软琼脂集落形成实验利用识别的致瘤性乳腺癌细胞抑制剂

未转化（正常）和转化的细胞都可以在 2D 单层培养物中轻松增殖。这种形式的贴壁细胞生长与体内发生的生长完全不同，在体内，在没有促有丝分裂刺激的情况下，细胞通常不会在其微环境中迅速分裂。另一方面，软琼脂测定与 2D 培养系统不同，因为它通过测量细胞在半固体琼脂糖凝胶内悬浮液中增殖和形成集落的能力来量化致瘤性¹。在这种情况下，未转化的细胞在没有锚定到细胞外基质 （ECM） 的情况下无法快速增殖并发生细胞凋亡，这一过程称为失巢凋亡。相比之下，由于磷脂酰肌醇 3-激酶 （PI3K）/Akt 和 Rac/Cdc42/PAK 等信号通路的激活，经历恶性转化的细胞失去了锚定依赖性。因此，这些细胞能够在半固体软琼脂基质² 中生长并形成集落。

软琼脂测定的常见用途是测试特定化合物（如 PADI 抑制剂）是否能够在体外抑制肿瘤生长。通常，集落计数或集落大小是测定的定量读数，可以在对照组和治疗组之间进行比较，以评估细胞致瘤性的差异。因此，如果发现集落形成与药物浓度增加呈负相关，则可以得出结论，该药物在体外是有效的致瘤抑制剂。另一方面，如果药物不影响集落形成，则药物要么剂量不合适，要么不是有效的致瘤抑制剂。除了使用软琼脂测定法检测药物的抗肿瘤作用外，该测定法还可用于探测特定基因与肿瘤发生之间的关系。例如，抑制 PADI2 表达对致瘤性的影响可以通过 PADI2 特异性 siRNA 处理来解决。

PADI 是钙依赖性酶，通过在称为瓜氨酸化或脱亚胺的过程中将带正电荷的精氨酸残基转化为带中性电荷的瓜氨酸^3-5 来对蛋白质进行翻译后修饰。我们最近发现肽基精氨酸脱亚胺酶 2 （PADI2） 可能作为一种新的乳腺癌生物标志物发挥作用，并且 PADI 抑制剂代表了早期乳腺癌的候选疗法⁶。例如，我们之前已经证明，"泛 PADI"抑制剂 Cl-amidine 使用 2D 单层抑制乳腺癌细胞的增殖，并且该抑制剂抑制 3D 肿瘤球体的生长⁶。在本报告中，我们扩展了这些研究，并通过测试新型 PADI 抑制剂 BB-CLA 在抑制MCF10DCIS乳腺癌集落生长方面的功效，强调了软琼脂测定的效用⁷。我们注意到，我们在这项实验中使用了 MCF10DCIS 细胞，因为它们是未转化的人 MCF10A 细胞的致癌衍生物，并且因为它们含有高稳态水平的 PADI2 蛋白⁸。我们假设 PADI2 酶活性在该细胞系的致瘤性中起关键作用，并且 BB-CLA 介导的 PADI2 活性抑制将抑制癌症进展。

1.制备3％2-羟乙基琼脂糖

1. 到一个干净，干燥的100 ml玻璃瓶中加入0.9克2-羟乙基琼脂糖（琼脂糖VII），随后加入30ml蒸馏水。
2. 微波15秒，轻轻混合漩涡。重复此步骤至少三次，直到琼脂糖粉末完全溶解。
3. 高压釜中加入含有溶液的瓶子15分钟。
4. 允许琼脂糖解决方案，进一步使用前冷却至室温。存储溶液在RT。

2.编写底层:0.6％琼脂糖凝胶

1. 预暖几个5毫升和10ml移液器在37℃培养箱中，以防止琼脂糖从搬运时固化在吸管。
2. 部分地松开瓶盖和微波15秒的预制备3％2-羟乙基琼脂糖溶液。然后，轻轻地旋转解决方案和微波了15秒钟。注意:在纷飞的时候琼胶要小心本身的方案，因为当暴露于空气中，并可以溢出的溶液上升。
3. 如果存在残留的固体凝胶在瓶中，微波几秒钟。
4. 保持含在下一步骤，以防止该琼脂糖溶液从固化过早在45℃水浴琼脂糖溶液的瓶中。
5. 温馨MCF10DCIS媒体在37℃水浴。注意:MCF10DCIS媒体包括DMEM / F12，5％马血清，5％青霉素链霉素。
6. 转印3毫升使用预热的移液管的3％的琼脂糖溶液加入到无菌的50ml锥形管中。
7. 立即加列12毫升温MCF10DCIS媒体和轻轻颠倒锥形管混合与媒体的琼脂糖。尽量不形成任何气泡，因为它会与殖民地后计数干扰。
8. 轻轻加入2毫升该混合物到6孔培养板的各孔而不形成任何气泡。
9. 孵育的6孔培养板horizo​​ntaLLY在平坦表面上，在4℃下1小时，以允许混合物固化。
10. 混合物固化后，将板放入37℃培养箱中30分钟。底层是现在可以使用。

