离体大鼠主动脉内皮细胞和平滑肌细胞中细胞内Ca2+调控与一氧化氮生成的双光子成像

摘要

血管细胞功能依赖于细胞内信使的活性。本文描述了一种 离体 一种双光子成像方法，可用于检测离体主动脉中单个内皮细胞和血管平滑肌细胞在生理及药理刺激下细胞内钙离子和一氧化氮水平的变化。

摘要

钙是血管组织中多种生理过程的重要调节因子。大多数血管内皮细胞和血管平滑肌细胞的功能高度依赖于细胞内钙离子浓度（[Ca²⁺]_i）和一氧化氮（NO）的变化。为了理解血管在受到缩血管和扩血管刺激时如何调控[Ca²⁺]_i、NO及其下游分子，我们开发了一种新技术，该技术结合钙标记（或NO标记）荧光染料与双光子显微镜，用于测量离体血管中的钙处理过程（或NO生成）。本文详细描述了一步一步的操作流程，展示如何从大鼠体内分离主动脉，对内皮细胞或平滑肌细胞内的钙或NO进行标记，并在生理或药理刺激后，利用双光子显微镜成像钙瞬变（或NO生成）。该方法具有多重优势：1）可同时测量不同刺激下内皮细胞和平滑肌细胞中的钙瞬变；2）可在其天然微环境中对内皮细胞和平滑肌细胞进行成像；3）该方法对细胞内钙或NO的变化极为敏感，可生成高分辨率图像以实现精确测量；4）所述方法还可用于其他分子的检测，例如活性氧（ROS）。总之，应用双光子激光扫描显微技术监测离体血管内皮细胞和平滑肌细胞中的钙瞬变和NO生成，已获得高质量的定量数据，推动了我们对调控血管功能机制的理解。

引言

钙是血管细胞（如内皮细胞和平滑肌细胞）内一种基本的第二信使。它是引起血管收缩的主要刺激因素，并在血管舒张过程中发挥重要作用，包括通过内皮内一氧化氮（NO）生成所介导的效应。由于成像技术的限制，过去几乎无法在完整血管内观察钙的动态调控过程。双光子成像系统的开发以及新型钙离子或NO标记染料的出现，使得能够在足够的成像深度和分辨率下观察血管系统内的钙离子动态变化和NO生成过程。

双光子显微镜技术最近已被应用于 由于其卓越的深层组织穿透能力、低背景荧光和高信号灵敏度，适用于组织、器官乃至整体动物的研究。^1,2 双光子激发在照明焦点处具有狭窄的光谱范围，并且采用非扫描探测器，这是双光子显微镜优于传统共聚焦显微镜的原因。由于离焦光的自发荧光和散射会进入共聚焦针孔，共聚焦显微镜无法在必要的组织深度获得高质量图像。因此，我们开发了一种利用双光子显微镜测量[Ca²⁺]_i 在完整、单个的血管细胞中，以高分辨率和低信噪比检测信号传导和一氧化氮（NO）的生成。 

方案

以下所述实验操作已获得威斯康星医学院机构动物照护与使用委员会（IACUC）的批准，并符合美国国立卫生研究院《实验动物照护与使用指南》的要求。

1. 大鼠主动脉的分离

1. 使用异氟烷（5%诱导，1.5%至2.5%维持）或其他经IACUC批准的方法对大鼠进行麻醉。
2. 将大鼠置于仰卧位。为暴露腹腔器官，通过皮肤和皮下腹部组织做一条小的腹正中切口。用纱布轻轻推开肠管，以暴露主动脉和下腔静脉，如图1所示。
3. 简要地，将主动脉从周围结缔组织及下腔静脉中钝性分离。使用缝线尽可能靠近肾脏处结扎主动脉。分离约1 - 2 cm的主动脉段，并将其置于含有正常生理盐溶液（PSS；单位：mM：140 NaCl，1.2 MgCl₂，2 CaCl₂，4.5 KCl，6 葡萄糖，10 HEPES）的15 ml 锥形管中，冰上保存。
4. 主动脉分离完成后，根据批准的IACUC规程对动物实施安乐死。在所有非存活性操作结束后，通过胸廓切开术引起气胸，对深度麻醉的动物实施安乐死，以确保动物人道死亡。³
5. 在解剖显微镜下，使用尖头镊子和显微剪刀去除主动脉周围的脂肪和结缔组织。待主动脉清洁后，沿纵轴剪开，并将其置于冰上的PSS溶液中备用。

