攀登缺陷的神经退行性疾病的果蝇模型定量分析

摘要

我们在黑腹果蝇中提出了一种优化的廉价且可靠的负向性测定法，作为神经退行性疾病的模型。该检测对轻度运动缺陷更敏感，将有助于筛选潜在的遗传相互作用和药物靶点。

摘要

从神经变性疾病造成机车的缺陷可以是疾病的晚期发作症状，随后的几年亚临床变性的，因此目前的治疗策略是不能治愈。通过使用全基因组测序的，越来越多的基因已被确定，以在人类运动的作用。尽管确定这些基因中，它是不知道这些基因如何是至关重要的正常机车运作。因此，可靠的测定法，其利用模式生物以阐明，以便确定治疗性利益的新靶标，这些基因的作用，需要比以往更。我们设计了负趋地性测定在先允许对较温和的缺陷的检测，并具有随着时间的推移，以评估这些缺陷的能力的致敏版本。在玻璃进行测定量筒中，被密封与蜡阻挡膜。通过提高门槛的距离要攀升至17.5Ç米和增加实验的持续时间为2分钟，我们观察到在检测温和流动性功能障碍更大的灵敏度。该测定是成本有效的，不需要大量的训练，以获得高度可重复的结果。这使得它一个很好的技术来筛选候选药物在果蝇突变体运动缺陷。

引言

破坏性神经变性疾病如帕金森氏病，肌萎缩性侧索硬化，和遗传性痉挛性截瘫日益认识到。不幸的是，大多数这些神经变性疾病的仍然没有治疗方法。的广泛临床应用的全基因组，无偏基因测试，如全基因组测序已导致了越来越多的基因受到牵连在人类运动障碍。尽管这样的进步，从早期到晚期的病理进展，仍然难以在这些疾病。 果蝇提供一个具有遗传工具来研究基因在需求控制的空间和时间的方式。此外， 果蝇已经证明在筛选药物对神经系统疾病，如帕金森氏^1，阿尔茨海默^2，智力障碍^3,4-和癫痫^5,6-等等是有用的。我们的目标是建立一个符合成本效益可靠的检测，将允许高通量分析，将仍然非常敏感，可以检测电机性能的微小变化。

有用于量化对果蝇攀登行为的基因突变和/或环境条件的影响几个实验。大多数的测定的利用苍蝇爬，称为负趋地性，或攀登测定的自然趋势。本泽⁷在1967年提出，用于趋光性的研究逆流装置也可以用来研究gravitaxis。自那时以来，Ganetsky ⁸和许多其他^{9 -12}已经建立在初始测定。其原理是放置在小瓶中的苍蝇的已知数量和强烈挖掘小瓶在硬表面上，造成苍蝇下降到小瓶的底部。因为它是一个先天行为，苍蝇将试图攀爬到小瓶的顶部，相对的重力。该测定是定量的测量仪表水库有多少苍蝇在一个规定的时间段过去攀上小瓶标记。速度，而不是对苍蝇攀登总数的测量已成为一个可靠的参数和的情况下的苍蝇准则的数目并不显著¹³中所示的缺陷。

攀登测定在许多神经变性疾病，包括帕金森氏病¹⁴的研究证明是有益的。然而，我们注意到，机车的缺陷未必在时间被检测到，其中神经变性是已经看到在病理研究^14。因此，使用传统的测定法的可能限制，研究疾病发病的早期阶段的能力。机车缺陷在以后的病理阶段的出现可能反映了其疾病进展是太先进完整的救援。

这就提出了与传统的攀登测定的灵敏度的潜在问题。的俗的电位不能tional爬坡法检测温和机车缺陷可以归因于向其中的苍蝇都需要攀登高度。传统的试验^15,16措施蝇的数目，成功地翻越2至5厘米的高度在10至20秒。

方案

研究果蝇在遵守阿尔伯塔省的研究准则大学。

1.收集飞行

1. 收集20苍蝇使用CO _2（克）麻醉并置于含有食品25毫米×95毫米收集瓶中。
2. 含蝇水平商店小瓶，以避免在那些在底部积聚小瓶任何液体捕集苍蝇。
3. 在22℃在培养箱中孵育苍蝇为至少21小时，在45％的湿度下约15小时。以12小时光照设置孵化器:黑暗周期。

