本文记录了利用软琼脂集落形成实验检测肽基精氨酸脱亚氨酶（PADI）抑制剂BB-Cl-amidine对乳腺癌致瘤性影响的方法。 体外.
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本文内容
摘要
摘要
鉴于研究肿瘤进展机制本身存在的困难 在体基于细胞的实验，如软琼脂集落形成实验（下文简称软琼脂实验），可检测细胞在半固体基质中增殖的能力，仍是癌症研究的重要标志。与传统的二维单层细胞培养或三维球状体细胞培养实验相比，该技术的主要优势在于其三维细胞环境与体内实际情况具有高度相似性 体内 重要的是，软琼脂实验还为严格检测新型化合物或处理条件对细胞增殖和迁移的影响提供了理想工具。此外，该实验能够在基因扰动背景下对细胞转化潜能进行定量评估。我们近期鉴定出肽基精氨酸脱亚氨酶2（PADI2）是一种潜在的乳腺癌生物标志物和治疗靶点。本文通过检测PADI抑制剂BB-Cl-amidine（BB-CLA）对人乳腺导管癌细胞致瘤性的影响，重点展示了软琼脂实验在抗癌药物临床前研究中的应用价值 原位 (MCF10DCIS) 细胞
引言
正常细胞和转化细胞均可在二维单层培养条件下轻松增殖。这种贴壁细胞生长方式与体内实际发生的细胞生长情况存在显著差异。 在体 在缺乏有丝分裂刺激的情况下，细胞通常不会在其微环境中快速分裂。而软琼脂实验则与二维培养系统不同，该实验通过测量细胞在半固体琼脂糖凝胶中悬浮状态下增殖并形成集落的能力，来量化其致瘤性。1在此条件下，未转化细胞因缺乏与细胞外基质（ECM）的黏附而无法快速增殖，并发生凋亡，该过程称为失巢凋亡（anoikis）。相反，发生恶性转化的细胞由于磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/Akt 和 Rac/Cdc42/PAK 等信号通路的激活，失去了对黏附的依赖性，因而能够在半固态软琼脂基质中生长并形成克隆集落。2.
软琼脂实验的常见用途是检测特定化合物（如PADI抑制剂）是否能够抑制肿瘤生长 体外通常，菌落计数或菌落大小是该实验中可量化的检测指标，可用于比较对照组与处理组之间的差异，以评估细胞致瘤性的变化。因此，若发现菌落形成能力随药物浓度增加而呈负相关，则可得出该药物对致瘤性具有有效抑制作用的结论。 体外另一方面，如果药物不影响集落形成，则可能是药物浓度不适当，或该药物并非有效的肿瘤生成抑制剂。除了使用软琼脂实验检测药物的抗肿瘤效果外，该实验还可用于探究特定基因与肿瘤发生之间的关系。例如，可通过PADI2特异性的siRNA处理，研究抑制PADI2表达对肿瘤发生能力的影响。
PADI 是依赖钙离子的酶，可通过瓜氨酸化或脱亚氨化过程，将带正电荷的精氨酸残基转化为电中性的瓜氨酸，从而在翻译后修饰蛋白质3-5。我们近期发现，肽基精氨酸脱亚氨酶 2（PADI2）可能作为一种新型乳腺癌生物标志物，而 PADI 抑制剂则有望成为早期乳腺癌的候选治疗药物6。例如，我们先前已证明，一种“广谱 PADI”抑制剂 Cl-amidine 可在二维单层培养中抑制乳腺癌细胞的增殖，并且该抑制剂还能抑制三维肿瘤球体的生长6。在本研究中，我们进一步拓展了这些发现，通过测试一种新型 PADI 抑制剂 BB-CLA 抑制 MCF10DCIS 乳腺癌细胞集落形成的能力，突显了软琼脂实验的应用价值7。本实验选用 MCF10DCIS 细胞，是因为它们是来源于非转化人乳腺细胞 MCF10A 的致癌性衍生物，且其内源性 PADI2 蛋白水平较高8。我们推测，PADI2 的酶活性在该细胞系的致瘤性中发挥关键作用，而 BB-CLA 对 PADI2 活性的抑制将可抑制癌症进展。
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方案
1. 3% 2-羟乙基琼脂糖的制备