2. 染料加载与孵育

1. 取7 µl以DMSO为溶剂的1 mM Fluo-4 AM染料，分装至已用铝箔包裹的各个500 µl离心管中。将分装后的染料于-20 ˚C冰箱中避光保存，以维持其稳定性。注意：分装后的溶液在至少六个月内保持稳定。
2. 使用前，将染料溶液在室温下复温后再打开。工作液需在使用前即刻配制，稀释后的试剂不可保存用于后续实验。
3. 将7 µl已溶解于DMSO的即用型1 mM Fluo-4 AM染料加入450 µl无钙PSS溶液中。向染色工作液中加入40 µl非DMSO基的10% Pluronic Acid溶液，以帮助分散乙酰氧基甲酯（AM酯），并提高钙染料的加载效率。
4. 将分离得到的主动脉组织放入含有上述染色工作液（如步骤2.3所述）的500 µl离心管中，于室温下在旋转摇床上避光孵育1小时。
5. 为检测血管系统中的一氧化氮（NO）生成，使用DAF-FM二乙酸酯染料。将主动脉组织置于含450 µl PSS、40 µl Pluronic Acid和5 µl 10 mM DAF-FM二乙酸酯的溶液中孵育。参照钙离子染色孵育方案（步骤2.3），将主动脉放入含有NO染料溶液的500 µl离心管中，用铝箔包裹后，先于4 ˚C在旋转摇床上孵育30分钟，随后在室温下继续孵育30分钟。
6. 在检测NO生成时，可使用内皮型一氧化氮合酶抑制剂L-NAME作为对照以阻断NO的产生，结果如图4B所示。具体操作为：在孵育的最后30分钟（室温阶段），向染色工作液（如步骤2.5所述）中加入100 nM L-NAME。

3. 激光扫描双光子显微镜实验方案

1. 孵育1小时后，用干净的PSS清洗主动脉2至3次，以去除细胞外染料。
2. 将主动脉转移至含有正常PSS或Ca的硅胶包被培养皿中²⁺-不含缓冲液（根据实验方案而定）。将主动脉 pinned 固定在硅胶涂层上，使外膜与硅胶接触（即， 使用μ形针将内皮管腔暴露于培养皿开口处。或者，使用切片固定锚网格或胶水来固定组织。
   注意：为减少应力及可能的机械假象，应在含 Ca²⁺ 的溶液中转移并固定主动脉²⁺无血清溶液中孵育5-10分钟，然后开始实验。
3. 将蠕动泵或注射器连接至硅胶包被的培养板，用于自动或手动给药或更换细胞外液。
4. 将培养皿置于直立式双光子显微镜的物镜转盘下方，并在样品上方安装并定位一个25×（数值孔径1.05，工作距离2 mm）的水浸物镜。注意：若无此特定物镜，应选用专为双光子成像设计的物镜，因其相比普通物镜可显著提高信号分辨率。
5. 使用软件激活双光子激光器（激光器开始泵浦并启动）。将激光激发波长调节至 820 nm。
6. 使用落射荧光显微镜定位主动脉，并使用粗调旋钮将物镜对准内皮表面。
7. 切换显微镜至双光子激光扫描模式，确保激发激光处于锁模状态，非共聚焦探测器已启用，并安装适用于预期发射光谱的发射滤光片。注：此处使用 FV10-MRL/R （495 至 540 nM）被使用。
8. 使用约5%的激光功率开始实时扫描，并精细调节物镜焦距以清晰观察内皮细胞。
   注意：当在正常PSS中孵育时，内皮细胞会表现出强烈的荧光信号；而在无钙缓冲液中孵育血管时，该信号将明显减弱。内皮细胞位于打开的主动脉表面，平滑肌细胞则位于内皮细胞下方（参见 图2由于血管既不光滑也不均匀，因此会存在平滑肌细胞和内皮细胞均出现的区域。
9. 当细胞处于焦点时，设置显微镜软件以快速扫描模式（光栅扫描，512 × 512 像素窗口，帧采集频率为 1.1 秒）连续采集图像。在采集 Fluo-4 AM 荧光信号的同时，同步采集透射光图像，以检测血管收缩的变化并更清晰地观察实验条件。
10. 在采集基线信号图像后，更换 Ca²⁺ 在成像过程中，通过蠕动泵缓慢施加药理刺激剂或改变外部溶液中的离子浓度，观察加载细胞内荧光信号的增强。
    注意：内皮细胞对血流变化有响应，因此建议在应用药理性钙激活剂之前，先进行低层流条件下的应用和载体对照测试²⁺ 或一氧化氮（NO）信号。为了将加载了Fluo-4（Fluo-4的解离常数为345 nM）的血管中细胞内钙重新计算为nM浓度值，可在基础状态下以及加入离子霉素和MnCl₂后记录荧光强度₂.⁴

