离体大鼠主动脉内皮细胞和平滑肌细胞中细胞内Ca2+调控与一氧化氮生成的双光子成像

摘要

血管细胞功能依赖于细胞内信使的活性。本文描述了一种 离体 一种双光子成像方法，可用于检测离体主动脉中单个内皮细胞和血管平滑肌细胞在生理及药理刺激下细胞内钙离子和一氧化氮水平的变化。

摘要

钙是血管组织中多种生理过程的重要调节因子。大多数血管内皮细胞和血管平滑肌细胞的功能高度依赖于细胞内钙离子浓度（[Ca²⁺]_i）和一氧化氮（NO）的变化。为了理解血管在受到缩血管和扩血管刺激时如何调控[Ca²⁺]_i、NO及其下游分子，我们开发了一种新技术，该技术结合钙标记（或NO标记）荧光染料与双光子显微镜，用于测量离体血管中的钙处理过程（或NO生成）。本文详细描述了一步一步的操作流程，展示如何从大鼠体内分离主动脉，对内皮细胞或平滑肌细胞内的钙或NO进行标记，并在生理或药理刺激后，利用双光子显微镜成像钙瞬变（或NO生成）。该方法具有多重优势：1）可同时测量不同刺激下内皮细胞和平滑肌细胞中的钙瞬变；2）可在其天然微环境中对内皮细胞和平滑肌细胞进行成像；3）该方法对细胞内钙或NO的变化极为敏感，可生成高分辨率图像以实现精确测量；4）所述方法还可用于其他分子的检测，例如活性氧（ROS）。总之，应用双光子激光扫描显微技术监测离体血管内皮细胞和平滑肌细胞中的钙瞬变和NO生成，已获得高质量的定量数据，推动了我们对调控血管功能机制的理解。

引言

钙是血管细胞（如内皮细胞和平滑肌细胞）内一种基本的第二信使。它是引起血管收缩的主要刺激因素，并在血管舒张过程中发挥重要作用，包括通过内皮内一氧化氮（NO）生成所介导的效应。由于成像技术的限制，过去几乎无法在完整血管内观察钙的动态调控过程。双光子成像系统的开发以及新型钙离子或NO标记染料的出现，使得能够在足够的成像深度和分辨率下观察血管系统内的钙离子动态变化和NO生成过程。

双光子显微镜技术最近已被应用于 由于其卓越的深层组织穿透能力、低背景荧光和高信号灵敏度，适用于组织、器官乃至整体动物的研究。^1,2 双光子激发在照明焦点处具有狭窄的光谱范围，并且采用非扫描探测器，这是双光子显微镜优于传统共聚焦显微镜的原因。由于离焦光的自发荧光和散射会进入共聚焦针孔，共聚焦显微镜无法在必要的组织深度获得高质量图像。因此，我们开发了一种利用双光子显微镜测量[Ca²⁺]_i 在完整、单个的血管细胞中，以高分辨率和低信噪比检测信号传导和一氧化氮（NO）的生成。 

....

方案

以下所述实验操作已获得威斯康星医学院机构动物照护与使用委员会（IACUC）的批准，并符合美国国立卫生研究院《实验动物照护与使用指南》的要求。

1. 大鼠主动脉的分离

1. 使用异氟烷（5%诱导，1.5%至2.5%维持）或其他经IACUC批准的方法对大鼠进行麻醉。
2. 将大鼠置于仰卧位。为暴露腹腔器官，通过皮肤和皮下腹部组织做一条小的腹正中切口。用纱布轻轻推开肠管，以暴露主动脉和下腔静脉，如图1所示。
3. 简要地，将主动脉从周围结缔组织及下腔静脉中钝性分离。使用缝线尽可能靠近肾脏处结扎主动脉。分离约1 - 2 cm的主动脉段，并将其置于含有正常生理盐溶液（PSS；单位：mM：140 NaCl，1.2 MgCl₂，2 CaCl₂，4.5 KCl，6 葡萄糖，10 HEPES）的15 ml 锥形管中，冰上保存。
4. 主动脉分离完成后，根据批准的IACUC规程对动物实施安乐死。在所有非存活性操作结束后，通过胸廓切开术引起气胸，对深度麻醉的动物实施安乐死，以确保动物人道死亡。³
5. 在解剖显微镜下，使用尖头镊子和显微剪刀去除主动脉周围的脂肪和结缔组织。待主动脉清洁后，沿纵轴剪开，并将其置于冰上的PSS溶液中备用。

2. 染....

结果

为了准确评估钙离子在血管生理学（血管舒张和血管收缩）中的作用，设计了一种将钙离子荧光染料加载到离体完整主动脉的内皮细胞和血管平滑肌细胞中的实验方案。如图1所示的一般实验装置，展示了成像前血管的分离与制备基本策略。简言之，在从大鼠分离出主动脉后，应清除其周围的脂肪和结缔组织，并沿纵轴切开。随后将打开的主动脉置于铝箔包裹的500 µl离心管中，管内含有按照本方案预先配制的染料加载混合液，在室温下轻轻振荡孵育1小时。孵育结束后，需清洗主动脉，将其外膜朝下、管腔向上固定在覆有硅胶的培养板上，然后转移至直立式双光子显微镜进行成像。

当主动脉放置在显微镜下且血管处于焦点位置时，内皮细胞因其强烈的荧光发射而易于识别（图2A）。由于血管腔主要由内皮细胞构成，在固定血管时应使其朝上，因此内皮细胞通常是首先进入焦点的结构。除了成像内皮细胞外，某些位置还可观察到平滑肌细胞（图2B）。因此，在同一成像视野中可同时识别内皮细胞和平滑肌细胞（图2C）。能够在同一视野中对这两种.......

讨论

实验概述。为了更好地理解钙离子和一氧化氮（NO）在血管生理学中的作用，我们开发了一种新方法，用于测量离体完整主动脉中平滑肌细胞和内皮细胞内的[Ca²⁺]_i和NO水平。该实验方案主要包括以下关键步骤：1）血管的机械性分离与制备（非酶消化法）。为获得最佳的生理记录结果，尽可能保持组织健康和完整至关重要。2）使用Pluronic酸将组织与钙离子标记染料或NO标记染料共同孵育是关键步骤；然而，对于其他某些类型的血管，可能需要测试不同的Pluronic酸种类及孵育时间。3）将主动脉正确固定在带网格和固定针的硅胶包被培养皿上，可在双光子显微镜成像过程中提供稳定的视野。由于血管会发生收缩和舒张，因此必须确保血管被妥善固定，以避免产生运动伪影。4）结果的定量分析。请注意，瞬时反应的幅度并不总是比较细胞生理特性的最佳参数。瞬时反应的积分值可能更能反映细胞内总[Ca²⁺]_i或NO释放量的差异。

当实验操作正确时，可以监测 [Ca²⁺]_i （或一氧化氮水平.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DAF-FM	Life Technologies	D-23842
Fluo-4 AM	Life Technologies	F14217	500 µl 溶于 DMSO
Pluronic F-68 溶液	Sigma-Aldrich	P5556
L-NAME	Tocris	0665
Olympus 直立显微镜	Olympus	Fluoview FV1000
MaiTai HP DeepSee-OL	Spectra Physics		Ti:蓝宝石激光器，波长范围 690 nm — 1040 nm
滤光片	Olympus	FV10-MRL/R	495 至 540 nm
25× 水浸物镜	Olympus	XLPL25XWMP	数值孔径 1.05，工作距离 2 mm
切片固定网格	Warner Instrument	SHD-27LH
其他基础试剂	Sigma-Aldrich