- 取一个洁净、干燥的 100 ml 玻璃瓶，加入 0.9 g 2-羟乙基琼脂糖（琼脂糖 VII），然后加入 30 ml 蒸馏水。
- 将混合物微波加热 15 秒，轻轻摇晃。重复此步骤至少三次，直至琼脂糖粉末完全溶解。
- 将盛有溶液的瓶子高压灭菌 15 分钟。
- 让琼脂糖溶液冷却至室温后再使用。将溶液在室温下保存。
2. 底层制备：0.6% 琼脂糖凝胶
- 将数支5 ml 和10 ml 移液器预先放入37 °C培养箱中预热，以防止操作过程中琼脂糖在移液器内凝固。
- 将预先配制的3% 2-羟乙基琼脂糖溶液瓶盖稍松开，放入微波炉中加热15秒；随后轻轻摇匀溶液，再加热15秒。注意：摇动琼脂糖溶液时需小心，因溶液接触空气后会膨胀上升，容易溢出。
- 若瓶中仍有未溶解的凝胶残留，可再用微波炉加热数秒直至完全溶解。
- 在后续操作步骤中，将盛有琼脂糖溶液的瓶子置于45 °C水浴中保温，以防止琼脂糖溶液过早凝固。
- 将MCF10DCIS培养基置于37 °C水浴中预热。注：MCF10DCIS培养基成分为DMEM/F12、5%马血清、5%青霉素-链霉素。
- 使用预热的移液器，将3 ml 3%琼脂糖溶液转移至无菌的50 ml 锥形管中。
- 立即加入12 ml 预热的MCF10DCIS培养基，并轻轻颠倒锥形管以使琼脂糖与培养基充分混匀。操作过程中应尽量避免产生气泡，以免影响后续克隆计数。
- 将上述混合液轻轻加入6孔细胞培养板的每个孔中，每孔2 ml ，注意避免产生气泡。
- 将6孔培养板水平放置于4 °C环境中孵育1小时，使混合液充分凝固。
- 待混合液完全凝固后，将培养板转移至37 °C培养箱中孵育30分钟。此时底层基质已准备就绪，可供后续使用。
3. 含细胞层的制备：0.3% 琼脂糖凝胶
- 用胰蛋白酶消化 MCF10DCIS 细胞，并将其稀释至细胞浓度为 4 x 104 /ml。
- 使用预热的移液器吸取 2 ml 3% 琼脂糖，转移至无菌的 50 ml 锥形管中。
- 立即向锥形管中加入 8 ml MCF10DCIS 培养基，轻轻颠倒混匀，使琼脂糖与培养基充分混合。避免产生气泡。
- 取 2 ml MCF10DCIS 细胞（4 x 104 /ml），并用 BB-CLA（0 µM（DMSO）或 1 µM）处理。
- 以 1:1 的比例将细胞与 0.6% 琼脂糖混合。
- 取 1 ml 细胞-琼脂糖混合液，轻轻加至 6 孔培养板底层（2 x 104 细胞/ml）。
- 将 6 孔培养板水平放置于 4 °C 的平坦表面上，静置至少 15 分钟，使上层凝固。
- 待混合液凝固后，将培养板放入 37 °C 培养箱中培养一周，然后再添加喂养层。
4. 饲养层的制备：0.3% 琼脂糖凝胶
- 将预先配制的3% 2-羟乙基琼脂糖溶液用微波炉加热15秒，轻轻摇匀后再次加热15秒。
- 将琼脂糖溶液瓶置于45 °C水浴中平衡。
- 将MCF10DCIS培养基置于37 °C水浴中预热。
- 在50 ml锥形管中，将1 ml 3%琼脂糖溶液与9 ml 预热的MCF10DCIS培养基混合，轻轻颠倒混匀，使琼脂糖与培养基充分混合。避免产生气泡。
- 用BB-CLA（0 µM（DMSO）或1 µM）处理该混合液。
- 轻轻将1 ml 该混合液（避免产生气泡）加入已含有底层和软层的6孔培养板的每个孔中。
- 将6孔培养板水平放置于4 °C的平面上至少15分钟，使混合液凝固。
- 待饲养层凝固后，将培养板放入37 °C培养箱中。
- 每周重复一次换液操作：在现有的饲养层上覆盖1 ml 0.3%琼脂糖/培养基/处理液，以补充新的培养基，直至观察到克隆形成。注意：软层和饲养层中的琼脂非常柔软，因此饲养层中添加的营养物质可轻易扩散至含细胞的层中，到达细胞。
5. 数据采集
- 在软琼脂中培养细胞 2.5 周后，使用光学显微镜计数每个孔中的克隆数量。为便于定量，可将网格打印在透明胶片上，并将该网格贴附于 6 孔板上，以帮助在计数过程中定位细胞位置。由于克隆大小（以每个克隆的直径量化）会有所差异，需预先定义参考克隆大小，以确定哪些克隆将被计入。例如，在数据分析中纳入直径为 70 µm 或更大的克隆。