3.制备含细胞层:0.3％琼脂糖凝胶

1. Trypsinize MCF10DCIS细胞并稀释至4×10 ⁴个/ ml的细胞浓度。
2. 取2毫升使用预热移液器并传输3％琼脂糖的进入无菌50ml锥形管中。
3. 立即添加8毫升MCF10DCIS媒体到锥形管并轻轻颠倒混合与媒体的琼脂糖。避免形成任何气泡。
4. 取2毫升MCF10DCIS细胞（4×10 ⁴个/ ml）的中和治疗与BB-CLA（0μM（DMSO）或1μM的）。
5. 以1:1稀释，混合细胞与0.6％的琼脂糖。
6. 取1毫升细胞 - 琼脂糖混合物，轻轻加入到6孔培养p的底层晚期（2×10 ⁴个细胞/ ml）。
7. 水平放置的6孔培养板中在一个平面上，在4℃下至少15分钟，以允许在顶层固化。
8. 混合物固化后，将板放入37℃培养箱中培养一周增加馈送层之前。

4.准备饲养层的0.3％琼脂糖凝胶

1. 微波15秒的预制备3％2-羟乙基琼脂糖溶液。轻轻摇动解决方案和微波了15秒钟。
2. 平衡的琼脂糖溶液瓶在45℃水浴中。
3. 暖MCF10DCIS媒体在37℃水浴。
4. 混合1毫升3％的琼脂糖溶液用9ml温暖MCF10DCIS媒体到50ml锥形管中并轻轻颠倒混合与媒体的琼脂糖。避免形成气泡。
5. 治疗与BB-CLA的混合物（0μM（DMSO）或1μM的）。
6. 轻轻加1ml该混合物中（不包括用于明气泡）到含有底和软层中的6孔培养板的每个孔中。
7. 水平放置的6孔培养板中在一个平面上，在4℃下至少15分钟以使该混合物固化。
8. 饲养层固化后，将板放入37℃培养箱中。
9. 通过叠加将1ml 0.3％琼脂糖/中/处理溶液到现有的饲养层来补充细胞与新媒体直到集落形成观察到重复此馈送过程每周。注意:琼脂在柔软和饲养层是非常柔软的，因此，从饲养层添加的营养物将容易地扩散入含细胞层到达细胞。

5.数据收集

1. 2.5周细胞生长在软琼脂后，计数在使用光学显微镜每孔的集落数。为了便于定量，打印网格到透明度和电网连接到6孔板，以帮助找到那里的细胞计数中。自菌落大小（如量化由每个菌落的直径）将变化，预定义的参考菌落大小，以确定哪些集落进行评分。例如，包括70微米或在数据分析中较大的菌落尺寸。
2. 储存样品在4℃以防止进一步的集落形成，并为未来的计数。密封6孔培养板用封口膜，以防止凝胶干燥。

软琼脂集落形成测定法可用于范围广泛的应用中记录癌细胞的致瘤性。这种技术的主要优点是，半固体基质选择性有利于细胞，它可以在一个锚定非依赖性方式增殖的生长。此特征主要表现由癌细胞而不由正常细胞。我们主要使用这种技术通过药物测试的肿瘤生长抑制的效果和测试对于过表达或我们的基因的兴趣，包括PADI基因的耗竭的效果，对乳腺癌细胞的致瘤性。这里，我们评估BB-CLA对的PADI2过表达MCF10DCIS细胞瘤抑制效果（图1和2）。

结果表明，BB-CLA显著抑制MCF10DCIS细胞的集落的形成; 图3示出的是，在一个PADI抑制剂的存在下，叔这里是在这两个集落形成和细胞集落大小减小时相比，DMSO对照。 [注:BB-CLA溶于DMSO并且因此，将DMSO用作对照]菌落为BB-CLA的大小处理的MCF10DCIS细胞主要20的范围内，以100微米，而菌落的DMSO中尺寸控制表现出更大的范围为70到150微米的2.5周增长之后。

菌落比70微米大的计数并进行分析（ 图4）。在DMSO对照而只有1967个菌落2.5周软琼脂培养后可见的BB-CLA处理组中的平均3536菌落有。这代表了降低的平均集落形成在1μM的BB-CLA的存在下44％，这表明乳腺癌细胞的一个显著致瘤抑制（MCF10DCIS细胞）由PADI抑制剂。

PLOAD / 52727 / 52727fig1.jpg"/>
BB-CLA的图1的化学结构。

该议定书的图2.概述为软琼脂集落形成测定。在6孔培养板的每孔首先用0.6％琼脂糖凝胶（底层）。然后层叠在0.6％的凝胶的顶部含有MCF10DCIS细胞，要么将BB-CLA抑制剂（1μM）或DMSO（对照）A 0.3％琼脂糖凝胶混合物。每周一次，在0.3％的琼脂糖凝胶混合物（含有BB-CLA）的溶液中加入在软层的顶部。 2〜4周后，克隆形成，观察和计算进行数据分析。 请点击此处查看该图的放大版本。

集落形成的图3的图像中的BB-CLA处理MCF10DCIS细胞。MCF10DCIS细胞生长于在BB-CLA（0μMDMSO）的存在下（1μMBB-CLA）或不存在软琼脂。持续2.5周，菌落使用倒置显微镜的低倍的图像和光显微镜高倍放大的图像成像。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4.量化MCF10DCIS菌落数后的BB-CLA处理。MCF10DCIS细胞以不同浓度的BB-CLA（0μM（DMSO）或1μM的BB-CLA）的生长在软琼脂。 2.5周后，单个菌落大日一个70微米的计数。实验重复4次（n = 4）。控制和治疗样品之间总细胞计数差异的统计显着性由两样本学生t检验（* P <0.005）测定。

作者没有什么可透露的。