神经退行性疾病果蝇模型中攀爬缺陷的定量分析

摘要

我们提出了一种优化的、低成本且可靠的黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）负向趋地性实验方法，可作为神经退行性疾病的模型。由于该方法对轻微运动缺陷更为敏感，因此有助于筛选潜在的基因相互作用和药物靶点。

摘要

由神经退行性疾病引起的运动功能障碍可能在多年亚临床期退化后才出现，属于疾病的晚期症状，因此目前的治疗方法尚无法实现治愈。通过全外显子组测序技术，越来越多被发现与人类运动功能相关的基因已被鉴定出来。然而，这些基因在正常运动功能中所起的关键作用仍不清楚。因此，比以往任何时候都更需要一种可靠的检测方法，利用模式生物来阐明这些基因的功能，从而发现具有治疗潜力的新靶点。我们设计了一种敏感性增强的负向趋地性检测方法，能够更早地检测出较轻微的运动缺陷，并可随时间推移对这些缺陷进行动态评估。该检测在玻璃量筒中进行，量筒顶部用石蜡封口膜密封。通过将需要攀爬的阈值距离提高至17.5 cm，并将实验时长延长至2分钟 ，我们观察到该方法在检测轻度运动功能障碍方面具有更高的敏感性。该方法成本低廉，且无需 extensive 培训即可获得高度可重复的结果，因此非常适用于在具有运动缺陷的Drosophila突变体中筛选候选药物。

引言

帕金森病、肌萎缩侧索硬化症和遗传性痉挛性截瘫等破坏性神经退行性疾病正日益受到关注。遗憾的是，目前大多数神经退行性疾病仍缺乏有效治疗手段。全外显子组测序等全基因组范围、无偏倚的遗传检测在临床上的广泛应用，已导致越来越多与人类运动障碍相关的基因被发现。尽管取得了这些进展，这些疾病从早期到晚期的病理进展过程仍然不甚明确。Drosophila 提供了可在受控的空间和时间条件下研究基因功能需求的遗传学工具。此外，Drosophila 已被证实可用于帕金森病¹、阿尔茨海默病²、智力障碍^3,4 和癫痫^5,6 等神经系统疾病的药物筛选。我们的目标是开发一种经济高效且可靠的检测方法，能够实现高通量分析，同时仍具备足够的灵敏度以检测运动功能的微小变化。

有多种检测方法可用于量化基因突变和/或环境条件对黑腹果蝇（Drosophila）攀爬行为的影响。大多数检测方法利用了果蝇天生向上攀爬的习性，即负向地性，也称为攀爬实验。Benzer⁷于1967年提出，用于研究趋光性的对流装置也可用于研究趋重性。此后，Ganetsky⁸及许多其他研究者^9-12在此基础上进一步发展了该检测方法。其原理是将已知数量的果蝇放入一个试管中，用力将试管敲击坚硬表面，使果蝇全部跌落至试管底部。由于向上攀爬是一种本能行为，果蝇会试图逆着重力方向向试管顶部爬升。该实验具有定量性，通过测量在规定时间内有多少果蝇爬过试管上的标记线来进行评估。相比仅统计攀爬果蝇的总数，测量攀爬速度已成为一种更可靠的参数，并在果蝇数量差异不显著的情况下仍能检测出行为缺陷¹³。

爬行实验已被证明在研究多种神经退行性疾病（包括帕金森病¹⁴）中具有重要价值。然而，我们注意到，在病理学研究中已可观察到神经退行性病变时，运动功能缺陷可能尚无法被检测到¹⁴。因此，使用传统实验方法可能限制了对疾病发病早期阶段的研究能力。在病理进展的后期才出现的运动功能缺陷，可能反映疾病已进展至难以完全挽救的阶段。

这引发了关于传统攀爬实验敏感性的一个潜在问题。传统攀爬实验可能无法检测到轻微的运动缺陷，其原因在于实验要求果蝇攀爬的高度。传统实验方法^15,16通过测量果蝇在10至20秒内成功攀爬超过2至5 cm高度的数量来进行评估。

方案

关于黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）的研究符合阿尔伯塔大学的研究准则。

1. 果蝇采集

1. 用 CO₂ 收集 20 只果蝇_{2 (g)} 麻醉后置于含有食物的25 mm × 95 mm收集管中。
2. 将装有果蝇的试剂瓶水平放置，以避免果蝇被困在可能积聚于瓶底的液体中。
3. 将果蝇孵育至少21小时 在22 °C、45%湿度的培养箱中孵育约15小时。将培养箱设置为12小时 光照：黑暗周期