- 将样品储存于 4 °C，以防止进一步形成克隆，并便于后续计数。使用 Parafilm 密封 6 孔培养板，防止凝胶干燥。
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结果
软琼脂集落形成实验可用于多种应用，以记录癌细胞的致瘤性。该技术的主要优势在于，半固体基质可选择性地促进能够以非贴壁依赖方式增殖的细胞生长。这种特性主要见于癌细胞，而正常细胞通常不具备。我们主要利用该技术检测药物对肿瘤生长抑制的效果，并研究目的基因（包括PADI基因）过表达或敲低对乳腺癌细胞致瘤性的影响。在此，我们评估了BB-CLA对过表达PADI2的MCF10DCIS细胞致瘤性抑制的作用（图1和图2）。
结果表明，BB-CLA 显著抑制 MCF10DCIS 细胞衍生克隆的形成。图3显示，在存在PADI抑制剂的情况下，与DMSO对照组相比，克隆形成数量和克隆大小均有所减少。[注：BB-CLA溶于DMSO，因此使用DMSO作为对照。] 经BB-CLA处理的MCF10DCIS细胞的克隆大小主要在20至100 µm范围内，而DMSO对照组的克隆大小在培养2.5周后范围更广，为70至150 µm。
计数并分析了直径大于70 µm的克隆（图4
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讨论
在软琼脂中菌落形成的速率因细胞类型而异9。因此，起始接种的细胞数量应根据具体情况进行优化和调整。建议使用6孔板时，每孔接种细胞数量范围为5 × 102 至 1 × 104 个。此外，菌落大小取决于每种细胞的增殖速度，因此需要预先设定菌落大小的阈值，以便对单个菌落进行标注并用于后续定量分析。本实验中，仅对直径大于70 µm的菌落进行计数，以避免将初始接种时未增殖的细胞计入结果。
为了获得最佳生长效果，在制备3D琼脂糖凝胶时，建议使用通常用于2D细胞培养的相同细胞培养基。这是因为更换培养基常常会改变细胞的生长速率，从而需要额外的传代步骤以使细胞适应新的培养基。例如，MCF10DCIS细胞可在RPMI-1640、DMEM或DMEM/F12培养基中实现最佳生长。然而，当MCF10DCIS细胞的培养基从RPMI-1640更换为DMEM/F12时，细胞增殖速率会出现明显下降。此外，应注意保持血清浓度恒定，因为缺乏血清会抑制克隆形成10。另外，琼脂糖经微波加热后，应将瓶子置于45 °C水浴中平衡温度，再与含细...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢康奈尔大学的 Richard Cerione 博士、Marc Antonyak 博士和 Kelly Sullivan 提供的技术建议，同时感谢康奈尔大学的 Gerlinde Van de Walle 博士分享其 Olympus CKX41 倒置显微镜。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 蔡司 Axiopot | 卡尔蔡司显微镜公司 | 1021859251 | |
| 倒置显微镜 | 奥林巴斯 | CKX41 | |
| DMEM/F-12 | 龙沙 BioWhittaker | 12-719F | |
| HyClone 供体马血清 | 菲舍尔科技公司 | SH30074.03 | |
| 青霉素-链霉素 | 生命技术公司 | 15140-122 | |
| 2-羟乙基琼脂糖：VII型，低凝胶温度 | 西格玛-奥德里奇 | 39346-81-1 |
参考文献
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重印与许可