2.登山分析

1. 第二天早上，转移20苍蝇从单一到小瓶250毫升的玻璃量筒。标记滚筒的位置，以保持它恒定日常生活。使用每个基因型一层玻璃圆筒，以防止基因型之间的交叉污染。在每个实验和RO的清洗结束基因型之间优化射孔他们。
   1. 进行中的环境光的实验（或红光是否有视力潜在缺陷）在温度和湿度为22℃和40％分别。为了避免昼夜节律惊慌失措，总是在每天的同一时间进行实验。
2. 密封圆筒的顶部用阻挡膜（蜡膜），以防止任何苍蝇的逃逸（ 图2）。
3. 设置在三脚架上的摄像机。在190毫升线的250毫升对焦摄像头量筒（17.5厘米）。
4. 计数死蝇数在圆筒的底部，并在食品小瓶中。记录该号码作为死亡率。
5. 很轻多次敲击对闭孔泡沫垫气缸以足够的力量以置换苍蝇的内底表面。轻按5 - 10倍，而用另一只手按在相机上记录。
6. 按相机上的"录制"按钮。
7. 启动VIDEO相机记录和挖掘缸六次在不同的非节奏模式。
8. 进行每次试验用于从苍蝇最后抽头的时间2分钟，并记录蝇渡17.5厘米（190毫升）中选择每个时间点（量化每10秒）的高度的数量。注意:毫升标记在缸体会有所不同，从一个气缸模型到另一个视直径。为了避免错误，测量所用每个气缸的高度。
9. 一旦审判已经结束，处理苍蝇在95％乙醇。
10. 重复步骤2.1至2.9，直到所有的重复每次都过测试，新鲜苍蝇。
    注:虽然5次重复可能足以与具有运动有很强的影响的突变，20蝇（200苍蝇）的10次生物学重复，建议检测更小的差异。
11. 在实验完成后，洗气瓶在实验室洗碗机和干燥O / N被重新使用。

3.分析

1. ANALY每个视频泽飞试验。每10秒，记录果蝇通过目标线的总数。
   1. 如果一只苍蝇爬上回落或下降，飞为-1和记录算下飞行越过目标线为相同数量的攀升是回落或下降飞。例如，如果在15 ^日飞落在目标线下方，下一飞越线（16 ^日飞）被认为是15 ^日飞，而不是16 ^个 。
2. 从苍蝇（20）的总人数减去死亡获得苍蝇停留在试验的数量。在每个时间点，获得蝇目标线以上的分数。
3. 绘制每个百分比在每个时间点（参见图3）。
4. 在120秒的数据点进行分析的性能和执行学生t检验时2基团存在或ANOVA和一个检测后多重比较（和Bonferroni修改为计划和Tukey计划外协mparisons）。柯尔莫哥洛夫-斯米尔诺夫测试¹⁷也进行确定正态性和方差相等，但也给突变组的分布比较控制。
5. 呈现的数据过时效，画出蝇的百分比在120秒苍蝇不同年龄的攀爬（2天，1周，2周），以查看是否有一个渐进赤字（ 图4）。

结果

攀岩是一个强大的和可重复的行为。事实上，有一天老野生型果蝇达到目标的距离爬坡性能迅速（25 - 30秒）。突变果蝇呈现范围从轻微（或延迟）的性能来完成无力攀登到目标。我们说明这个这里有两个不同的突变等位基因。第一个是由一个完全缺失的spastin基因（温泉^5.75）18的基因spastin的一个严重的等位基因。在这条线^（5.75温泉与TM6b）一天的小苍蝇甚至2分钟后达不到WT爬坡性能。这种突变线介绍与使用小瓶方法（ 图1A，B），甚至当严重的缺陷。对于相同的基因，但与由同组（温泉^17-7与^TM3）18公布的不完全缺失研究的突变体，当这里提供的方法的优点变得更加明显。在这种情况下，性能达8天是正常的（ 图1C-F 图3）或遗传相互作用的结果。为了进一步证明，包括行为与表现型野生型蛋白的研究基因表达的救援。对于相互作用的研究，比较苍蝇是杂合的利息苍蝇，只有有兴趣一个突变的突变两种。该测定法还允许一个监视的攀登缺陷的进展随时间，在造型渐进运动障碍（ 图4）

讨论

果蝇已经被证明是在帕金森氏病¹⁴和其他神经变性病症^1,2-极好模型。除了 ​​在果蝇中可用的遗传工具，其基因组中是高度保守的对参与神经障碍¹⁹基因。全基因组基因筛查方法（包括全外显子组测序）的出现很可能继续提供与人类运动障碍相关的候选基因较大名单。的治疗这些疾病的发展将需要的动物模型，以增加我们涉及神经变性的早期阶段的病理学的理解。使用果蝇和负趋地性测定提供了一种廉价和可靠的方法来鉴定参与机车缺陷基因，并随后筛选表型救援候选药物。这增加了分子，电，和成像样张吨帽也可以在相同的动物模型中获得。使用登山法，其他人复制成功在果蝇突变电机缺陷的基因破坏人类运动。然而，先前的研究已经表明，病理变化可以通过数天¹⁴先于机车的缺陷的检测。这种现象也观察到在我们讲的亚临床改变人类的神经退行性疾病。我们相信，通过了解并处理这些变化的亚临床，疾病的修改将大大提高。

我们在座的一种模式，允许轻微运动的缺陷，可能有助于理解从"症状前对症"利用果蝇...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
果蝇库存			根据实验选择库存。房间和培养箱内的温度和湿度必须得到控制并保持一致，以避免苍蝇太静电或太湿。
摄像机			任何数码摄像机都可以。确保他们可以专注于近处的物体。
量筒	Kimble	20028W	不同型号的量筒可能有不同的直径。因此，测量高度是必要的。
计算机			任何型号都可以。我们用电脑监测苍蝇的攀爬情况，记录每个时间点的苍蝇数量。