2. 攀爬实验

1. 次日早晨，从一个试剂管中转移20只果蝇至一个250 ml的玻璃量筒中。标记量筒的位置，以确保每天保持一致。每种基因型使用单独的玻璃量筒，以防止不同基因型之间的交叉污染。每次实验结束后清洗量筒，并在不同基因型之间轮换使用。
   1. 在环境光（如果存在视觉缺陷的可能，则使用红光）条件下进行实验，温度和湿度分别为22 °C和40%。为避免昼夜节律的干扰，实验应在每天的同一时间进行。
2. 用屏障膜（石蜡膜）密封量筒顶部，防止果蝇逃逸（图2）。
3. 将摄像机架设在三脚架上。将摄像机对焦于250 ml量筒的190 ml刻度线处（高度为17.5 cm）。
4. 统计量筒底部和食物管中死亡果蝇的数量，并将该数值记录为死亡率。
5. 用手反复轻敲量筒底部，敲击在闭孔泡沫垫上，力度应足以使果蝇移动至量筒内壁底部。敲击5–10次，同时用另一只手按下摄像机的录制按钮。
6. 按下摄像机上的“录制”按钮。
7. 启动摄像机录像，并以明显且非节律性的模式敲击量筒六次。
8. 每次试验从最后一次敲击果蝇开始计时，持续2分钟，记录在每个选定时间点（每10秒量化一次）越过17.5 cm高度（190 ml）的果蝇数量。注意：量筒上的毫升刻度会因不同型号的量筒直径不同而有所差异。为避免误差，应测量所用每个量筒的实际高度。
9. 试验结束后，将果蝇弃置于95%乙醇中处理。
10. 重复步骤2.1至2.9，直至所有重复组均完成测试，每次均使用新鲜果蝇。
    注意：尽管对于对运动能力有显著影响的突变，5次重复可能已足够，但建议进行10次生物学重复，每次20只果蝇（共200只），以检测较小的差异。
11. 实验结束后，将量筒放入实验室洗碗机中清洗，并过夜干燥，以便重复使用。

3. 分析

1. 分析每只果蝇实验的视频。每隔 10 秒，记录通过目标线的果蝇总数。
   1. 如果某只果蝇爬回下方或掉落，将该果蝇记为 -1，并将下一只通过目标线的果蝇计数为与爬回或掉落的果蝇相同的编号。例如，如果第 15^只果蝇掉落到目标线下方，则下一只通过该线的果蝇（原第 16^只）应视为第 15^只果蝇，而非第 16^只。
2. 从果蝇总数（20 只）中减去死亡果蝇数，得到仍参与实验的果蝇数量。在每个时间点，计算位于目标线上方的果蝇所占比例。
3. 在每个时间点绘制对应的百分比（见 图 3）。
4. 分析 120 秒时间点的表现数据，当存在两组时进行学生 t 检验，多组时则进行方差分析（ANOVA）及多重比较的后续检验（计划性比较采用 Bonferroni 校正，非计划性比较采用 Tukey 法）。同时进行 Kolmogorov-Smirnov 检验¹⁷，以评估数据正态性与方差齐性，并比较突变组与对照组的分布差异。
5. 为展示随衰老变化的数据，绘制不同日龄（2 天、1 周、2 周）果蝇在 120 秒时爬行百分比的图表，以观察是否存在进行性功能缺陷（图 4）。

结果

攀爬是一种强烈且可重复的行为。事实上，出生一天的野生型果蝇能够迅速达到目标攀爬距离（25 - 30 秒）。突变型果蝇的表现则从轻微（或延迟）到完全无法攀爬至目标位置不等。本文以两个不同的突变等位基因为例进行说明。第一个是spastin基因的严重等位基因，由spastin基因的完全缺失引起（spas^5.75）¹⁸。在此品系（spas^5.75 与 TM6b）中，出生一天的果蝇即使经过2分钟也无法达到野生型的攀爬表现。该突变品系即使使用试管法也表现出严重的缺陷（图1A, B）。本文所介绍方法的优势在研究同一基因的另一突变体时更为明显，该突变体为同一研究组报道的部分缺失突变（spas^17-7 与 TM3）¹⁸。在此情况下，果蝇在8日龄之前的表现正常（图1C-F）。在8日龄时，这些果蝇在圆柱法中表现出轻微但显著的攀爬缺陷，而在相同重复次数的试管法中则未检测到缺陷。这可能表明，使用更大的目标距离有助于检测较轻度突变体中的缺陷。选择遗传背景匹配的对照可确保观察到的效应源于转基...

讨论

Drosophila 已被证实是研究帕金森病¹⁴及其他神经退行性疾病^1,2的优秀模型。除了在 Drosophila 中可用的遗传工具外，其基因组中与神经系统疾病相关的基因具有高度保守性¹⁹。全基因组遗传筛选技术（包括全外显子组测序）的发展有望持续提供更多与人类运动障碍相关的候选基因。针对这些疾病的治疗开发需要借助动物模型，以加深我们对神经退行早期病理过程的理解。利用 Drosophila 及负向趋地性实验，可提供一种经济且可靠的方法，用于鉴定与运动功能缺陷相关的基因，并进一步筛选可挽救表型的候选药物。这还可结合在同一动物模型中获得的分子、电生理和成像证据。已有研究通过攀爬实验成功再现了运动基因突变导致人类运动障碍的果蝇模型中的运动缺陷。然而，先前的研究表明，病理变化可能早于运动缺陷的检测达数天之久¹⁴。这一现象在人类神经退行性疾病中同样存在，即所谓的亚临床改变。我们认为，通过理解并干预这些亚临床改变，将极大改善对疾病的修饰治疗效果。

我们在此...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
果蝇品系			根据实验需求选择果蝇品系。必须控制并保持室内和培养箱中的温度与湿度一致，以避免果蝇过于干燥或过于潮湿。
摄像机			任何数码摄像机均可使用，但需确保其能够对近处物体对焦。
量筒	Kimble	20028W	不同型号的量筒直径可能不同，因此测量其高度至关重要。
计算机			任何型号均可。我们使用计算机来监测果蝇的攀爬行为，并记录每个时间点果蝇的数量。