4. 图像处理与计算

1. 下载并安装 Fiji 图像处理软件包。
2. 在 Fiji 中打开图像文件。导入文件时，当系统提示时将通道（透射光和荧光信号）分离。数据分析仅使用荧光信号。
3. 在 Fiji 程序中，点击“分析”选项卡并向下滚动至“工具”选项。在“工具”选项下，找到标有“ROI 管理器”的标签并点击，将弹出一个新窗口。
4. 接着，在“分析”选项卡下点击“设置测量”。选择感兴趣的特定测量参数。对于钙瞬变测量，使用“平均灰度值”选项。
5. 使用圆形轨迹工具开始勾画感兴趣区域（ROI），并在 ROI 管理器窗口中为每个 ROI 点击“添加”。当所有感兴趣的细胞均被勾画后，在 ROI 管理器窗口中选择“更多”标签下的“多测量”。请记住将测量结果直接保存，或将所有测量数据复制粘贴至电子表格中。
6. 打开来自 Fiji 的 *.txt 文件或 Excel 电子表格，并将数据转移至新的 Origin 工作表中。注意：也可使用 Sigma Plot 或 Prism 等其他软件进行进一步分析。
7. 在 Origin 程序中，使用“绘图 → 线条+符号”菜单查看所有瞬变反应的总体情况。取消选择无反应的细胞。
8. 将轨迹编号重新计算为时间尺度（X 轴），使用“列 → 设置列值”功能，将轨迹编号列乘以图像采集频率（本例中为 1.1 s）。
9. 对所有选定的记录使用“分析 → 行统计”功能，计算均值（Y 轴）和标准误差轨迹。使用“绘图 → 线条+符号”绘制该组细胞的最终图形。
10. 平均钙瞬变的计算方法如下：
    1. 在 Origin 程序中计算总钙释放量时，点击“图形”，然后使用菜单“分析 → 微积分 → 积分”。曲线下面积的总积分值将显示在结果日志中。
    2. 对于瞬变动力学， 点击“图形”，然后使用菜单：分析 → 非线性曲线拟合 → 选择数据集（选择从峰值到瞬变反应结束的 X 轴范围）。开始拟合 → 选择函数 → 指数衰减1 → 完成。
       注意：指数拟合结果将显示在图形窗口和结果日志中。所得数据（数值）代表释放的总钙量以及介导瞬变反应的通道的动力学特征。

结果

为了准确评估钙离子在血管生理学（血管舒张和血管收缩）中的作用，设计了一种将钙离子荧光染料加载到离体完整主动脉的内皮细胞和血管平滑肌细胞中的实验方案。如图1所示的一般实验装置，展示了成像前血管的分离与制备基本策略。简言之，在从大鼠分离出主动脉后，应清除其周围的脂肪和结缔组织，并沿纵轴切开。随后将打开的主动脉置于铝箔包裹的500 µl离心管中，管内含有按照本方案预先配制的染料加载混合液，在室温下轻轻振荡孵育1小时。孵育结束后，需清洗主动脉，将其外膜朝下、管腔向上固定在覆有硅胶的培养板上，然后转移至直立式双光子显微镜进行成像。

当主动脉放置在显微镜下且血管处于焦点位置时，内皮细胞因其强烈的荧光发射而易于识别（图2A）。由于血管腔主要由内皮细胞构成，在固定血管时应使其朝上，因此内皮细胞通常是首先进入焦点的结构。除了成像内皮细胞外，某些位置还可观察到平滑肌细胞（图2B）。因此，在同一成像视野中可同时识别内皮细胞和平滑肌细胞（图2C）。能够在同一视野中对这两种...

讨论

实验概述。为了更好地理解钙离子和一氧化氮（NO）在血管生理学中的作用，我们开发了一种新方法，用于测量离体完整主动脉中平滑肌细胞和内皮细胞内的[Ca²⁺]_i和NO水平。该实验方案主要包括以下关键步骤：1）血管的机械性分离与制备（非酶消化法）。为获得最佳的生理记录结果，尽可能保持组织健康和完整至关重要。2）使用Pluronic酸将组织与钙离子标记染料或NO标记染料共同孵育是关键步骤；然而，对于其他某些类型的血管，可能需要测试不同的Pluronic酸种类及孵育时间。3）将主动脉正确固定在带网格和固定针的硅胶包被培养皿上，可在双光子显微镜成像过程中提供稳定的视野。由于血管会发生收缩和舒张，因此必须确保血管被妥善固定，以避免产生运动伪影。4）结果的定量分析。请注意，瞬时反应的幅度并不总是比较细胞生理特性的最佳参数。瞬时反应的积分值可能更能反映细胞内总[Ca²⁺]_i或NO释放量的差异。

当实验操作正确时，可以监测 [Ca²⁺]_i （或一氧化氮水平...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DAF-FM	Life Technologies	D-23842
Fluo-4 AM	Life Technologies	F14217	500 µl 溶于 DMSO
Pluronic F-68 溶液	Sigma-Aldrich	P5556
L-NAME	Tocris	0665
Olympus 直立显微镜	Olympus	Fluoview FV1000
MaiTai HP DeepSee-OL	Spectra Physics		Ti:蓝宝石激光器，波长范围 690 nm — 1040 nm
滤光片	Olympus	FV10-MRL/R	495 至 540 nm
25× 水浸物镜	Olympus	XLPL25XWMP	数值孔径 1.05，工作距离 2 mm
切片固定网格	Warner Instrument	SHD-27LH
其他基础试剂	Sigma-Aldrich