的大量知识 ^11,15 和处理过的骨组织 ^14,20 对间充质细胞的基因表达以及增殖、迁移和向三个主要谱系——成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞——的分化均有影响 ¹¹. 还研究了BCM靶向造血细胞的能力，例如在调节破骨细胞生成方面的作用 ¹³许多潜在的靶细胞正等待响应 BCM 体外本文所述方案可作为该研究的入门指南。

所展示的实验方案还可用于进一步揭示BCM在间充质细胞中特异性激活TGF-β调控基因的分子机制。例如，TGF-β受体I拮抗剂SB431542可阻断BCM对...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
猪下颌骨	当地屠夫
骨刮匙	Hu-Friedy	PPBUSE2/36
抗生素 &和抗真菌剂	赛默飞世尔科技	15240-062
胶原膜（Bio-Gide）	盖氏
胎牛血清	Invitrogen Corporation	16030074
DMEM	Invitrogen Corporation	21885-025
高纯度RNA提取试剂盒	罗氏	11828665001
Transcriptor 第一链 cDNA 合成试剂盒	罗氏	4379012001
引物	Microsynth
SYBR Green（用于qRT-PCR）	罗氏	4673484001
PBS	罗氏	11666789001